第一章总论天然药物化学课件.ppt

天然药物化学NATURAL MEDICINALCHEMISTRY,第一章 总 论,【目的与要求】掌握天然药物化学的含义、性质与任务，天然产物有效成分提取分离的一般原理及常用方法。熟悉不同的生物合成途径与各类二次代谢产物生成的相关性。了解天然化合物结构研究的一般步骤和常用方法。了解本学科近代研究成就及发展趋势，本学科在药学专业中的地位。【授课时数】 4学时,第一节 绪 论天然药物化学的内涵天然药物化学的研究对象及其任务天然药物化学发展简史天然药物化学研究发展趋势天然药物化学的学习方法,一、天然药物化学的内涵,（一）定义 天然药物化学是运用现代科学理论与方法研究天然药物中化学成分的一门学科。,（二）主要研究内容 围绕天然药物中的二次代谢产物，也是围绕生理活性成分或有效成分来研究： 化学成分类型 化学成分结构特征 化学成分的理化性质 各类化学成分提取分离方法 化学成分的结构鉴定 主要化学成分类型的生物合成途径,天然药物,天然产物,中草药,中药,草药,植物、动物、矿物、海洋生物、微生物,（三）相关概念及术语,中草药成分化学(Chenmistry of Chinese Traditional Medicine and Herbal Drugs)中药化学(Chemistry of Chinese Traditional Medicine)植物化学(Phytochemistry)一次代谢产物(植物营养物质)： 植物生物化学二次代谢产物：天然药物化学、中药化学、中草药成分化学、天然产物化学、植物药品化学、天然有机化学.,有效成分 具有生物活性且能起到防治疾病作用的化学成分。 有效部位 常将含有一种主要有效成分或一组结构相近的有效成分的提取分离部分，称为有效部位。如人参总皂苷、苦参总生物碱、银杏总黄酮等。有效部位群 含有两类或两类以上有效部位的提取或分离部分。 无效成分 没有生物活性和防病治病作用的化学成分。（杂质） 单体 即化合物,指具有一定分子量、分子式、理化常数和确定的化学结构式的化学物质 。,（四）相关课程 天然药物化学是药学专业必修的专业课程，是多学科交叉的前沿学科，需要具有全面系统的药学知识。生药学/药用植物学有机化学/无机化学/物理化学分析化学/有机波谱分析药理学 药剂学等,（五）天然药物化学的地位和作用 1、寻找新药或活性先导化合物 据1981年统计，建国以来研制新药104种，其中来自植物、动物有效成分及 改构共61种，占58.6% 。,可卡因(Cocaine),普鲁卡因(Procaine),2、整理、发掘祖国医药宝库 生物活性成分或指标性成分 防病治病原理的探索、新资源的开发和利 用、合理采集、妥善贮藏、合理炮炙、剂 型改进、真伪鉴别、质量控制 3. 植物化学分类学的研究 利用植物的亲缘相关性 改变传统的形态分类方法4. 发展和丰富天然有机化学理论,二、天然药化的研究对象及其任务,（一）主要研究对象 1、植物药 2、动物药 3、海洋生物 4、矿物药 5、微生物,植物药世界范围 高等植物1315万种，其中药用植物约14500种以上。活性筛选仅占 5%，化学成分研究则更少。中 国 我国自然资源丰富，植物品种繁多，其中种子植物就有25700余种，药用植物11800多种，常用5000余种。湖 北 中药资源种类3970种，居全国第五位，湖北省中药材计3200余种， 占全国中药材品种一半以上，年收购量占全国第六位。,海洋生物 海洋占整个地球的表面的71%，蕴藏着极其丰富的生物资源，是展现在人们面前的巨大天然库，现在已成为研究的热点民族药 我国有56个兄弟民族，其中少数民族55个，民族药是中国传统医药学的重要组成部分。如：藏、蒙、维药. 等约有1500余种。,（二）主要任务 1. 创新药物的研究（包括先导化合物的改构与全合成） 抗肿瘤药物 心脑血管药物 糖尿病药物 爱滋病药物 抗病毒药物 老年性疾病药物 免疫调节药物 计划生育药物 急性热病类药物 2.中药现代化的研究 1) 中药资源的开发利用及其品质评价的研究 2) 复方中药活性物质及其作用机理的研究 3) 中药材规范化种植（GAP）研究 4) 中药标准提取物及质量标准的研究 3.功能性食品及相关产品 功能食品 天然色素 香料 美容化妆品,三、天然药物化学发展简史 国际发展史 1、天然药物化学的建立与形成 1769年舍勒（K.W.schelle) 酒石 转化 钙盐 硫酸 酒石酸 1775年 苯甲酸 1780年 乳酸 1785年 苹果酸 1786年 没食子酸观点1: “植物中只有酸性物质” 威勒 (Rouelle) 1828 尿素 (脲) 1822 瑞香苷 柏格曼 (Bargmann) 1776 尿酸 (脲) 1830 苦杏仁苷观点2: “植物中有机酸的研究促成有机化学及植物化学的形成”,德罗逊 (Derosen)斯托勒 (Sertrner),1803 1806 吗啡(鸦片),1817 士的宁碱 1819 咖啡因 1820 喹宁 1828 尼古丁 1831 阿托品 1833 乌头碱,Morphine为第一个从天然界分离的生物活性成分，1803-1806年发现，1925年提出正确结构，1952年人工合成，共花了150年。利血平 1952-1956年观点3：生物碱的研究是天然药物化学发展的开端 。,2. 天然有机合成化学的建立与发展 1）“生命力”学说的提出 瑞典化学家贝泽留斯(Berzelius)认为：“有机化合物的变化只能受生命力所支配”。 2）有机化合物的合成 1828年德国化学家弗列德里奇.奥勒(Friedrich woler)在实验室用无机化合物合成了脲2KOCN + (NH4)2SO4 K2SO4 + 2NH4OCN 氰酸钾 硫酸铵 氰酸铵NH4OCN H2NCONH2 尿素德国化学家科尔贝(Kolbe)又合成了醋酸。 由此促进了有机合成化学的发展。,3. 天然药物化学的兴衰 1）合成药物的工业化生产制约了天然药物化学研究 二十世纪：三十年代 磺胺药 (1935)、维生素问世 四十年代 盘尼西林的使用 五十年代 形成了新药上市的黄金时代 2）药害震惊全球 西德1956年出售镇静药 “反应停”肽胺哌啶酮 Thalidomide到1962年就引起数千例 畸胎。,美登木碱 (Maytansine),利血平 (Reserpine),紫杉醇 (Taxol),长春碱 (Vinblastine) R=CH3长春新碱 (Vincristine) R=CHO,3）大规模寻找天然活性物质,（二）国内发展史1. 古代“本草化学”的实践经验和发现阶段 我国在1575年明代医学入门记载有用发酵法从五倍子中制得没食子酸的过程. 1）冶金的实践 古代的“冶金术”、“炼丹术”、“点金术”创造了许多实验方法，开拓了化学研究途径。 上古时代就有金、银、铜、铁、锡、铅、汞、硫、碳等元素的记载，如：宋应星著天工开物 记载有锌的冶炼和氧化 锌的制备。 明崇祯十年 (1637年)，其后经印度传至西欧。,2） 炼丹与无机合成药物的实践 世界上最早的无机合成化学药物：轻粉(Hg2Cl2)李时珍 (1518-1592) 本草纲目6Hg + 2KH(SO4)2 + 6NaCl + 2O2 K2SO4 + 3Na2SO4 +3Hg2Cl2记载：轻粉由汞 (Hg)、白砂KH(SO4)2、食盐 (NaCl)配伍，经升华而得。这是一个伟 大的化学实践。另外: 水银 (Hg)、升丹(HgO)、朱砂(HgS)等一直作为世界药物用到现在。 朱砂(HgS)至今仍是中国药典药材。,3） 炼丹术与升华药物的实践发现,炼丹术发展了升华法，如樟脑的精制：,李时珍 (1518-1592) 本草纲目,洪遵 (1176年) 经验方,才提出樟脑纯品。,详细记载樟脑有关提炼和升华 精制的操作。,“樟脑”始见于经验方，由马可波罗带到西方。,明弘治 (1505年) 本草品汇精要,有樟脑记载。,欧洲18世纪 下半叶,4）汞齐法技术的实践,李时珍 (1518-1592) 本草纲目,汞齐法曾用为冶金术。“银”在名医别录中被列为中品，用作镇惊剂。 “银膏”是“用白锡和银铂及水合成之，凝硬如“银”，用于 “补牙齿缺落”。至今仍沿用于补牙。,记载着制银屑法： “银铂以水银消之为泥，合硝石 及盐为粉，烧出水银，淘去盐石，为 粉及细”。,硝石列为上品，硫磺列为中品药。,神农本草经,本草纲目,当时加火炼制而发现“烟火”和“炸药”，从而成为世界上制造弹药、爆破剂、火箭的先导。,其产生爆炸的原因是：,5）黑火药的配伍实践,黑火药能治“疮癣杀虫、辟淫气湿变”。,“黑火药”配方,主要组成为硝石(KNO3)、硫磺(S)、,木炭(C)三者的粉末混合物。,2KNO3 3CS N2 + 3CO2 + K2S 1694卡,商周(前256 前1766),酿酒业十分盛行,6）酶解、酸解、碱解及氧化制品的实践,诗经(前476776年),记载有纤维(纸原料)、油脂、饴糖的文字,记载有从马蓝、蓼蓝、菘蓝、木蓝植物， 经酶、酸、碱水解下制备青黛的制备方法。,齐民要术(五世纪),圣惠方(932992年),用“百药煎”制革，它是由五倍子等粗末经曲 发酵制得的没食子酸。,记载：“看药上长起长霜，药则已成矣”。长霜即没食子酸结晶，此是世界上最早制得的有机酸结晶，较之瑞典化学家席勒的工作要 早二百多年。,发酵法制备没食子酸。近代可用各种没食子 酸鞣质资源生产没食子酸。,本草纲目(1518-1592),改正日本药局方注释(第六版)(1953年),在 “射网” 的制备下记载：取新鲜草乌汁，经沉淀，过滤，清液置碗中日晒蒸发，至瓶口现“黑砂点子”；再放炉内低温蒸发，直到下层为稠膏，上层现白如砂糖状的结晶。此种“砂糖样”物质，上箭最快，到身数步即死”。,这种极毒的砂糖样结晶即乌头碱，在欧洲1833年提出，1860年才制得结晶。,7）提取分离纯化方法制取纯成分的实践,除上述樟脑的提取和升华精制外，有关烧酒、葡萄酒的蒸馏、药酒的浸提，丹参用羊脂浸提。,关于“秋石”的制备中有煎熬、溶解、过滤、浓缩、结晶等操作。,本草纲目拾遗 (1765年),本草纲目 (1518-1592),国外学者的评价： 我国外藉院士、英国学者李约瑟孜孜不倦研究 中国古代科技史五十余年，在其巨著中国科学技术史中写道： “现代人之所以更为优秀，是因为他们发现了印刷术、黑火药、和磁罗盘，我们把它归功于中国人。要是没有这种贡献，就不可能有我们西方文明的整个发现历程。” 他指出“在欧洲十六世纪帕拉尔(Paracelsus, 14931541) 将水银、锑、铋等矿物作药物 (原来公认草药) 的时候， 存在着很大的争议，而中国在那时已使用矿物药有许多世纪。” 他还指出：“ 中国药物化学从11世纪到17世纪处于一个灿烂的时期。”,2. 近代天然药物化学的引进和创建阶段,1) 二十年代 主要成就是麻黄碱的研究 .同时还对闹羊花、莽草、延胡索等开展了一些研究工作。 2) 三十年代 进行了中药延胡索、防己、贝母、陈皮、细辛、钩藤、洋金花、 除虫菊、雷公藤、三七、广地龙、柴胡中成分的分离工作。 黄呜龙等：延胡索延胡索乙素(dl-Tetrahydropalmatine) 庄长恭等：粉防己防己诺林碱(Fangchinoline)；粉防己碱(Tetrandrine),延胡索乙素,粉防己碱 R=CH3 防己诺林碱 R=OH,3) 四十年代 主要研究了常山的抗疟有效成分，定出了常山生物碱的分子式、母核，并和国外学者共同研究取得一定成绩。另对羊角拗、远志、前胡、丹参、射干、使君子等也做了许多工作。 这三、四十年中，我国科学家虽然在有效成分及药理方面做了一些艰苦的工作，但在化学成分结构的研究上却较少突破，新成分的发现也较少。,3. 现代天然药物化学的建立和发展阶段 五十年代以后 1）利用丰富药源生产药物 麻黄素、芦丁、洋地黄毒苷、咖啡因、黄连素、粉防己碱、加兰他敏、山道年等。 2）减少进口、自给自足药物 地高辛、西地兰、麦角新碱、秋水仙碱、阿托品、东茛菪碱、长春碱、长春新碱、薯蓣皂苷元等。 3）民间草药发掘药物 颅痛定、岩白菜素、天花粉素、川楝素、黄藤素、鹤草酚、焊菜素、亮菌甲素、棉酚、羟基喜树碱等。,4）特色天然化学药物 如青蒿素、三尖杉酯碱、山茛菪碱、天麻素、靛玉红、齐墩果酸、丁公藤碱II、高乌头碱、石杉碱甲、川芎嗪等。 5）改构药物 如青蒿素、抗痫灵、常咯啉、联苯双酯等。 6）合成药物 如黄连素、延胡索乙素、山茛菪碱、天麻素、咖啡因、靛玉红、川芎嗪、大蒜新素、罂粟碱等。,天然药物化学家,第一代（30-40年代） 赵承嘏 黄鸣龙 庄长恭 高怡生 第二代（50-60年代） 朱子清 林启寿 邢其毅 梁晓天 黄 量 姜达衢 周维善 王宪楷 赵守训 第三代（70-80年代） 徐任生 姚新生 于德泉 周 俊 孙南君 陈耀祖 贾忠健 陈延庸 张如意 潘德济 陈英杰 闵知大 第四代（80-90年代） 陈仲良 孙汉董 吴厚民 王锋鹏,四、天然药化研究发展趋势,(一) 化学结构研究,1. 快速,morphine,从发现到确定结构到人工合成:1952-1956,Reserpine,提取分离: 1803-1806 提出结构: 1925合成证实: 1952前后经历一百多年.,2. 微量,生物碱 (Alkaloids) 数量 总量1803-1952 950 950 1952-1962 1107 20571962-1972 3443 55001972-1987 4500 10000,莲心碱 (Liensinine),3. 准确,经典化学方法,现代波谱方法,50年代 I R 60年代 1H-NMR 70年代 13C-NMR 80年代 2D-NMR MS X-ray,(二) 研究的重大转变,病理模型 动物模型 离体器官 分子水平 酶 水 平 血清药理,薯蓣皂苷元: 天 然 1. 5 % 组织培养 2. 5 %,(四) 注重结构改造和仿生合成,1) 解决植物活性成分含量偏少 2) 合理保护药用资源,1. 活性成分研究转向微量、水溶性、大分子成分 2. 由单纯化学转向生物活性成分研究 3. 由单味中药转向复方中药 4. 生物活性检测转向分子水平,(三) 组织培养,五、学习天然药物化学方法,（一）基本骨架类型及其结构特征 1. 基本骨架 2. 主要活性化合物 （二）各类成分的理化性质 1. 共性 1) 鉴别反应 (1) 沉淀反应 (2) 显色反应 2) 溶解性 3) 酸碱性 2. 特性 （三）各类成分的提取分离方法 1. 利用不同溶解度 2. 利用不同酸碱性 3. 利用层析分离法 （四）各类成分的结构测定方法 1. 各类成分的主要化学反应 2. 主要成分的波谱特征,理 论 和 实 践 并 重,特别注意,第二节 生物合成 (Biosynthesis)植物一次代谢及二次代谢生物合成假说植物亲缘相关性学说与植物化学分类学主要的生物合成途径 了解生物合成的意义,一、一次代谢及二次代谢,(一) 一次代谢及其代谢产物一次代谢 维持植物机体生命活动的代谢过程叫一次代谢。一次代谢产物 (primary metabolites) 糖类 蛋白质 脂质 核酸一次代谢产物的作用 植物的营养物质 人类赖以生存的物质基础,植物一次代谢与生物合成过程,三羧酸循环（TCA）丁酮二酸-酮戊二酸丁二酸,CO2 + H2O,h / 叶绿素,磷酸烯醇式丙酮酸,甲戊二羟酸,丙酮酸,乙酰辅酶A,丙二酸单酰辅酶A,赤藻糖4-磷酸,葡萄糖糖代谢,莽草酸,苯丙素类,芳香族氨基酸,脂肪族氨基酸,嘌呤、嘧啶,脂肪酸类,-氨基乙酰丙酸,(二) 二次代谢及其代谢产物二次代谢 以一次代谢产物为原料（或前体），经不同途径进一步合成的过程叫二次代谢。二次代谢产物 (secondary metabolites) 产生结构千变万化、千奇百怪、珣丽多姿的化学物质。二次代谢产物的作用 维持植物的特性与特征 重要的药物资源,植物二次代谢与生物合成过程,三羧酸循环（TCA）丁酮二酸-酮戊二酸丁二酸,鞣酸类,CO2 H2O,h / 叶绿素,磷酸烯醇式丙酮酸,甲戊二羟酸,丙酮酸,丙二酸单酰辅酶A,赤藻糖4-磷酸,葡萄糖代谢,莽草酸,苯丙素类,芳香族氨基酸,脂肪族氨基酸,嘌呤、嘧啶,脂肪酸类,萜 类,甾 醇,胡萝卜素类,生物碱类,肽 类,含氮化合物,香豆素、木脂（质）素,黄酮类,-氨基乙酰丙酸,核苷,核苷酸类,醌 类,胆 碱,卟啉类,前列腺素类,脂肪族及芳香族聚酮类,乙酰辅酶A,二次代谢产 物,苷 类非苷类 （苷元） + 糖挥发油,脂肪族萜 类芳香酚类,酸性物质碱性物质中性物质,脂肪族芳香族,香豆素类木脂素类木质素类,苯丙素类黄 酮 类醌 类鞣 质,植物甾醇强 心 苷皂 苷,单 萜倍 半 萜二 萜二倍半萜三 萜多 萜,甾 族萜 类,生物碱N 族,油 脂,二次代谢产物归类,二次代谢产物的意义二次代谢过程并非所有植物均发生；二次代谢产物对维持植物生命活动不起重要作用；二次代谢产物对维持植物性状特征十分重要；二次代谢产物结构富于变化，瑰丽多彩；二次代谢产物不少具有明显的生理活性；二次代谢产物是天然药物化学主要研究对象。,二、生物合成假说,三、“植物亲缘相关性学说”与“植物化学分类学”,1. “植物亲缘相关性学说” 同科同属植物往往含有骨架相同或结构类似的化学成分。如：,2. “植物化学分类学” 按照化学成分的类别 (骨架类别) 进行分类。是原来按照形态 特征分类的另一种分类方法。,C-non-D-homo-steroid,湖北贝母 梭砂贝母,Hupehenine,百合科,贝母属,湖贝甲素,四、主要的生物合成途径,(一）基本结构单位,氨基酸,萜 类,甾 醇,生物碱类,香豆素 木质素 木脂体,黄酮类,脂肪族类 苯酚、苯 醌、蒽醌等聚酮类,异戊烯单元,糖单元,氨基酸单元,新生霉素,1. 醋酸丙二酸途径 (acetate-malonate pathway AA-MA途径) 合成成分类别：脂肪酸类,（二）主要的生物合成途径,脂肪酸类生物合成途径,醋酸丙二酸途径 (acetate-malonate pathway)合成成分类别：酚类、蒽酮、蒽醌类,2. 甲戊二羟酸途径(mevalonic acid pathway MVA) 合成成分类别：萜类、甾体类,甲戊二羟酸单酰辅酶A,焦磷酸异戊烯酯,焦磷酸二甲烯丙酯,3.桂皮酸途径及莽草酸途径 (cinnamic acid shikimic acid pathway) 合成成分类别：香豆素类、木脂素和木质素类、黄酮类,4.氨基酸途径 (amino acid shikimic acid pathway) 合成成分类别：生物碱类,5.复合途径： 常见的复合途径有： 1)、醋酸丙二酸莽草酸途径； 2)、醋酸丙二酸甲羟戊酸途径； 3)、氨基酸甲羟戊酸途径； 4)、氨基酸醋酸丙二酸途径； 5)、氨基酸莽草酸途径；,五、了解生物合成的意义 (一) 利用植物亲缘相关性 1. 推测天然化合物的结构 2. 定向寻找天然活性成分 3. 植物化学分类 (二) 组织培养 1. 工业生产有效成分 2. 生物调控，提高活性成分含量,第三节 提取分离方法,一、概述 (一) 中草药化学成分的构成特点 (二) 提取分离前的文献调研 二、中草药有效成分的提取 (一) 常用提取方法 (二) 溶剂提取法 三、中草药有效成分的分离与精制 (一) 根据物质溶解度差别进行分离 (二) 根据物质分配系数差异进行分离 (三) 根据物质吸附能力差异进行分离 (四) 根据物质分子大小差异进行分离 (五) 根据物质解离程度差异进行分离 四、提取与分离中草药有效成分的注意点 (一) 光照的影响 (二) 酸碱的影响 (三) 温度的影响 (四) 溶剂的影响 (五) 层析的影响,一、概 述,(一) 中草药化学成分的构成特点 1. 同种植物含有多种结构类型的化学成分,苦参,2. 总成分含量少而种类多,长春花,黄酮类 生物碱,贝母,生物碱 萜 类 甾醇类,3. 有效成分含量低,总生物碱含量 1 / 千 分离生物碱单体 68种,长春碱 3 / 万,长春新碱 3 / 百万,美登木碱 2 / 千万,(二) 提取分离前的文献调研 1. 立题着眼点 1) 为什么要立题 2) 怎样做 2. 了解前人的研究工作 1) 做过研究没有? 2) 研究的深度和广度 3. 原植物的鉴定 1) 原植物的拉丁学名 2) 采集地点和时间 3) 药及部位 4) 民间药用情况,二、中草药有效成分的提取,(一) 常用提取方法 溶剂法、蒸馏法、升华法、压榨法等,压榨法,溶剂法,蒸馏法,原理：与水蒸气产生共沸点 范围：挥发油,升华法,原理：相似者相溶 范围：所有化学成分,原理：遇热挥发，遇冷凝固 范围：游离蒽醌 部分小分子生物碱,原理：机械挤压 范围：新鲜药材、种籽植物油,(二) 溶剂提取法,1. 常用溶剂的性质,极性：石油醚环己烷苯氯仿乙醚乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇水,2. 天然药物各类成分的极性与提取溶剂的关系,3. 选择溶剂注意点 1) 对有效成分溶解度大,对杂质溶解度小 2) 不与化学成分起化学变化 3) 经济、易得、使用安全,4. 溶剂法分类 1) 浸渍法 2) 渗滤法 3) 煎煮法 4) 回流提取法 5) 连续回流提取法 6) 超临界流体萃取技术 7) 超声波提取技术,影响提取效率 的 因 素,1) 原料粉碎度 2) 提取时间 3) 提取温度 4) 设备条件,三、中草药有效成分的分离与精制,(一) 根据物质溶解度差别进行分离 1. 原理: 相似者相溶 2. 方法: 1) 重结晶法 利用温度差异对样品溶解度的不同达到分离 2) 混合溶剂法 H2O - MeOH 、EtOH H2O 、EtOH - Et2O,粗组份,少量易溶样品溶剂,样品溶液,滴加难溶样品溶剂,放置,结晶,3) pH调整法,4) 沉淀法,样品,酸水液,无机酸盐,H2O,H2S,有机酸盐,重金属硫化物,有机酸,有机溶剂萃取,有机溶剂萃取,生物碱,(二) 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,1. 原理: 利用物质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数的不 同达到分离,2) 分离因子（ b值）与分离难易的关系,K = CU / CL,= KA / KB (注:KAKB),K值与萃取次数成反比，即K值越大， 萃取次数越少，反之越多,b值越大，越易分离； b 1时，无法分离一般50时，简单萃取即可分离，50时，则要采用逆流分溶法。,1) 分配系数（K值）与萃取次数的关系,3) 分配比与酸碱度（pH值）,A. 游离型与解离型,若使酸性物质完全离解，即HA均变成A-则：,B. Ka 与 pKa 均可表示酸碱性化合物酸碱性强弱,而 pH 值变化则可改变化合物的存在状态。,酚类化合物的pKa值一般为92108，羧酸类化合物的pKa值约为5，故pH3以下大部分酚酸性物质将以非离解形式(HA)存在，易分配于有机溶剂中；而pHl2以上时，则将以离解形式(A-)存在，易分配于水中。碱性物质正好相反。,2. 方法:常见的方法有简单的液-液萃取法、逆流分溶法(CCD)、液滴逆流色谱法(DCCC)、高速逆流色谱(HSCCC)、气液分配色谱(GC或GLC)及液-液分配色谱(LC或LLC)等。 简单液-液萃取法： 一般50时，简单萃取即可分离，50时，则要采用逆流分溶法。,两相溶剂萃取在操作中要注意以下几点： (1)先用小试管猛烈振摇约1分钟，观察萃取后二液层分层现象。如果容易产生乳化，大量提取时要避免猛烈振摇，可延长萃取时间。如碰到乳化现象，可将乳化层分出，再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤；或将乳化层稍稍加热；或较长时间放置并不时旋转，令其自然分层。乳化现象较严重时，可以采用二相溶剂逆流连续萃取装置。（2）水提取液的浓度最好在比重1.1-1.2之间,过稀则溶剂用量太大，影响操作。 (3)溶剂与水溶液应保持一定量的比例，第一次提取时,溶剂要多一些，一般为水提取液的1/3,以后的用量可以少一 些 ,一般1/4-1/6。 (4)一般萃取3-4次即可。但亲水性较大的成分不易转入有机溶剂层时，须增加萃取次数，或改变萃取溶剂。, 逆流分溶法(Counter Current Distribution,CCD:又称逆流分配法、逆流分布法、反流分布法。此法与两相溶剂逆流萃取法原理一致，但加样量一定，并不断在一定容量的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而达到混合物的分离。幻灯片 70 CCD法因为操作条件温和、试样容易回收，故特别适于中等极性、不稳定物质的分离。另外，溶质浓度越低，分离效果越好。但是，试样极性过大或过小，或分配系数受浓度或温度影响过大时则不易采用此法分离。易于乳化的萃取溶剂系统也不宜采用。,液-液萃取与纸色谱 对未知成分组成的混合物，其值可借助纸色谱的Rf值与分配系数K的关系： K有机相/水相=1/r（Rf/1-Rf）r为纸色谱定数，当纸的湿重为干重的1.5倍时，r=2。设A、B两种物质的Rf分别为Rfa和Rfb （RfaRfb） = Rfa（1-Rfb）/Rfb （1- Rfa ）,液-液分配柱色谱 法 将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上，作为固定相，填充在色谱管中，然后加入与固定相不相混溶的另一相溶剂（流动相）冲洗色谱柱。正相色谱：固定相用强极性溶剂，流动相用弱极性有机溶剂，分离水溶性及极性较大的成分。反相色谱：与正相色谱相反。加压液相柱色谱：载体多为颗粒直径较小、机械强度及比表面积均大的球型硅胶颗粒。依所用压力大小不同分为快速色谱、低压、中压、高压色谱。,支持剂：硅胶、硅藻土、纤维素粉等正相分配色谱： 固定相：水、缓冲溶液流动相：固定相饱和的氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱 极性有机溶剂洗脱顺序：化合物极性越小，越先出柱；反之，化合物极性越大，越后出柱。 应用：通常用于分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物。反相分配色谱： 固定相：石蜡油、化学键合固定相流动相：固定相饱和的水或甲醇等强极性有机溶剂 洗脱顺序：化合物极性越大，越先出柱；反之，化合物极性越小，越后出柱。应用：适合于分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等。,液滴逆流色谱（DCCC）及高速逆流色谱（HSCCC） 可使流动相呈液滴形式垂直上升或下降，通过固定相的液柱，实现物质的逆流色谱分离。,(三) 根据物质吸附能力差异进行分离,1. 吸附层析的种类,2. 物理吸附 1）基本规律：“相似者易于吸附” 2）基本特点：无选择性、可逆吸附、快速 3）基本原理：吸附与解吸附的往复循环 4） 三要素 吸附剂 、溶质(被分离物)、溶剂,物 理 吸 附 化 学 吸 附幻灯片 85 半化学吸附,固液吸附,吸附,再吸附,解吸,再解吸,直至分离,吸附剂,溶 质,溶 剂,强,弱,强,强,中,弱,弱,中,中,极性吸附剂 吸附剂的吸附力一定时，溶质极性 越强，洗脱剂的极性也应越强。,非极性吸附剂 吸附剂的吸附力一定时，溶质极性 越强，洗脱剂的极性越弱。,5）极性强弱的判断 (与功能基的种类、数目多少和排列方式有关) (1) 亲水性基团与极性成正比，亲脂性基团与极性成反比； (2) 游离型化合物极性弱、具亲脂性，解离型化合物极性强、具亲水性； 一般化合物的极性按下列官能团的顺序增强： CH2CH2，CH2=CH2，OCH3，COOR， C=O，CHO，NH2，OH，COOH 6）溶剂的极性依据介电常数来决定 介电常数越大，则极性越大。一般溶剂的介电常数按下列顺序增大： 环己烷（1.88），苯（2.29），无水乙醚（4.47），氯仿（5.20），乙酸乙酯（6.11），乙醇（26.0），甲醇（31.2）， 水（81.0）,7）简单吸附法进行物质的浓缩与精制 如活性炭脱色。8）吸附柱色谱法用于物质的分离 硅胶、氧化铝：一般用量为试样的30-60倍，大多用100目左右。 装柱尽量用极性小的溶剂，洗脱剂可用TLC展开时Rf为0.2-0.3的系统。9）聚酰胺吸附色谱法 聚酰胺是一种用途十分广泛的分离方法，极性与非极性物质均可适用，但特别适合分离醌类、酚类和黄酮类化合物。,聚酰胺吸附层析原理,聚酰胺吸附层析原理,吸附的强弱取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力： 形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强 易于形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附相应的减弱。 分子中芳香化程度高者，则吸附性增强，反之，则减弱。 注意：由于溶剂也会参与吸附剂表面的争夺，故被吸附物在水中与聚酰胺形成氢键缔合的能力最强，在含水醇中则随着醇浓度的增高而相应减弱，在高浓度醇或其他有机溶剂中则几乎不缔合。 一般情况下，各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱致强的大致顺序如下： 水甲醇乙醇氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液 其中，最常应用的洗脱系统是：乙醇水 聚酰胺的再生剂：10%醋酸、3%氨水、5%氢氧化钠。,10）大孔吸附树脂：是一类不含离子交换基因的交联聚合物。孔径较大，在1001000nm之间，故称为大孔吸附树脂。由于它具有交联立体多孔骨架结构，决定了它不溶于任何酸、碱、有机溶剂及加热不熔的特点，其性质与天然吸附剂活性炭相似，但具有下列优点，弥补了天然吸附剂活性炭之不足。1）物理、化学稳定性高，机械强度好，经久耐用。2）再生容易，一般用水、稀酸、碱或有机溶剂，如低碳醇，丙酮即可，而且分离出来的物质灰分低。3）品种多，可根据不同要求，改变树脂孔结构、极性等表面性能适用于吸附多种有机化合物。4）树脂一般为小球状，直径为0.3-1.25毫米之间，因此流体阻力不像粉状物质使用时不便。 可分为非极性、中极性、极性、强极性四类。,原理：分子筛性和吸附性相结合。吸附性是由范德华引力或氢键引起的。分子筛是由于其本身多孔性结构产生的。 非极性化合物在水中易被非极性树脂吸附，极性化合物在水中则易被极性树脂吸附。一般多用大孔树脂对中药中的化学成分和糖类物质进行分离。常用的为苯乙烯型、丙烯腈型及丙烯酸酯型等。预处理：甲醇、乙醇洗，水洗至无醇味再生：乙醇最常用（80%左右）,3. 化学吸附 1）基本特点：有选择性、不可逆吸附 2）基本原理：产生化学反应 (1) 酸性物质与Al2O3发生化学反应 (2) 碱性物质与硅胶发生化学反应 (3) Al2O3容易发生结构的异构化 3）应尽量避免 4. 半化学吸附 1）基本特点：介于物理吸附和化学吸附之间 2）基本原理：以氢键的形式产生吸附,(四) 根据物质分子大小差异进行分离,1. 基本原理 利用分子筛的原理分离物质,如葡聚糖凝胶,大孔树脂,活性碳 分子筛层析 (molecular sieve filtration chromatography) 排阻层析 (exclusion chromatography) 凝胶过滤层析 (gel filtration chromatography)即利用凝胶的三维网状结构的分子筛的过滤作用将化合物按分子量大小不同进行分离。 2. 三要素 载体 (葡聚糖凝胶)、溶质(被分离物)、洗脱剂 分离物质范围 糖苷类成分等4. 常用方法：透析法、凝胶过滤法、超滤法、超速离心法等,凝胶 是不溶于水，在水中却有较大膨胀度和较好的分子筛功能的一类化合物。目前主要有葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex），天然琼脂糖凝胶（商品名为Sapharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-Gel），其后还发展了凝胶的各种衍生物，如羧甲基-交联葡聚糖（CM-Sephadex），二乙基氨乙基-交联葡聚糖（DEAE- Sephadex）等种类。交联葡聚糖凝胶（Sephadex） 1) Sephadex G 交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶吸水量的10倍。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。只能在水中应用. 2) Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生物， Sephadex LH-20既能在水中也能在有机溶剂中以及水组成的混合溶剂中应用。,琼脂糖凝胶 : 琼脂糖凝胶在40以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌处理。商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。 聚丙烯酰胺凝胶： 是一种以丙烯酰胺为单位的人工合成凝胶，商品为生物胶P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。 聚苯乙烯凝胶 商品为Styrogel ， 具有大网孔结构， 可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。,膜分离技术： 按分离功能分为微滤（0.1m)、超滤（10-100nm）、纳滤（1-10nm）、反渗透（1nm）(五) 根据物质解离程度差异进行分离1. 基本原理 利用酸、碱化合物在解离状态时与阴、阳离子树脂产生离子交换的原理达到分离的方法。 2. 三要素 固定相 (离子交换树脂)、溶质(被分离物)、洗脱剂 3 .分离物质范围 酸、碱类化合物固定相：离子交换树脂流动相：水或含水溶剂（洗脱液）强酸性阳离子交换树脂（H型）稀氨水洗脱 强碱性阴离子交换树脂（OH型）稀氢氧化钠洗脱,离子交换树脂是一类带有功能基的网状结构的高分子化合物，它由不溶性的三维空间网状骨架、连接在骨架上的功能基团和功能基团上带有相反电荷的可交换离子三部分构成。依骨架不同分为凝胶型和大孔型。 离子交换树脂可分为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和两性离子交换树脂。若带有酸性功能基，能与溶液中的阳离子进行交换，称为阳离子交换树脂；若带有碱性功能基，能与阴离子进行交换，则称为阴离子交换树脂。两性树脂是一类在同一树脂中存在着阴、阳两种基团的离子交换树脂，包括强酸-弱碱型、弱酸-强碱型和弱酸-弱碱型。,根据离子交换树脂的功能基的性质，将其分为强酸(0)、弱酸(1)、强碱(2)、弱碱(3)、螯合(4)、两性(5)和氧化还原(6)七类(各类后面的数字为其分类代号)。 离子交换树脂的骨架分为苯乙烯系(0)、丙烯酸系(1)、酚醛系(2)、环氧系(3)、乙烯吡啶系(4)、脲醛系(5)、氯乙烯系(6)七类(各类后面的数字为骨架分类代号)。 命名方法： D D 大孔树脂在名称前加D 分类代号（阴、阳、酸、碱、强、弱） 骨架分类代号 顺序号 凝胶型树脂后加*并注明交联度 举例： 0017 强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂 D001 大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂 D113大孔弱酸性丙烯酸系阴离子交换树脂,1. 以硅胶或氧化铝为吸附剂进行柱色谱分离时注意点：（1）尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解样品，或用极性稍大的溶剂溶解样品后，以少量吸附剂拌匀挥干，上柱。（2）一般以TLC展开时使组分Rf值达到0.20.3的溶剂系统作为最佳溶剂系统进行洗脱。实践中多用混合的有机溶剂系统。（3）为避免化学吸附，酸性物质宜用硅胶、碱性物质宜用氧化铝作为吸附剂进行分离。通常在分离酸性（或碱性）物质时，洗脱溶剂中常加入适量的醋酸（或氨、吡啶、二乙胺），以防止拖尾、使斑点集中。,层析小结,2. 各种层析适宜分离的物质硅胶显微酸性，适于分离酸性和中性化合物，分离生物碱时需在流动相中加入适量的有机碱。除蛋白质等水溶性成分外均可分离。氧化铝呈碱性，适于分离生物碱等碱性成分，不宜用于分离有机酸、酚性等酸性成分。可分离生物碱、胺类、萜类、甾体、苷元。聚酰胺：酚类、醌类、黄酮类活性炭。对非极性物质具有较强的亲和力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。适宜糖类、苷类、氨基酸、蛋白质等水溶性成分的分离。葡聚糖凝胶：(根据物质分子大小差别进行分离) 基本同活性炭根据物质分子 凝胶层析：用于分离大离子、小离子，大分子、小分子 离子交换树脂：(根据物质解离程度不同进行分离) 生物碱、有机酸、氨基酸,四、提取与分离中草药有效成分的注意点,(一) 光照的影响,1. 酸的影响 1),(二) 酸碱的影响,2),2. 碱的影响,(三) 温度的影响 高温、高热会引起化合物的氧化、聚合、树脂化等结构变化，颜色加深。(四) 溶剂的影响,