第9章动物基因工程课件.ppt
2022/12/20,第9章动物基因工程,第9章动物基因工程,第9章动物基因工程,第一节 动物细胞基因工程,采用哺乳动物细胞的蛋白表达具有以下主要优点：哺乳动物细胞能识别和除去外源基因的内含子，剪接加工成成熟的mRNA；哺乳动物细胞表达的蛋白质与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，加工后的蛋白质免疫原性好，约为酵母型的1620倍；哺乳动物细胞易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性；经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物分泌到培养基中，提纯工艺简单，成本低。,第9章动物基因工程,一、动物细胞表达体系 动物细胞表达系统主要由宿主细胞和表达载体两部分组成。 1 表达载体 目前常用的表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入宿主细胞内。常用的病毒载体有 ：（1）逆转录病毒（Retrovirus）载体（2）腺病毒（Adenovirus，AV）载体（3）腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）载体（4）质粒载体,第9章动物基因工程,2 宿主细胞 虽然至今批准的由动物细胞表达的产品，其宿主细胞几乎都是CHO细胞。但是在实践中，人们发现它也存在着一些不足， 因此，近来一些具有良好特征的细胞系都已被作为宿主细胞试用于真核细胞的表达系统中。,（1）BHK-21细胞 该细胞最早从地鼠幼鼠的肾脏分离，现在广泛应用的是采用单细胞分离技术经13次克隆的细胞。原始的细胞株是成纤维样细胞，并且具有贴壁依赖性，但经无数次传代后细胞可悬浮生长。,第9章动物基因工程,（2）CHO-K1细胞 该细胞是CHO细胞的一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr）的营养缺陷突变株，它可以在氨甲蝶呤(MTX）压力下使外源基因的基因拷贝数扩增，使外源蛋白质得到较高水平表达。,（3）C127细胞 该细胞来自RIII 小鼠乳腺肿瘤细胞，适用于带有牛乳头瘤病毒（BPV）载体的转染。当用BPV-1病毒载体转染后，细胞的生长形态可发生显著变化，因此转染成功的细胞可通过特有的转化形态加以识别。,第9章动物基因工程,（4）MDCK细胞 该细胞是从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离获得，是具有贴壁依赖性的上皮样细胞，已成功地在微载体上增殖。该细胞能支持多种病毒的增殖，已被用来生产兽用疫苗。,（5）Namalwa细胞 该细胞是一株人的类淋巴母细胞,来自名为“Namalwa”的Burkitt淋巴瘤患者，含有部分疱疹病毒基因，但不产生疱疹病毒。该细胞已被批准用于大规模生产干扰素，可以用无血清培养基在悬浮状态下高密度培养，可有效地表达外源基因。,第9章动物基因工程,（6）Vero细胞 该细胞是从正常的成年非洲绿猴肾分离获得的，一株具有贴壁依赖性的成纤维细胞。可持续地进行细胞培养，并可支持多种病毒的增殖并制成疫苗 。,（7）鼠骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞是“专业”的分泌细胞，在培养上清中可产生高达100mg/L的免疫球蛋白（Ig），而且容易转染，容易生长，可在无血清培养基中高密度的悬浮培养；能对蛋白质进行糖基化修饰；高效表达Ig基因的调控成分明确，有利于表达载体的增强子和启动子的合理设计。,第9章动物基因工程,（8）COS细胞 该细胞是利用复制起点缺失的SV40转染非洲绿猴肾细胞CV-1而获得，具有COS-1、-3、和-7三个细胞系。由于COS细胞来源广，易培养，易转染；能组成性表达SV40大T抗原，能使大多数哺乳动物细胞携带有复制子的质粒以附加体形式高拷贝扩增；大量扩增的质粒及其高表达的mRNA和蛋白质，容易回收和分析，因此被广泛地用于瞬时表达系统。,第9章动物基因工程,二、动物细胞表达载体的构建 目的基因在哺乳动物细胞中的表达受整合目的基因的染色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、翻译和翻译后加工修饰效率的影响。构建一个高效表达的哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位点的优化，转录翻译效率的提高以及目的基因拷贝数的增加等方面综合考虑。下面分别从转录水平和翻译水平的调控元件、整合位点的优化以及增加目的基因拷贝数等方面对此作一介绍。,第9章动物基因工程,1. 转录水平 在目的基因拷贝数一定，整合位点固定的情况下，转录作为基因表达的第一步，提高转录效率对一个高效表达载体的构建来说显得尤为重要。启动子及其相应增强子、转录终止信号及多聚腺苷酸加尾信号对转录水平的高低及mRNA的稳定性有很大影响，其中强启动子、强增强子是提高转录水平的关键因素。 在转录过程中，转录因子通过DNA 结合结构域特异识别并结合目标基因的特异调控序列，通过转录激活结构域调节或将转录作用因子募集至启动子从而启始基因的转录和表达。因此，提高宿主细胞转录因子的表达水平也能增强目的基因的表达。,第9章动物基因工程,2. 翻译水平除了转录水平的调控外， 翻译水平的调控和翻译产物的加工修饰的效率等也对目的基因的表达产生重要的影响。Ploy（A）的存在不但能影响mRNA稳定性，而且也能部分起“翻译增强子”的作用，提高mRNA 翻译水平；内部核糖体进入位点（IRES）能使同一mRNA中除第1个基因之外的其他基因也得到有效表达；翻译增强子可提高翻译效率；通过使用宿主细胞偏好的密码子来对目的基因的密码子进行优化也可以大幅度提高翻译效率。,第9章动物基因工程,3. 整合位点的优化目的基因在细胞染色体上整合位点区域的状态对于目的基因的表达与否、表达高低以及目的基因在宿主细胞中的稳定性起着决定性的作用。只有那些整合位点处于染色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的基因。因此，保证将表达载体整合在 细胞染色体上转录活跃位点的克隆被挑选出来，是提高细胞表达水平必需的一步，主要通过以下几种策略实现。,第9章动物基因工程,一是通过选择基因（如neo、dhfr）的弱化表达； 二是在载体上添加染色体上的某些特定序列，使表达载体整合到宿主细胞的染色体后能模拟染色体的高转录活跃区 ；三是先将含有定点重组位点的选择标记基因整合在染色体高表达区，然后将表达目的基因的表达载体和表达重组酶载体共转染上述带有重组位点的细胞系。,第9章动物基因工程,4 增加目的基因拷贝数单拷贝或低拷贝目的基因，无论表达载体调控元件如何优化、整合的染色体位点多么合适，其外源基因表达量都是有限的。因此，通过增加目的基因拷贝数来获得高表达重组药物的工程细胞株是基因工程药物研究中不可或缺的一步。目的基因的扩增常采用目的基因和选择标记基因共扩增的方法，,第9章动物基因工程,三、动物细胞转化方法与筛选1 基因的导入方法 在真核细胞的表达研究中，细胞转染是一个关键步骤。在基因治疗中，也需要用基因转移技术导入外源基因。因此该技术的研究已越来越受到重视，至今已开发了许多新的技术和方法。不同的细胞系，摄取和表达外源DNA 的能力可相差几个数量级。因此如果采用某种特定的细胞系，就务必比较几种不同方法的效率。当前用于DNA转染哺乳动物细胞的主要方法见下表。,第9章动物基因工程,真核细胞转染方法,第9章动物基因工程,（1）光穿孔法 光穿孔法（optoporation）是利用激光产生的热量，使细胞壁产生孔洞，将外源物质导入细胞。（2）冲击波法 冲击波法（shock wave permeabilization）是利用细胞受冲击后细胞膜通透性瞬时增加，使外源基因导入细胞。（3）基因枪法 基因枪（gene gun）法又叫微粒轰击法、生物发射技术或高速微粒子发射技术。通过提供给包裹有DNA 的微小金颗粒(或钨粉)很高的初速度，使其穿透植物细胞壁而达到转移外源质粒子DNA 的目的。,第9章动物基因工程,（4）电穿孔法 电穿孔(Electroporation)是指在高压脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，从而导致不同细胞之间的原生质膜发生融合作用的细胞生物学过程。（5）磷酸钙转染法 磷酸钙转染法（calcium phosphate co-precipitation）是把含外源基因的质粒或已克隆化的基因作为转染物，与磷酸钙转染液混合，加入到宿主细胞的培养环境中，在磷酸钙转染液的媒介下能使转染的DNA被整合到受体细胞的基因组中。,第9章动物基因工程,（6）二乙铵乙基葡聚糖介导法 该方法是带正电的二乙铵乙基葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞。（7）脂质体法 脂质体（liposome encapsulation）是由天然脂类和类固醇组成的微球， 脂质体转染法可能的机理是阳离子脂质体与带负电的基因依靠静电作用形成脂质体基因复合物，该复合物因阳离子脂质体的过剩正电荷而带正电，借助静电作用吸附于带负电的细胞表面，再通过与细胞膜融合或细胞内吞作用而进入细胞内，脂质体基因复合物在细胞质中可能进一步传递到细胞核内释放基因，并在细胞内获得表达。,第9章动物基因工程,（8）抗体转染法 利用抗体作为载体，介导基因进入表达特定表面抗原细胞的方法为抗体转染（antifection）。（9）其他 其他有超声波法，它的生物学效应是空化作用，超声过程中形成的真空气旋在塌缩时产生局部高温、高压使气泡周围的细胞受到影响，细胞膜发生可逆的通透性变化。其他外源DNA导入动物细胞的方法还有，微注射法（microinjection）、原生质体融合法（protoplast fusion）和病毒感染法（viral infection）等。,第9章动物基因工程,2 哺乳动物基因转移的遗传选择标记,（1）胸苷激酶基因（tk）选择系统 胸苷激酶 (thymidine kinase)是核苷酸合成代谢途径中的一种酶，能将胸苷转换成为胸苷-磷酸。 在胸苷激酶基因选择系统中，必须用tk表型缺陷型(tk-)细胞株作为宿主细胞。由于选择tk+细胞的培养基含有次黄嘌呤(hupoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(thymidine)，所以叫做HAT选择法。,第9章动物基因工程,其选择原理为：如果用叶酸的类似物氨基蝶呤(A)处理细胞，二氢叶酸还原酶被抑制，不能使二氢叶酸还原成四氢叶酸，其结果是培养基中的四氢叶酸因得不到补充而逐渐耗尽，于是从dUMP合成TTP以及dATP和dCTP的合成过程均被阻断。次黄嘌呤是dATP和dACP补救合成途径的一种底物，培养基中含有这种物质时，细胞就能越过氨基蝶呤的抑制作用，利用补救途径继续合成出这些核苷酸。,第9章动物基因工程,（2）二氢叶酸还原酶基因(dhfr)选择系统,DHFR-MTX高效表达系统,外源基因,dhfr,转染dhfr -细胞系,单克隆,培养,转移,0.05 mM MTX(氨甲喋呤),培养,单克隆,转移,培养,单克隆,转移,5 mM MTX,0.25 mM MTX,培养,单克隆,外源基因扩增至100拷贝,第9章动物基因工程,（3）新霉素抗性选择系统,新霉素是细菌抗生素，它可以干扰原核生物的核糖体，使其蛋白质合成不能正常进行，新霉素的一种类似物G418(geneticin)对真核细胞和原核细胞均有毒性。细菌的新霉素抗性基因(neo)能在真核细胞中表达，当neo基因与能有效转录的真核DNA序列连锁时就能获得有效的表达。Neo基因编码一种磷酸转移酶，这种酶能使G418失活。所以，当细胞表达了这种neo抗性基因后，就会在含G418的选择培养基中存活，这种选择系统适用于所有的细胞类型。,第9章动物基因工程,第二节 转基因动物,转基因动物（技术）是以动物个体作为基因受体的基因表达技术。目的基因导入动物体之后，其行为和表达调控与导入离体培养的动物细胞系有很大差别。所以，即使单纯出于研究目的，动物细胞系也不能替代转基因动物。,第9章动物基因工程,一、转基因动物概念 目前，对于转基因动物还没有一个简单而明确的定义。为了正确理解什么是转基因动物，在这里我们只强调所有转基因动物都是由于外源基因（包括同一物种的DNA）导入动物的基因组而产生了可以遗传的改变。这些可以遗传的改变包括：外源基因片段至少整合到一条染色体的一个位点上；外源基因的插入使基因组中任何一个基因的结构发生改变；外源基因的插入使染色体发生重排；外源基因导入可以持久存在的遗传实体 等,第9章动物基因工程,二、哺乳动物的转基因操作,表 9-3 几种转基因技术效果比较,第9章动物基因工程,1. 显微注射法,显微注射法的具体做法是，在一台倒置相差显微镜下，用一根直径80100m的细玻璃管将胚胎固定，再用另一根直径15m 的玻璃管刺入细胞原核，把DNA溶液直接注射到原核期胚胎的一个或两个原核中。经过显微注射DNA的胚胎经过13小时培养，证明未因显微注射而发生裂解后，即可直接移植到代受体母畜的输卵管中；也可以转移到适当培养液中，让它们继续发育到桑椹胚或囊胚阶段，然后再进行胚胎移植。,第9章动物基因工程,第9章动物基因工程,2. 利用体细胞核移植制备转基因动物核移植(nuclear transfer，NT)通常是指将外源性细胞核作为供体转入到去核卵母细胞中，细胞核发生基因程序重排而获得多能性，开始新的胚胎发育。,第9章动物基因工程,3. 胚胎干细胞法,第9章动物基因工程,4. 逆转录病毒载体法,先将外源基因克隆到转移载体中，将克隆好的转移载体转入包装细胞中形成有感染活性的逆转录病毒载体，再去感染生殖细胞、早期胚胎或显微注射受精卵。,第9章动物基因工程,5. 精子介导的基因转移,1989年，Lavitrano等人首次报道使用小鼠附睾精子携带外源DNA受精，生产出表达外源基因的转基因小鼠。从1987年到1998年，用精子介导法生产出许多转基因动物，表明精子介导是一种有用的转基因方法。但是精子介导法目前尚未弄清楚其真正的机理，使精子携带DNA的条件难以掌握，实验结果不很稳定，需要进一步研究。,第9章动物基因工程,三、 外源基因的整合与表达 1. 外源基因的整合（1）外源基因整合的机制,第9章动物基因工程,（2）专一位点重组,第9章动物基因工程,2 外源基因的表达,（1）导入大片段 酵母人工染色体(YAC)载体是近年来发展起来的新型载体，可插入长达200-500kb的外源DNA。利用其导入外源基因在整合时不存在位置效应，因为YAC载体的大容量能保证巨大基因的完整性，保证所有顺式作用因子的完整性。因此目的基因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基因整合后的“位置效应”而引起缓冲区域的作用，从而提高外源基因的表达水平,第9章动物基因工程,（2）添加基质附着区 基质附着区(Matrix Attachment Region，MAR)又称核骨架附着区(Scaffold Attachment Region，SAR)，其基本功能是将染色质的环状域附着到称为核基质的蛋白质支架上，构成基因组中各个功能域的边界，相当于基因组中的“标点符号”。已有的研究表明，MAR与外源基因构成的功能域导入细胞后，在核内游离状态下(即整合前)，MAR会抑制所连接基因的表达，但在整合状态下，MAR可以使外源基因克服位置效应，实现高表达，且不受MAR整合方向的影响，也基本上不受MAR与基因间距离的影响。,第9章动物基因工程,（3） 利用具有组织与发育特异性调控作用的启动子和增强子启动子是RNA聚合酶进行精确有效转录必需的。为实现外源基因在转基因动物中的高表达，如何选配设计启动子是一个关键的环节，对于非特异性表达的基因而言，可选用组成型或广谱型启动子，而对特异性表达的基因，所选用的启动子必须具有严格的时空作用特异性。,第9章动物基因工程,（4） 添加内含子 研究中发现，内含子对于该基因的表达是必需的，而采用cDNA构件，由于缺乏内含子，而在转基因鼠中未能激活。在另一组研究者的试验中发现，采用含有内含子的基因组构件比采用cDNA提高表达 l0100倍。关于内含子提高表达效率的机制，可能是由于以下几方面的原因：内含子的剪接可增加mRNA在核内的稳定性，导致在细胞质中积累更多的成熟mRNA；某些内含子含有增强子或其它顺式作用元件的功能，它们同某些蛋白质结合影响转录的起始和延伸；有的内含子可能含有能开放染色体的功能域，可通过影响核质成分、位置等来提高转基因动物的表达。,第9章动物基因工程,（5）利用基因打靶系统实现染色体定位整合 基因打靶技术是利用外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点上，从而改变细胞遗传特性的方法。（6）加入基因座控制区 基因座控制区(locus control region, LCR)是染色体DNA上一种顺式作用元件，结构域中含有多种反式作用因子的结合序列，可能参与蛋白质因子的协同作用，使启动子处于无组蛋白状态。因此，在构建转基因表达结构时，若将基因座位控制区包括在内，将会使目的基因在转基因动物中实现不依赖整合位点的、组织特异性的和高效的表达。相反，没有基因座位控制区，被转移的基因将会受到邻近的基因调控元件的影响，产生位置效应，而影响表达。,第9章动物基因工程,第三节 动物转基因技术的应用前景,一、基因功能的研究 目前我们所知道的基因的功能，主要是通过研究自然突变得来的。通过研究自然突变，人类不但知道了许多基因的功能，而且通过筛选积累有利突变，去掉有害突变。近20年来，通过小鼠的定位整合技术，发现了许多未知基因的功能和许多已知基因的新功能。运用新技术，不仅可以研究基因的功能，还可以用来研究某个代谢通路甚至某一个生物学问题。总而言之，未来的转基因动物的研究不会局限于生产某一种对农业或医学有重大经济价值的动物品系或品种，越来越多的研究将要针对生物学本身，并将得出比小鼠研究更为准确的结果。,第9章动物基因工程,二、在农业上的应用 1. 动物遗传资源的保存保存现有的动物遗传资源是一件十分紧迫的事，也是一件十分困难的事。自从体细胞克隆技术问世后，动物品种资源的保存出现了希望。现在一只动物的体细胞可以保存在几支冻存管中，一个动物品种或动物物种可以保存在一个小盒内。因此，动物物种的保存技术，将在未来的510年内彻底解决，由此而使得动物遗传资源多样性保护这样一个涉及人类社会未来发展的大课题得以完成。,第9章动物基因工程,2. 扩大特别优良的家畜个体在生产中的作用 体细胞克隆技术的出现为充分利用特别优良的家畜个体提供了新的有效手段，在充分发挥优良母畜在畜群中的作用方面是革命性的技术变革。体细胞克隆技术的核心作用，是可以把一头特别优良的动物个体的一个细胞变成与这头动物特性完全相同的动物拷贝。从理论上说，通过克隆技术可以把一个动物个体拷贝成亿万个个体。当然，在实践中必须考虑保持遗传的多样性，即便是特别优良的个体，也还是要进行有计划的复制。未来随着体细胞克隆技术体系的进一步完善，其选材方便灵活的优势将会得到充分的发挥，并将取代现行的胚胎移植技术。,第9章动物基因工程,3. 动物的基因改良 转基因动物研究的一个重要目标就是对动物进行基因改良，有了体细胞克隆技术，我们就可以应用基因定位整合技术对内源基因进行精确的修饰，提高或降低它们的表达水平，甚至将某些基因从基因组中完全敲除。此外，还可以用设计的各种基因修饰先生产出动物样品来进行比较，看一看哪一种基因修饰方法比较好，然后再用比较好的基因修饰方法大量生产动物，以达到基因改良的目的。这种技术发展到它的高级阶段，就会像设计机器一样，人为地设计动物的生命，成为生命设计技术。,第9章动物基因工程,三、在医学上的应用1. 利用转基因动物生产人用器官移植的异体供体 器官移植已成为现代医学领域一个不可缺少的组成部分。但是器官供体来源却严重不足，而且随着人非正常死亡的逐渐减少及人寿命的延长，人供体器官将更加贫乏。在这样的情况下，使人们不得不重视异种移植的研究，现在，体细胞基因定位整合技术和克隆猪的技术均已获得成功，已不存在妨害这项技术发展的重大障碍。,第9章动物基因工程,2. 动物乳腺生物反应器 随着基因工程技术的运用，一些药用蛋白产品亦可以通过转基因的哺乳动物细胞来生产。但是用动物细胞生产则成本高，难以满足需求。而用动物作为生物反应器正好满足了这些要求。克隆技术可以将离体培养的、基因定点修饰后的动物体细胞转变成动物个体，可以很好的解决动物转基因效率低和基因表达方面的问题。因此，采用以体细胞克隆技术为核心的各种技术平台，可能是未来生产动物乳腺生物反应器动物的希望和必然趋势。,第9章动物基因工程,3. 转基因动物在病毒研究方面的应用 病毒感染的过程是通过与敏感细胞表团的受体相结合。许多人类致病病毒只感染人和灵长类动物，这给研究带来很大困难。 病毒受体的研究对于了解病毒与宿主的关系以及设计抗病毒药物都是很必要的。研究证实，多数病毒受体并不是单一的病毒表位与细胞表面某一蛋白间的简单识别与结合，病毒与细胞受体间相互作用是个涉及多种结构的错综复杂的过程。病毒受体不只是病毒吸附的位点，它们在病毒的穿入、脱衣壳及进入细胞特定部位等过程中也起重要作用。所以含有病毒受体基因的转基因小鼠成为研究病毒致病机制，抗病毒治疗及疫苗评价的新动物模型,第9章动物基因工程,小结 动物基因工程包括动物细胞基因表达技术和动物转基因技术两个方面。 动物细胞基因表达技术主要利用动物工程细胞大规模生产蛋白多肽物质或作为药物筛选研究的体外评价模型。动物细胞表达系统主要由表达载体和宿主细胞两部分组成，表达载体分为病毒载体与质粒载体，而宿主细胞以CHO细胞最为常用，此外也发展了一些性能良好的细胞表达系统。,第9章动物基因工程,动物转基因技术是利用转基因动物个体进行哺乳动物遗传性状的改良或作为药物筛选研究的体内评价模型及人体的基因治疗。目前，几种常用的转基因技术包括：显微注射法、慢病毒载体法、精子介导法、胚胎干细胞法、体细胞核移植等。外源基因转入动物体内后，还需要进一步整合到宿主动物基因组的适当位置才能实现特异表达。,2022/12/20,第9章动物基因工程,演讲完毕，谢谢听讲!,再见，see you again,3rew,
