黄酮3常规分离法课件.ppt

知识链接：提取液的浓缩方法P13,提取所得到的是一个庞大的混合物，如果要得到更多的成分，或者要系统地研究一味中药中的化学成分，则需经过比较复杂的过程，一般是经过初步分离纯化，得到某一类型的总成分（混合物），或者得到极性相近的一混合物，再经过进一步分离得到单体成分。分离方法有很多种。,一般提取方法（如渗漉法、回流提取法）得到的提取液体积较大，所含成分浓度低，不利于分离纯化。 为了提高浓度，节省分离纯化的时间和减少工作量，要对提取液进行浓缩。 浓缩可通过蒸发或蒸馏完成。 要避免热敏性成分被破坏,浓缩常用方法有：,蒸发常压蒸馏法减压蒸馏法薄膜蒸发法反渗透法超滤法,常压蒸馏法 适用于溶剂沸点低、有效成分受热不易分解的提取液的浓缩，如氯仿、乙醚、石油醚等的提取液。注意火源。减压蒸馏法 适用于溶剂沸点高，有效成分受热易分解的提取液的浓缩，一般当溶剂沸点超过70时，可采用减压浓缩。,HPLC色谱,（二）分离,分离依据： 成分(黄酮与杂质、苷与苷元 、苷元与苷元)之间的极性（分配系数K）差异。,分离依据： 游离黄酮类化合物的酸性差异。,H梯度萃取法,溶剂萃取法,柱色谱法,常用聚酰胺和硅胶色谱。（1）聚酰胺柱色谱（首选法） 洗脱顺序（含水溶剂：乙醇-水等） 苷元相同：叁糖苷双糖苷单糖苷苷元（酚羟基比例） 母核上羟基越多，洗脱越慢（酚羟基数量） 酚羟基数量相同：邻羟基的对（间）羟基的（酚羟基的位置） 芳香核、共轭双键越多，洗脱越慢（酚羟基所处母核的共轭程度） 不同苷元： 异黄酮二氢黄酮醇黄酮黄酮醇 母核共轭程度较后两者小 ， 后者比前者多一个羟基。（2）硅胶柱色谱 洗脱顺序：羟基越多，极性越大，越后洗出（不分醇羟基、酚羟基）,适用于各种黄酮类化合物的分离。原理：反相柱色谱（黄酮类化合物极性大）固定相：ODS流动相：水-乙晴不同比例。,知识链接：常规分离技术,一、 系统溶剂分离技术,依据“相似相溶”的原理，按极性由小到大的顺序依次提取分离总提液中各种溶解度有差异的成分。 石油醚、己烷挥发油、脂溶性色素、蜡 乙醚、氯仿生物碱、苷元 乙酸乙酯黄酮苷 正丁醇皂苷、蒽醌苷 甲醇、乙醇苷、糖类、生物碱盐,1、系统溶剂分离法的操作,总提取物浓缩，拌入吸附剂,苯,石油醚,乙醚,氯仿,乙酸乙酯,正丁醇,常用的溶剂与用该溶剂提取出的中药化学成分的对应关系,选用的溶剂 提取出的中药成分 石油醚、己烷 挥发油、脂肪油、腊、脂溶性色素、 甾醇类、某些苷元（强亲脂性） 乙醚、氯仿 极性 生物碱、树脂、醛、酮、醇、酯、苷 元、有机酸、某些苷类 氯仿：乙醚 由 某些苷类，如强心苷 乙酸乙酯 小 某些苷类，如黄酮苷 正丁醇 到 某些苷类，如皂苷，黄酮苷 丙酮、乙醇 大 极性很大的苷、糖类、氨基酸、某些 生物碱盐 水 蛋白质、黏液质、果胶、糖类、无机盐 （强亲水性）,2、适用范围 此法是早年研究天然药物有效成分的一种最重要的方法，主要用于分离提纯含有极性不同的各种化学成分的中药提取液。目前仍是研究成分不明天然产物最常用的方法。 3、优缺点 此法操作繁琐，对化学性质不稳定，容易引起分解、异构化的天然产物应特别注意。在微量成分、结构性质相似成分的分离纯化上受到很大限制。,二 两相溶剂萃取法 P15,（一）基本原理,定义：简称萃取法，往提取液中加入一种与其不溶的溶剂配成两相溶剂系统，利用混合物中各种成分分配系数k的差异而达到分离方法。萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。,分配系数（K） 当物质在两相互不相溶的溶剂中（如水和丁醇，氯仿），于分液漏斗中充分振摇，放置后，即可分为两层，此时，溶质将分别溶于两层溶剂中，并在一定温度，压力下为一常数，此时，溶质在两层溶剂中的浓度比值为一常数（K），用公式表示如下：,K=CU/CL CU：上层浓度，CL：下层浓度。 若有两种成份时（A，B），则A，B各有其分配系数KA，KB，则两者差别越大，分离效果越好。 如，KA10说明振摇一次平衡后，A则有90以上溶于上层溶液中。 而KB0.l时，振摇一次平衡后，B则有90以上溶于下层中，过样A和B两成份就有较大程度分离，连续分离萃取几次，就可能达到A，B的全部分离。 若有多种成份时，分离情况将更复杂。,两成份的分配系数差别越大，两者就越容易分离。因此两成份的分配系数比就可以反应其分离的难易程度，过个比值称为分离因子（），用公式表示为： KA /KB 一般说；100 一次萃取就可以实现基本分离， 10010 则需萃取1012次， 2需连续萃取100次以上，才能基本分离， 1时，则KA=KB两者性质相近，无法分离。,简单萃取法操作：仪器：分液漏斗（少）、下口瓶（中）、萃取缸（大）操作：旋塞涂润滑剂装入溶剂和待萃取物（1/3）盖塞子，倒转分液漏斗，开启旋塞排气后关紧振摇，注意排气（重复数次）于铁架台静置分层分取萃取液注意事项：1.水提取液的密度：1.11.22.萃取次数：343.萃取溶剂用量：1/21/3（第一次）；1/41/64.避免产生乳化现象,萃取剂的选择,有机溶剂作萃取剂（水提取）。 如从水提液中萃取亲脂性性成分，一般选用苯、氯仿、 或乙醚等有机溶剂； 如从水提液中萃取中等极性成分，一般选用乙酸乙酯、丁醇等弱亲脂性有机溶剂或在氯仿、乙醚中加入适量乙醇以增大其亲水性。用pH梯度萃取法的萃取剂（有机溶剂提取） 用pH梯度萃取法的萃取剂分离某有机溶剂中的黄酮类化合物，可依次选用pH由低到高的碱液如5%碳酸氢钠、5%碳酸钠、0.2%氢氧化钠、4%氢氧化钠的水溶液做萃取剂进行萃取，使成盐而达到分离目的,相似相溶,互不相溶,适用范围,适用于分配系数差异较大的成分的分离，一般萃取34次即可。若亲水性成分不易转入有机溶剂层，需增加萃取次数或更换萃取溶剂。,乳化形成原因 氯仿萃取乳化的预防： 小量实验 将振摇改旋转混合 改用氯仿-乙醚混合溶剂萃取 加大有机溶剂量,乳化现象的处理：,长时间放置金属丝搅动乳化层抽滤乳化层加热或冷冻,加新溶剂萃取加电解质加醇数滴离心,黄酮类萃取法分离依据,1、溶剂萃取法分离依据 成分(黄酮与杂质、苷与苷元 、苷元与苷元)之间的极性（分配系数K）差异。2、PH梯度萃取法分离依据： 游离黄酮类化合物的酸性差异。,减压蒸馏、萃取法录像演示,知识链接与拓展,沉淀法,酸碱沉淀法,铅盐沉淀法,试剂沉淀法,酸溶碱沉法,水提醇沉法,碱溶酸沉法,醇提水沉法,中性醋酸铅法,碱式醋酸铅法,沉淀法： 是在天然药物的提取液中加入某些试剂，与其中成分发生沉淀反应生成沉淀或降低其溶解性而从溶液中析出，从而获得有效成分或去除杂质的方法。条件： 采用沉淀法分离化合物，若生成沉淀的是有效成分，则要求沉淀反应必须是可逆的；若沉淀物为杂质，则沉淀反应可以是不可逆的。,酸碱沉淀法的基本原理,利用某些成分在酸（或碱）中溶解，继而又在碱（或酸）中生成沉淀的性质达到分离的方法。这种沉淀反应是可逆的，可使有效成分与其它杂质分离。,酸沉淀与碱沉淀各自的沉淀范围,酸沉淀：适用于分离提纯酸性、碱性或两性有机化合物，如黄酮、蒽醌类酚酸性成分等。 碱沉淀：适用于分离提纯碱性或两性有机化合物，如一些生物碱、蛋白质等。,应用实例槐米中芸香苷的提取 芸香苷是黄酮苷类化合物，显弱酸性，可溶于碱液中，加酸酸化后析出结晶，提取可采用碱提酸沉法。黄连中盐酸小檗碱的提取 小檗碱是生物碱，通过稀硫酸水溶液提取小檗碱硫酸盐，再用浓盐酸转化为小檗碱盐酸盐（冷水溶解度小）析出。,试剂沉淀法的基本原理,利用某成分能与某些试剂产生沉淀的性质或利用某些成分在不同溶剂中溶解度的差异，通过加入特定试剂或溶剂，使生成沉淀，而与其它成分分离。,醇沉淀与水沉淀各自的沉淀范围,醇沉淀：适用于含蛋白质、淀粉、粘液质、树胶等杂质的药材的提取和精制； 水沉淀：适用于色素、树脂、油脂、叶绿素等杂质多的药材的提取和精制。,与试剂发生沉淀反应而分离 生物碱沉淀试剂 雷氏铵盐和水溶性季铵碱 胆甾醇与甾体皂苷 加入试剂后改变混合液的极性、减小某些成分的溶解度而沉淀分离 水提醇沉法（除多糖、黏液质等水溶性杂质） 醇提水沉法（除树脂、叶绿素等水不溶性杂质） 醇提醚沉法或醇提丙酮沉淀法：分离皂苷,试剂沉淀法,水提醇沉的操作要点如下：药液浓缩时最好采用减压、低温，浓缩前后视情况调pH值，以保留更多的有效成分。以分次方式或梯度递增方式加入乙醇，逐步提高乙醇浓度，当药液中乙醇浓度达75%以上时，可使蛋白质、淀粉、黏液质、油脂、树脂、树胶等杂质沉淀而出去。加乙醇后，将容器口盖严，防乙醇挥发。自然降至室温，再移至冷库中静置1224 h。,试剂沉淀法,醇提水沉法的操作要点：先用乙醇提取，树脂、油脂、色素等杂质可溶于乙醇而被提取出来。 醇提取液回收乙醇。加水搅拌，静置冷藏一定时间。待完全沉淀后滤过去除。,铅盐沉淀法的基本原理,利用中性醋酸铅和碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中，能与许多天然药物化学成分生成难溶性的铅盐或铅络合物沉淀，使有效成分与杂质分离。,中性醋酸铅与碱式醋酸铅各自的沉淀范围,中性醋酸铅：适用于沉淀具有羧基、邻二酚羟基的酸性或酚性物质； 碱式醋酸铅：除可沉淀上述物质外，还可沉淀部分大分子中性物质和少数碱性很弱的生物碱。,酸碱沉淀法的基本原理,利用某些成分在酸（或碱）中溶解，继而又在碱（或酸）中生成沉淀的性质达到分离的方法。这种沉淀反应是可逆的，可使有效成分与其它杂质分离。,酸沉淀与碱沉淀各自的沉淀范围,酸沉淀：适用于分离提纯酸性、碱性或两性有机化合物，如黄酮、蒽醌类酚酸性成分等。 碱沉淀：适用于分离提纯碱性或两性有机化合物，如一些生物碱、蛋白质等。,脱铅的方法,硫化氢法,中性硫酸盐法,阳离子交换树脂法,硫化氢法脱铅最为常用，将铅盐沉淀悬浮于水或稀醇中，通入硫化氢气体，使其分解并使铅转为不溶性的硫化铅沉淀（脱铅），中药成分留在母液中，硫化氢法脱铅彻底，但脱铅液需通入空气或二氧化碳驱除干净剩余的硫化氢。,阳离子交换树脂法脱铅快而彻底，但溶液中某些有效成分的阳离子也可能被交换到树脂上，造成吸附损失，且用于脱铅后的树脂再生困难。,中性硫酸盐法常加入硫酸钠等中性硫酸盐，因生成的硫酸铅在水中有一定溶解度，故脱铅不彻底。,