第10章蛋白质和氨基酸的测定课件.ppt

主要内容,第十章 蛋白质和氨基酸的测定,第一节 概述(理解)第二节 蛋白的定性测定 一、蛋白质的一般显色反应（理解） 二、复合蛋白质的显色反应（理解）第三节 蛋白质的定量测定 一、凯氏定氮法（掌握） 二、其他测定方法（理解）第四节 氨基酸的定性测定（了解）第五节 氨基酸的定量测定 一、 氨基酸的一般定量测定（理解） 二、 个别氨基酸的定量测定（自学，理解）,第一节 概述一、蛋白质的作用1、蛋白质是生命的物质基础：是构成细胞的组成成分2、担当重要的生理功能：是生物体发育及修补组织时所需氨基酸的来源，物质代谢的生物催化剂，营养物质及气体的运输遗传信息的传递与表达人体内的组质液pH（健康pH在7.37.5之间）及水分的平衡为免疫系统制造对抗细菌和感染的抗体；,1、蛋白质的组成: 蛋白质由很多的AA单体以肽键结合而成的具有一定空间结构的含氮有机化合物，有的含有P、S、 Cu、Fe、I等元素，分子量高达数万数百万。含氮是蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。2、蛋白质系数：一般而言，蛋白质含氮量约为16%，即1份氮相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。 3、氨基酸的种类:自然界中已经发现的氨基酸约有170多种，其中组成蛋白的氨基酸只有22种（都是-AA），其中对人而言的必需氨基酸有8种（犬的必需氨基酸有9种）。4、组成蛋白的氨基酸（-AA）的通式及AA两性电解质特性：,二、蛋白质的组成及特性,必需氨基酸：在组成蛋白的氨基酸中，在人体内不能合成或合成速度很慢的氨基酸。 人类而言,优质蛋白质的定义:l蛋白质中必需氨基酸的含量高,且总体氨基酸的组成比例接近母乳蛋白氨基酸比例的蛋白质。动物来源和豆类食品是很好的优质蛋白质。,若蛋白质或某些必需氨基酸供给不足： l 会导生物体生长发育缓慢，体重减轻，抵抗力下降，容易患病；l 男性精液品质下降，精子数量减少；l 女性引起不孕，即使怀孕，胎儿也常发育不良而发生死胎或畸胎。 开发蛋白质的生理效价高的食品及合理配膳等 是食品科学从业者的一项重要任务！,谷类和面食： （%）大米（糙米、长粒、生） 7.9大米（白米、长粒、生） 7.1小麦粉（整粒） 13.7玉米粉（整粒、黄色） 6.9玉米淀粉 0.3豆类：大豆（成熟的种子、生） 36.5豆（腰子状、所有品种） 23.6豆腐（生、普通） 8.1水果和蔬菜：苹果（生、带皮） 0.2芦笋（生） 2.3草莓（生） 0.6莴苣（冰、生） 1.0,肉、家禽、鱼：牛肉（颈肉、烤前腿） 18.5牛肉（腌制、干牛肉） 29.1鸡（可供煎炸的鸡胸肉、生） 23.1火腿（切片、普通的） 17.6鸡蛋（生、全蛋） 12.5鱼（太平洋鳕鱼、生） 17.9鱼（罐装金枪鱼滴干的固体） 26.5乳制品：牛乳（全脂、液体） 3.3牛乳（脱脂、干） 36.2干酪 24.9酸奶（普通的、低脂） 5.3,三、部分食品的蛋白质含量,四、常用的蛋白质和氨基酸的测定方法 凯氏定氮法 双缩脲法、染料结合法、酚试剂法 近红外光谱快速定量方法 氨基酸总量的测定 本章重点： 凯氏定氮法的原理及注意事项，双缩脲法、印三酮法及氨基酸自动 分析仪的原理及注意事项，动物实验法，氨基酸总量的测定。,第二节 蛋白质的定性测定,一、蛋白质的一般显色法,1氨基黑法,氨基黑10B 是酸性染料，其磺基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。,（1）经点样后的层析纸经电泳或层析后，浸入氨基黑10B 醋酸甲醇溶液（13g 氨基黑10B 溶解于100mL 冰醋酸和900mL 甲醇中，充分摇匀，放置过夜，过滤后可反复使用几次）中，染色10min，染色后，用10%醋酸甲醇溶液洗涤约57 次，待背景变成浅蓝色后干燥。若欲进行洗脱，用0.1mol/L 氢氧化钠浸泡30min，于595nm 比色测定。,（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色：用甲醇固定后，在含1%氨基黑10B 0.1mol/L 氢氧化 钠溶液中染色5min(室温)，用5%乙醇洗脱背景底色。或用7%醋酸固定后，于96水浴中 用7%醋酸（含0.51%氨基黑10B）染色10min,7%醋酸洗脱背景底色。用氨基黑10B 染SDS-蛋白质时效果不好。如果凝胶中含有兼性离子载体，先用10%三氯醋酸浸泡，每隔2h换液一次，约10 次，再进行染色。,（3）凝胶薄层的直接染色：将凝胶薄层放在一定湿度的烘箱内逐步干燥（50），没有调温调湿箱时用一张滤纸放于烘箱内，以保持一定的湿度。将干燥的薄层板于漂洗液（750mL 甲醇，200mL 水，50mL 冰醋酸）中预处理10min，然后在染色液（750mL 甲醇，200mL水，50mL 冰醋酸，在此溶液中加氨基黑10B 饱和）中染色5h,再在漂洗液内洗涤。,本法优点是灵敏度较高，缺点是花费时间长，不同蛋白质染色强度不同。,2溴酚蓝法,此法缺点是灵敏度低，某些摩尔质量低的蛋白质可能染不上颜色。,3考马斯亮蓝法考马斯亮蓝R250,考马斯亮蓝法 (Stain with Coomassie blue)：考马斯亮蓝法灵敏度比氨基黑高五倍，尤其适用于SDS电泳的微量蛋白质的染色。在549nm有最大吸收值，蛋白质在110g呈线性关系。可以检测出0.1 ug 的蛋白质条带.,（1）经电泳后滤纸或醋酸纤维膜在200g/L 磺基水杨酸溶液中浸1min，取出后放入2.5g/L 考马斯亮蓝R250 染色液（配制用的蒸馏水内不含有重金属离子）浸5min，在蒸馏水或7%醋酸中洗四次，每次5min，于90放置15min。,（2）聚丙烯酰胺凝胶也可同上处理。在酸性醇溶液中，考马斯亮蓝-兼性离子载体络合物溶解度显著增大，因此能免去清除兼性离子载体的步骤。可运用下列方法之一：凝胶用 10%三氯醋酸固定，在10%三氯醋酸-1%考马斯亮蓝R250（191）中室温染色0.5h，用10%三氯醋酸脱底色。,凝胶浸入预热至 60的0.1%考马斯亮蓝固定染色液（150g 三氯醋酸，45g 磺基水杨酸溶于375mL 甲醇和930mL 蒸馏水的混合液。每1g 考马斯亮蓝R250 溶于此混合液1000mL中）中约30min，用酸性乙醇漂洗液（乙醇+水+冰醋酸=25+25+8）洗尽背景颜色。染色后凝胶保存于酸性乙醇漂洗液中。本法灵敏度：卵清蛋白0.03g，血清清蛋白0.02g，血红蛋0.01g。,凝胶浸入考马斯亮蓝固定染色液（2g 考马斯亮蓝R250，溶于100mL 蒸馏水中，加2mol/L硫酸100mL，过滤除去沉淀，向清液中滴加10mol/L KOH 至颜色从绿变蓝为止。量体积，每100mL 加入三氯醋酸12g）中1h，然后用蒸馏水洗净背景颜色或在0.2%H2SO4 溶液中浸泡片刻脱除背景颜色。染色后的凝胶保存于蒸馏水中。本法机制未明，起染色作用的可能不是考马斯亮蓝本身，灵敏度不如上法。,4酸性品红法经电泳后滤纸置于 0.2%酸性品红溶液中（2g 酸性品红溶解于500mL 甲醇，400mL 蒸馏水和100mL 冰醋酸中）加热染色15min；取出后浸入醋酸甲醇溶液（500mL 甲醇，加400mL蒸馏水和100mL 冰醋酸）15min；然后浸入10%醋酸溶液，每次20min，至背景无色为止。若欲进行比色，可用0.1 mol/L NaOH 溶液浸泡2h，在波长为570nm 处比色。,5氨基萘酚磺酸法聚丙烯酰胺凝胶电泳后，把凝胶暴露于空气中几分钟，或在 2mol/L HCl 中浸一下使表层蛋白变性，再在0.003%氨基萘酚磺酸的0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）中染3min，在紫外光下可显黄绿色荧光。这样的染色可保留凝胶内部的酶和抗体的活性。如不需保留活性时，可先在3mol/L HCl 中浸2min 以上使蛋白质充分变性，再染色。,二、复合蛋白质的显色反应,1糖蛋白的显色(1)过碘酸-Schiff 氏试剂显色法：试剂过碘酸液：1.2g 过碘酸溶解于30mL 蒸馏水中，加15mL 0.2mol/L 醋酸钠溶液及100mL乙醇。临用前配制，或保存在棕色瓶中，可用数日。,还原液：5g 碘化钾，5g 硫代硫酸钠溶100mL 蒸馏水中，加150mL95%乙醇及2.5mL 2mol/LHCl 。现配现用。亚硫酸品红液：2g 碱性品红溶解于400mL 沸水中，冷却至50过滤。在滤液中加入10mL 2mol/L 盐酸和4g 偏亚硫酸钾（K2S2O5），将瓶塞紧放在冰箱中过夜，加1g 活性炭，过滤，再逐渐加入2mol/L 盐酸，直至此溶液在玻片上干后不变红色为止，保存在棕色瓶中，冰箱贮存，当溶液变红时不可以再用。,亚硫酸盐冲洗液： 1mL 浓硫酸，0.4g 偏亚硫酸钾加入到100mL 水中。显色步骤 将含有样品的滤纸浸在 70%乙醇中，片刻后吹干，在高碘酸液中浸5min，用70%乙醇洗一次，在还原液中浸58min，再用70%乙醇洗一次，在亚硫酸品红液中浸2425min, 用亚硫酸盐冲洗液洗三次，并用乙醇脱水后，放在玻璃板上吹干。显色结果：在黑灰色的底 板上呈现紫红色。,（2）甲苯胺蓝（Toluidine blue）显色法： 试剂 试剂甲：1.2g 过碘酸溶解在30mL 蒸馏水中，加15mL 0.5mol/L 醋酸钠和100mL 96%乙醇。现配现用。 试剂乙：100mL 甲醇加20mL 冰醋酸及80mL 蒸馏水。 试剂丙：溴水。试剂 试剂丁：10g/L 甲苯胺蓝水溶液。 试剂戊：40g/L 钼酸铵溶液。,显色步骤:将点有样品的滤纸依次在试剂甲中浸 15min，试剂丙中浸15min，用自来水漂洗，再在试剂丁中浸30min，自来水中漂洗至没有蓝色染料渗出（约3040min）后，再依次在试剂戊中浸3min，试剂乙中浸15min，丙酮中浸2min 后在空气中干燥。显色结果：糖蛋白部分染成蓝色，背景带有红紫色。,（3）阿尔新蓝（Alcian blue ）显色法：聚丙烯酰胺凝胶在 12.5%三氯醋酸中固定30min 后，再用蒸馏水轻轻漂洗。放入1%过碘酸液（在3%醋酸中）中氧化50min。用蒸馏水反复洗涤去除多余的过碘酸盐。再放入0.5%偏重亚硫酸钾中还原剩余的过碘酸盐30min，再用蒸馏水洗涤。浸在0.5%阿尔新蓝（在3%醋酸中）溶液中染4h。,2脂蛋白的显色（1）苏丹黑（Sudan black）显色法： 将 0.1g 苏丹黑B 溶解于煮沸的100mL 60%的乙醇溶液中，制备成饱和溶液，冷却后过滤两次，备用。显色时将点有样品的滤纸浸于上述溶液中，3h 后取出，用50%乙醇溶液洗涤两次，每次15min，空气中干燥。 聚丙烯酰胺凝胶电泳中预染法：加苏丹黑B 到无水乙醇中成饱和液，并震摇使乙酰化。用前过滤。按样品液的1/10 量加入样品液中染色1h 或4过夜。染色后的样品再进行电泳。,（2）油红-O（Oil red O）显色法： 0.04g 油红溶解于100mL60%的乙醇中，30放置过夜（16h）使充分饱和后，在30下滤去多余的染料，澄清液即可用于染色。将滤纸浸入染料液中，在30下染色18h 后，用水冲洗，使背景变浅，在空气中干燥。脂蛋白为红色，背景为桃红色。本法在30以下显色时，会引起染料沉淀。,第三节 蛋白质的定量测定一、凯氏定氮法（一）常量凯氏定氮法1、原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而部分硫酸被还原成二氧化硫，样品中的有机氮转化为氨与过量的硫酸结合成硫酸铵; 然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用弱酸硼酸吸收后再以标准强酸如盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。,催化剂煮沸,（1）、消化：NCOC + 浓H2SO4 （NH4）2SO4 + CO2 + SO2 + H2O （2）、氨化： 2NaOH +（NH4）2SO4 2NH3+Na2SO4 + 2H2O （3）、吸收: 2NH3 + 4H3BO3 （NH4）2B4O7 + 5H2O （4）、滴定：（NH4）2B4O7 + 5H2O + 2HCl 2NH4Cl + 4H3BO3 (注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds ),凯氏定氮法原理（方程式）,2、结果计算,凯氏定氮法操作方法,a消化装置,1、硫酸钾 及硫酸铜的作用2、火候控制3、装置的气密性4、何时加碱5、难消化的 对策6、停止蒸馏,b蒸馏吸收装置,操作方法,继续微沸30min,冷却定容,0.5g Cuso410gk2so4,20mlH2so4,先小火，待内容物全部炭化，泡沫停止，加大火，保持瓶内液体策沸,在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入下列物质：1）硫酸钾 加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物分解。它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度。其反应式如下：K2SO4 + H2SO4 = 2KHSO42KHSO4 = K2SO4 + H2O+ SO3但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失：（NH4）2SO4 NH3+（NH4）HSO4（NH4）HSO4 NH3+ SO3+ H2O2）硫酸铜 硫酸铜起催化剂的作用。硫酸铜的作用机理如下所示：2CuSO4 Cu2SO4 + SO2+ O2,C + 2CuSO4 Cu2SO4 + SO2+ CO2Cu2SO4 + 2H2SO4 2CuSO4 + 2H2O + SO2,溶液呈现清澈的蓝绿色。指示消化到达终点,说明及注意事项当浓硫酸的用量为改变时，硫酸铜，硫酸钾，氢氧化钠等试剂应按比例改变。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物未消化完全而造成氮损失。消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。,样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不停地摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢23mL后再继续加热消化。若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量。,一般消化至呈透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。,硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。11蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1min后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。 12混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。,（二）微量凯氏定氮法1、原理同常量凯氏定氮法。,微量凯氏定氮装置,10ml140%NaoH和少量水,绿色,红色,灰色,2、 说明及注意事项蒸馏前给水蒸汽发生器内装水至2/3 容积处，加甲基橙指示数滴及硫酸数毫升以使其始终保持酸性，这样可以避免水中的氨被蒸出而影响测定结果。20g/L 硼酸吸收液每次用量为25mL，用前加入甲基红-溴甲酚绿混合指示剂2 滴。在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断气，否则将发生倒吸。加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨由此逸出损失。,（三）、自动凯氏定氮法 所谓自动凯氏定氮法，是将常量凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的一套装置，其原理与试剂与常量法相同，操作方法简述如下：,kdn-04b全自动凯氏定氮仪价格,操作方法：（1）称取0.501.00g 样品，置于消化瓶内，加入硫酸铜与硫酸钾制成的片剂两片，加入浓硫酸10mL，将消化瓶置于红外线消化炉中。消化炉分成两组，每行一组共4 个消化炉。消化瓶放入消化炉后，用连接管连接密封住消化瓶，开启抽气装置，开启消化炉的电源，30min 后8 个样品消化完毕，消化液完全澄清并呈绿色。（2）取出消化瓶，移装于自动凯氏定氮仪中，接连开启加水的电钮、加碱电钮、自动蒸馏滴定电钮，开启电源，大约经12min 后由数显装置即可给出样品总氮百分含量，并记录样品总氮百分比。根据样品的种类选择相应的蛋白质换算系数F，即可得出样品中蛋白质含量。（3）开启排废液电钮及加水电钮，排出废液并对消化瓶清洗一次。大约在2h 左右时间内可完成8 个样品的蛋白质含量测定工作。该法具有灵敏、准确、快速及样品用量少等优点。,二、双缩脲法,1原理当脲被小心地加热至 150160时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），反应如下：,双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应：,此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560nm。,2方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。,3操作方法标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg 分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8 支50mL 纳氏比色管中，然后各加入1mL 四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液准确稀释至50mL，振摇10min，静置1h，取上层清液离心5min，取离心分离后的透明液于比色皿中，在560nm 波长下以蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋白质的含量为横坐标，吸光度A 为纵坐标绘制标准曲线。,操作方法,1mlccl4碱性Cuso4,加水至50ml,4结果计算,式中 c由标准曲线上查得的蛋白质质量，mg；m样品质量，g。,5说明及注意事项蛋白质的种类不同，对发色程度影响不大。标准曲线制作完整后，无需每次再作标准曲线。含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去。样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难，此时可预先将蛋白质抽出后再进行测定。,当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。碱性硫酸铜溶液由0.1mol 氢氧化钾、5g 酒石酸钾钠、1.6g 硫酸铜溶于水后加水至1000mL 配成。,三、紫外吸收法,1A280nm 光吸收法（1）原理蛋白质及其降解产物（“月示”、胨、肽和氨基酸）的芳香环残基-NH-CH（R）-CO-在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用。在此波长（280mm）下，光吸收程度与蛋白质浓度（3mgmL）成直线关系，因此，通过测定蛋白质溶液的吸光度，并参照事先用凯氏定氮法测定蛋白质含量的标准样所作的标准曲线，即可求出样品蛋白质含量。,（2）适用范围本法操作简便迅速，常用于生物化学研究工作；但由于许多非蛋白质成分在紫外光区也有吸收作用，加之光散射作用的干扰，故在食品分析领域中的应用并不广泛，最早用于测定牛乳的蛋白质含量，也可用于测定小麦面粉、糕点、豆类、蛋黄及肉制品中的蛋白质含量。,（3）操作方法标准曲线绘制：准确称取样品2.00g，置于50mL 烧杯中，加入0.1mol/L 柠檬酸溶液30mL，不断搅拌10min 使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中，以30005000r/min的速度离心510min，倾出上清液。分别吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL 于10mL 容量瓶中，各加入8mol/L 尿素的氢氧化钠溶液定容至标线，充分振摇2min，若浑浊，再次离心直至透明为止。将透明液置于比色皿中，以8mol/L 尿素的氢氧化钠溶液作参比液，在280nm 波长处测定各溶液的吸光度A。,样品的测定：准确称取试样1.00g，如前处理，吸取的每毫升样品溶液中含有大约38mg 的蛋白质。按标准曲线绘制的操作条件测定其吸光度，从标准曲线中查出蛋白质的含量。,（4）结果计算,式中：c从标准曲线上查得的蛋白质质量，mg；m测定样品溶液所相当于样品的质量，mg。,（7）说明及注意事项测定牛乳样品时的操作手续：准确吸取混合均匀的样品0.2mL于25mL纳氏比色管中，用95%97%的冰醋酸稀释至标线，摇匀，以9597%冰醋酸为参比液，用1cm 比色皿于280nm 处测定吸光度，并用标准曲线法确定样品蛋白质含量（标准曲线以采用凯氏定氮法已测出蛋白质含量的牛乳标准样绘制）。,测定糕点时，应将表皮的颜色去掉。温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在 2030。,2A260nm 和A280nm 比值法（1）原理凡是有共轭双键的物质，均具有紫外吸收值。因此，若样品中含核酸，则嘌呤、嘧啶两类碱基对蛋白质的测定产生干扰，应加以校正。核酸在260nm 处的紫外吸收值大于280nm处的紫外吸收值，但蛋白质恰恰相反。利用这些性质，通过计算可以适当较正核酸对测定蛋白质浓度的干扰。但是，由于不同的蛋白质和核酸对紫外吸收不同，校正后的测定结果还存在一定的误差。,（2）测定取一定量的样品稀释液，分别测出样品的A280nm 和A260nm的值，计算出A280nm/A260nm 的比值后，从下表中查出校正因子“F”值，同时可查出该样品内混杂的核酸百分含量。将F 值代入，由下述公式可直接算出该样品的蛋白质含量：蛋白质含量（ mg/mL=F1/dA280nmn式中A280nm该样品液在280nm 波长下的吸收值；d石英杯的厚度（cm）；n样品的稀释倍数。,四、福林-酚比色法,1原理蛋白质与福林（Folin）-酚试剂反应，产生蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，同时也由于蛋白质中存在的酪氨酸与色氨酸同磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生颜色。呈色强度与蛋白质含量成正比，是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。,2试剂福林酚试剂甲：将溶液 A50mL 和溶液B 1mL 混合即成。现用现配，过期失效。溶液 A：1g Na2CO3 溶于50mL 0.1mol/LNaOH 溶液中。溶液 B：将1%硫酸溶液和20g/L 酒石酸钠（钾）溶液等体积混合而成。,福林酚试剂乙：在 1.5L 体积的磨口回流管中，加入100g 钨酸钠（Na2WO42H2O）、25g 钼酸钠（Na2MoO42H2O）以及700mL 蒸馏水，再加入50mL85%磷酸溶液及100mL 浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流完毕，加入150g 硫酸锂、50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，以便除去过量的溴，冷却后加水定容至1000mL，过滤，滤液呈微绿色，置于棕色瓶中保存。使用时用氢氧化钠标准溶液滴定，以酚酞作指示剂，最后用蒸馏水稀释（约1 倍左右），使最终浓度为1.0mol/L. 牛血清蛋白标准溶液：精确称取牛血清蛋白或酪蛋白，配制成100g/mL 溶液。,3测定吸取一定量的样品稀释液，加入试剂甲3.0mL，置于25中水浴保温10min，再加入试剂乙0.3mL，立即混匀，保温30min，以介质溶液调零，测定A750nm 值，与蛋白质标准液作对照，求出样品的蛋白质的含量。本法在060mg/L 蛋白质范围呈良好线性关系。,4说明福林-酚法灵敏度高，实测下限较双缩脲法约小2 个数量级。但对双缩脲法有干扰的物质对福林酚法的影响更大。酚类及柠檬酸均对本法有干扰。,五、染料结合法1原理在特定条件下，蛋白质可与某些染料（如胺黑10B 或酸性橙12 等）定量结合而生成沉淀，用分光光度计测定沉淀反应完成后剩余的染料量可计算出反应消耗的染料量，进而可求得样品中蛋白质含量。2适用范围本法适用于牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力饮料、脱脂乳粉等食品。,3试剂,柠檬酸溶液：称取柠檬酸（含1 分子结晶水）20.14g，用水稀释至1000mL，加入1.0mL丙酸（防腐），摇匀后pH 应为2.2。胺黑10B 染料溶液：准确称取胺黑10B 染料1.066g，用pH2.2 的柠檬酸溶液定容至1000mL，摇匀，取出1mL，用水稀释至250mL，以水为参比液，用1cm 比色皿于615nm波长处测定吸光度应为0.320；否则用染料柠檬酸溶液或水进行调节。,4操作方法样品处理：用组织捣碎机将样品粉碎，准确称取一定量（蛋白质含量在370430mg），作标样用时称四份（两份凯氏法、两份染料结合法）。如样品脂肪含量高，用乙醚提取脂肪弃去，然后再作试验。染料结合：将脱脂肪后样品全部放入组织捣碎机中，准确加入吸光度为0.320 的染料溶液200mL，缓慢搅拌4min。,过滤离心：将结合后的样品溶液用铺有玻璃棉的布氏漏斗自然过滤，或用G2 熔结玻璃漏斗抽滤，静置20min，取上清夜4mL，用水定容至100mL，摇匀，取出部分溶液离心5min（2000r/min）。比色：取离心后的澄清透明溶液，用1cm 比色皿，以蒸馏水为参比液于615nm 波长处测定吸光度。,标准曲线的绘制：用凯氏定氮法测出上述两份平行样品的总氮量，进而计算出用于染料结合法测定的每份平行样的蛋白质含量，以比色测定得到的吸光度（实质是由沉淀反应后剩余的染料所产生的吸光度）为纵坐标（注意数值最好按从上到下吸光度增大的顺序标出），以相应蛋白质含量为横坐标绘图，即得标准曲线。该标准曲线供分析同类样品蛋白质含量使用。测样：完全按照上述（1）（4）步骤进行，根据测出的吸光度在标准曲线上查得蛋白质含量即可。,6说明及注意事项取样要均匀。绘制完整的标准曲线可供同类样品长期使用，而不需要每次测样时都作标准曲线。脂肪含量高的样品，应先用乙醚脱脂，然后再测定。在样品溶解性能不好时，也可用此法测定。本法具有较高的经验性，故操作方法必须标准化。本法所用染料还包括橙黄G 和溴酚蓝等。,六、考马斯亮蓝染料比色法1原理考马斯亮蓝G250 是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德华引力结合，使蛋白质染色，在620nm 处有最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。此法简单而快速，适合大量样品的测定，灵敏度与福林酚法相似，但不受酚类、游离氨基酸和小分子的影响。,2试剂牛血清蛋白标准液：精确称取牛血清蛋白10mg，用蒸馏水配成100g/mL 的标准溶液。染料试剂：考马斯亮蓝G-250（Coomassic brilliant blue G-250）60mg 溶解 过滤 贮棕色瓶。,100mL3%过氯酸,3.测定方法,本法在 0100mg/L 蛋白质范围内呈良好的线性关系。,0100mg/ml系列标液,空白,待测样液,七、水杨酸比色法,1原理样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成蓝色化合物，可以在波长660nm 处比色测定，求出样品含氮量，进而计算出蛋白质含量。,2操作方法标准曲线的绘制：准确吸取每毫升相当于氮含量2.5g 的标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置于25mL 容量瓶或比色管中，分别加入2mL 空白酸工作液、5mL 磷酸缓冲溶液，并分别加水至15mL，再加入5mL 水杨酸钠溶液，移入3637的恒温水浴中加热15min 后，逐瓶加入2.5mL 次氯酸钠溶液，摇匀后再在恒温水浴中加热15min，取出加水至标线，在分光光度计上于660nm 波长处进行比色测定，测得各标准液的吸光度后绘制标准曲线。,样品处理：准确称取 0.201.00g 样品（视含氮量而定，小麦及饲料称取样品0.50g左右），置于凯氏定氮瓶中，加入15mL 浓硫酸、0.5g 硫酸铜及4.5g 无水硫酸钠，小火加热至沸腾后，加大火力进行消化。待瓶内溶液澄清呈暗绿色时，不断地摇动瓶子，使瓶壁黏附的残渣溶下消化。待瓶内溶液澄清后取出冷却，移至25mL 容量瓶中并用水稀释至标线。,样品测定：准确吸取上述消化好的样液 10mL（如取5mL 则补加5mL 空白酸原液），置于100mL 容量瓶中，并用水稀释至标线。准确吸取2mL 于25mL 容量瓶中（或比色管中），加入5mL 磷酸盐缓冲溶液，以下操作手续按标准曲线绘制的步骤进行，并以试剂空白为参比液测定样液的吸光度，从标准曲线上查出其含氮量。,4说明样品消化完全后当天进行测定结果的重现性好，但样液放至第二天比色即有变化。温度对显色影响极大，故应严格控制反应温度。对谷物及饲料等样品的测定证明，此法结果与凯氏法基本一致。试剂配制请参考黄伟坤等编著食品检验与分析书。,八、红外光谱法1原理红外光谱法测定由食品或其他物质中分子引起的辐射吸收（近红外、中红外、远红外区）。食品中不同的功能基团吸收不同频率的辐射。对于蛋白质和多肽，多肽键在中红外波段（6.47m）和近红外（NIR）波段（如33003500nm，20802220nm，15601670nm）的特征吸收可用于测定食品中的蛋白质含量。针对所要测的成分，用红外波长光辐射样品，通过测定样品反射或透射光的能量（反比于能量的吸收）可以预测其成分的浓度。,2应用红外牛乳分析仪采用中红外光谱法测定牛乳蛋白质含量，同时近红外光谱仪也广泛应用于食品蛋白质的分析中（如谷物、谷类制品、肉类和乳制品中）。这些仪器非常昂贵，且多须经适当的调试。但分析人员只需经最低程度的培训就可以快速分析样品（30s2min）。,第四节 氨基酸的定量测定,甲醛滴定法茚三酮比色法非水溶液滴定法双指示剂法电位法三硝基苯磺酸法邻苯二甲醛法,一、氨基酸的一般定量测定,（一）甲醛滴定法1原理氨基酸具有酸性的-COOH 基和碱性的-NH2 基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2 基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用标准强碱溶液来滴定-COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式（有三种不同的推论）如下：,2方法特点及应用 此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高。,3操作方法吸取含氨基酸约20mg 的样品溶液于100mL 容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0mL置于200mL 烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液mL 数，供计算总酸含量。,加入10.0mL 甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数。同时取80mL 蒸馏水置于另一200mL 洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH82，（此时不计碱消耗量），再加入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，作为试剂空白试验。,4结果计算氨基酸态氮质量分数（%）= 式中：V1样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL；c氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；m测定用样品溶液相当于样品的质量，g；0.014氮的毫摩尔质量，g/mmoL。,5说明本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。浑浊和色深样液可不经处理而直接测定。,(二)茚三酮比色法1原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为 570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。,2操作方法(1)标准曲线绘制准确吸取 200g /mL 的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相当于0、100、200、300、400、500、600g 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH 为8.04）各1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，在570nm 波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。,(2)样品测定吸取澄清的样品溶液 14mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A 值，用测得的A 值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。,4说明及注意事项通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品 510g 或吸取样液样品510mL，置于烧杯中，加入50mL 蒸馏水和5g 左右活性炭，加热煮沸，过滤，用3040mL 热水洗涤活性炭，收集滤液于100mL 容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化，具体操作可参阅黄伟坤等编著食品检验与分析。,(三)非水溶液滴定法1原理 氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。根据酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱；弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强，因此本来在水溶液中不能滴定的弱碱或弱酸，如果选择适当的溶剂使其强度增加，则可以顺利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中呈现中性，而在冰醋酸中就能接受质子显示出碱性，因此可以用高氯酸等强酸进行滴定。,本法适合于氨基酸成品的含量测定。允许测定的范围是几十毫克的氨基酸,2测定(1)直接法（适用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品50mg 左右，溶解于20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示剂，用0.100mol/L 高氯酸标准液滴定（用10mL 体积的微量滴定管），终点为紫色刚消失，呈现蓝色。空白管为不含氨基酸的冰醋酸液，滴定至同样终点颜色。,(2)回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品3040mg 左右，溶解于5mL0.1mol/L 高氯酸标准溶液中，加2 滴甲基紫指示剂，剩余的酸以醋酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不褪的紫色为终点。,3说明(1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法测定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。不易溶解于冰醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法测定的有：赖氨酸、丝氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。,(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以将样品溶解于2mL 甲酸中，再加20mL 冰醋酸，直接用标准的高氯酸溶液滴定。,二、个别氨基酸的定量测定,（一）赖氨酸的测定1原理用铜离子阻碍游离氨基酸的-氨基,使赖氨酸的-氨基可以自由地与1-氟-2,4 二硝基苯(FDNB)反应,生成-DNP-赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取,在波长390nm 处有吸收峰,从而求出样品中游离赖氨酸的含量.,2试剂(1)氯化铜液：称28.0g 无水氯化铜，用水稀释至1000mL。(2)磷酸三钠溶液：称68.5g 无水磷酸钠,用水稀释至1000mL。(3)硼酸盐缓冲液（pH9.19.2）：称54.64g 带有10 结晶水的四硼酸钠，用水稀释至1000mL 。,(4)磷酸铜悬浮液：搅拌情况下，把氯化铜液200mL，缓慢倒入400 mL 的磷酸三钠溶液中，把悬浮液以2000r/min 速度离心5min ，用硼酸盐缓冲液再悬浮沉淀物，洗涤离心3 次，把最后的沉淀物悬浮在硼酸盐缓冲液中，并用缓冲液稀释至1L。(5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀释至100mL。(6)赖氨酸-HCl 标准溶液：称取一定量赖氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作标准液。(7)100g/L 丙氨酸溶液。,3测定(1)称取通过40 目筛的均匀试样1.00g，置于100mL 烧瓶中。另吸取赖氨酸-HCl 标准工作液5mL（相当1mg 赖氨酸-HCl），连同试剂同时进行空白试验。(2)向各烧瓶中加入25mL 磷酸铜悬浮液，然后再加10%丙氨酸1.0mL,振摇15min。吸取10%FDNB 溶液0.5mL.置于各处理烧瓶中,将烧瓶置沸水中加热15min。,(3)取出烧瓶,立即加入1mol/LHC