天然产物抗菌、抗病毒活性的原理与评价方法课件.ppt

2022/12/19,第四次课,天然产物抗菌活性的原理与评价方法天然产物抗病毒活性的原理与评价方法,2022/12/19,天然产物的抗菌活性与评价,2022/12/19,常用术语,抗菌谱(antibacterial spectrum)：药物抑制或杀灭病原微生物的范围称抗菌谱。抗菌活性：指药物抑制或杀灭病原微生物的能力。能够抑制培养基内细菌生长的最低浓度称最低抑菌浓度（MIC）；能够杀灭培养基内细菌的最低浓度称最低杀菌浓度（MBC） 。抑菌剂/杀菌剂：抗生素后效应（postantibiotic effect,PAE）,是抗菌药物对细菌特有的效应。指抗菌药物与细菌短暂接触，当药物浓度下降至最低抑菌浓度以下甚至消除后，细菌生长仍受到持续抑制的效应。一般讲，PAE较长的药物，其抗菌活性较强，可适当延长用药时间间隔，而疗效不降。,2022/12/19,抗菌药物的开发,理想抗菌药物：对病原体有高度选择性；不易产生耐药性；对人体毒性低；能增强机体的防御机能。,2022/12/19,抗菌药物的作用机制,抑制细菌细胞壁的合成 如-内酰胺类万古霉素等。影响细胞膜通透性 如多粘菌素、两性霉素B等。抑制蛋白质合成 如氨基甙类、四环素类、红霉素、氯霉素等。抑制核酸代谢 如利福平、喹诺酮类。影响叶酸代谢 如磺胺类、甲氧苄啶等。,2022/12/19,抗菌药物的作用机制,2022/12/19,细菌的耐药性,耐药性又称抗药性，系细菌与药物多次接触后，对药物敏感性下降甚至消失。细菌产生耐药性的途径有： 产生灭活酶 改变药物靶位结构 降低胞浆膜通透性 改变代谢途径。,细菌产生抗生素灭活酶，从而使抗菌药失去抗菌活性。灭活酶有两种：一种为水解酶，另一种为钝化酶,细菌体内靶位结构的改变，细菌体内药物受体和靶酶蛋白质构型发生变化，不利于抗菌药物结合,细菌细胞膜的通透性发生改变，使抗生素不易进入，从而不能发挥疗效,细菌改变自身代谢途径或对药物具有拮抗作用的底物浓度增加。,2022/12/19,天然产物的抗菌活性,具有抗菌活性的天然产物组分萜类(异戊二烯聚合物): 影响细菌的呼吸作用及细胞膜功能, 从而起到抑菌的作用。黄酮化合物特别是异黄酮化合物对金黄色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌及枯草杆菌具有很强的抗菌作用。广谱抗菌活性。生物碱对大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌、枯草杆菌和白色葡萄球菌的生长均有明显的抑制作用。苷类、皂甙、醌类、香豆素、木脂素、芪类、酯类、酚类、醛类、醇类、甾类、有机酸及精油类等化合物。,2022/12/19,天然产物抗菌活性的评价方法,体外抗菌活性评价药物活性评价的第一步说明药物对细菌的直接抑制或杀菌作用仅用于测定药物对细菌固有的敏感性，以最小抑菌或最小杀菌浓度为指标。受制剂纯度的影响较大。,2022/12/19,天然产物体外抗菌活性的实验设计,实验菌株的选择金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、化脓性链球菌、粪链球菌（好氧、革兰氏阳性菌）大肠杆菌、肺炎杆菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、淋球菌（好氧、革兰氏阴性菌）脆弱类杆菌、坏死梭形杆菌、溶组织梭状芽孢杆菌（厌氧菌）,2022/12/19,天然产物体外抗菌活性的实验设计,待测样品的制备要求注意无机离子浓度、pH、干扰物质、鞣质和蛋白质对结果的影响。体外抗菌实验方法纸片扩散法、琼脂稀释法、肉汤稀释法等。观察指标细菌生长（菌落生长）、细菌含量（浊度）、活菌（活组织光密度）。,2022/12/19,天然产物体外抗菌活性的实验设计,纸片扩散法抑菌圈直径的大小可以用来表征抑菌药液效果的显著与否。一般是将供试菌先接种在培养基表面，再挖小孔或放置钢圈，并在孔内加抑菌液，药液便向周围培养基扩散。培养后，有抗菌作用的药液就会在小孔周围形成清楚的抑菌圈。菌种转接：琼脂平板肉汤液体培养基肉汤琼脂培养基画线接种。待测样品给药：用滤纸片沾定量的药液，放置在肉汤琼脂培养基表面，轻压纸片与培养基适当接触。 孵育与检测：37 C ,18-24hr。测量抑菌圈的直径。,2022/12/19,天然产物体外抗菌活性的实验设计,肉汤稀释法待测样品的配制：待测药品用肉汤培养基作对倍系列稀释。接种与孵育： 菌液与含药肉汤培养基混匀，37 C ,18-24hr。检测：1）以浊度为检查试管中有无细菌生长，以不显示浊度、细菌未生长的那一管的药液稀释度作为最小抑菌浓度MIC (minimal inhibitory concentration)。2）将无肉眼可见生长的试管中肉汤画线接种于琼脂平板， 37 C 18hr孵育后以平板上菌落生长数10个的药物浓度作为最低杀菌浓度MBC (minimal bactericidal concentration)。,2022/12/19,天然产物体外抗菌活性的实验设计,对厌氧菌抗菌作用的体外评价类似肉汤稀释法，用特殊营养培养，接种菌量宜大，厌氧培养。体外抗菌活性的其它方法平皿打洞法、挖沟灌药法、杯管法、滤纸条法等。,2022/12/19,天然产物体外抗菌活性评价（例）,陆志科, 谢碧霞.不同种竹叶的化学成分及其提取物抗菌活性的研究.西北林学院学报2005, 20 (1) : 4952菌液制备：菌种活化后挑取菌苔,用无菌水分别制成含菌数约106 F/mL 的菌悬液。给药：滤纸片法。用打孔器将滤纸打成若干直径为6 mm的圆形滤纸片,经干热灭菌后,浸在竹叶提取物水溶液中。分别将0. 1 mL供试菌悬液或孢子悬液加入到琼脂平板，然后用无菌涂布器涂布均匀。再用无菌摄子夹取浸有竹叶提取物的滤纸片贴在上述各种含菌平皿上,滤纸片在每个平皿内间隔一定的距离贴3片,并用浸有无菌水的滤纸片做对照。然后将各皿放入各种菌适宜的温度培养。取出后,测量其抑菌圈直径的大小。,2022/12/19,天然产物体外抗菌活性评价（例）,何峰, 余龙江，杨英, 周蓬蓬.链霉菌H03 发酵液提取物的抗菌活性研究,微生物学杂志2005 年11 月第25 卷第6 期 最小抑菌浓度MIC 的测定：采用二倍稀释法测定提取物的MIC。 将配制好的PDA 培养基和LB 培养基分装至试管中,每支试管2 mL ,每9 支为一组,灭菌后备用。取上述样品溶液(2. 0 mg/ mL) 2 mL 于每组第1 支试管中,摇匀后从第1 支试管中取2 mL 至第2 支试管中,如此稀释直至第8 支试管,这样每操作1次,提取物就被稀释1 倍,一共被稀释了8 次,形成了8 个浓度梯度,试管中提取物对应的浓度分别为1. 0 、0. 5 、0. 25 、0. 125 、0. 062 5 、0. 031 25 、0. 015 625 、0. 007 825 (单位均为mg/ mL) 。第9支试管为对照,不加样品只加指示菌液。然后在含LB 培养基的各组试管中分别加入常见病原细菌0. 2 mL ,其中各种菌液的接种浓度约为107 108 CFU/ mL 。最后将试管置于28 培养箱中培养。细菌培养24 h 、真菌培养72 h 后观察。,2022/12/19,天然产物抗菌活性的评价方法,动物体内抗菌活性评价用以观察宿主、细菌、药物三者相互作用的动态过程，药物通过机体代谢，其中间产物或终产物可能具有抑菌或杀菌作用。药物对感染动物的预防和治疗作用，不仅能反映药物对细菌的固有直接作用，还能反映药物对机体反应性的影响。是判定有无临床价值的主要指标。试验结果与动物的种属、菌株的毒力、接种菌量和感染途径密切相关。,2022/12/19,天然产物体内抗菌活性评价的实验设计,实验动物的选取一般用小鼠，观察细菌全身致死性感染的死亡或存活情况。特殊的动物模型需要其它的动物，如家兔的脑膜炎、感染性角膜炎、大鼠的肾炎等。在小鼠的致死性感染实验中，可结合多种致敏措施，如用3的猪胃粘蛋白将细菌配制成悬浮液后腹腔注射0.5ml/鼠；感染前给实验动物注射的可松以降低机体抵抗力。,2022/12/19,天然产物体内抗菌活性评价的实验设计,实验菌种小鼠全身性感染模型应选用对人致病力强的菌株，可通过动物体内传代而增强或保持其毒力。若用粘蛋白增敏，则可取1份肉汤稀释菌液与9份5粘蛋白混合，但须同时作单独粘蛋白对照，对照小鼠不得有死亡。记录各剂量组小鼠于两周内的死亡数，引起动物全部死亡的最低细菌量为最小致死量（MLD）,2022/12/19,天然产物体内抗菌活性评价的实验设计,给药不宜注射给药，一般应灌服给药。剂量不足，难以达到体内抗菌效果，剂量过大，引起毒性并降低机体抵抗力，需同时给予数个剂量以观察药效。以预防性给药为主，即连续给药数日后再行感染，并连续给药至感染后数日。,2022/12/19,天然产物的体内抗菌活性评价（例）,刘明亮,郭慧元.妥舒沙星前药的合成及其体内抗菌活性.中国抗生素杂志,2004 , 29 (10 ):590-597试验用药均用0.9% 生理食盐水配制, 每个化合物均设5 个剂量组。将实验动物按性别、体重随机分组, 每组10 只小鼠, 雌雄各半, 对小鼠腹腔注射100% 最小致死量的感染菌液感染后, 分别给小鼠口服灌胃、静脉注射和皮下注射不同浓度的试验用药液, 口服给药时则4h 后再灌胃一次, 同时设感染对照组, 记录感染后7d 内小鼠死亡数, 按Bliss法计算半数有效剂量ED50及95% 可信限。,2022/12/19,天然产物的体内抗菌活性评价（例）,2022/12/19,天然产物的抗病毒活性与评价,2022/12/19,前 言,病毒感染：人类传染病约75是由病毒引起的，其中严重危害人类健康者有流感、艾滋病、病毒性脊髓灰质炎、乙型脑炎、肝炎、麻疹、非典型肺炎、天花、狂犬病等。化疗药物：目前临床所用的抗病毒化学药物大多毒性较大，且临床疗效有待提高。免疫疗法：医学史上曾成功地用疫苗接种的方法预防可怕的流行性病毒感染性疾病（如天花、麻疹、脊髓灰质炎、狂犬病等）。生物制剂在抗病毒感染中的地位：疫苗、干扰素和干扰素诱导剂等在病毒感染性疾病的治疗与预防方面仍然占有极其重要的位置。,2022/12/19,病毒简介（病毒的物质构成）,非细胞型微生物，无完整细胞结构。仅由单链或双链核酸(RNA或DNA)的核心和外面的蛋白外壳（衣壳，capsid）组成，有些病毒具有脂蛋白包膜（envelope）。病毒核酸携带有病毒的全部遗传信息。病毒体（virion）：完整成熟的病毒颗粒，是其独立存在的形式，具有典型的形态结构和感染性。病毒蛋白质：结构蛋白和非结构蛋白。,2022/12/19,结构蛋白：衣壳蛋白、包膜蛋白和基质蛋白，它们一般具有良好的抗原性。它们参与病毒体结构构成。非结构蛋白：由病毒基因组编码，但不参与病毒体的结构构成的蛋白或多肽。它们可存在于病毒体，也可以仅存在于宿主细胞中。蛋白水解酶、DNA多聚酶、核苷激酶和逆转录酶等属于非结构蛋白。,病毒简介（病毒的物质构成）,2022/12/19,病毒简介（病毒的分类）,病毒体微小，体积20300 nm，可通过滤菌器。人类目前发现的病毒有4000多种，各种病毒有很大差异，分类有多种。可按病毒大小、形态结构特点、核酸类型、所致疾病、宿主细胞类型等进行分类。1995年国际病毒分类委员会把病毒分为DNA病毒、RNA病毒、DNA或RNA逆转录病毒。,2022/12/19,病毒简介（病毒的复制）,病毒生活代谢特征：没有自己的代谢系统，只能寄生于其他细胞内，利用宿主细胞的酶进行代谢、复制。增殖方式：不是二分裂，而是以其DNA或RNA为模板，通过转录和(或)逆转录、翻译等复杂的生化过程，复制DNA或RNA，合成蛋白质，通过组装产生更多的病毒颗粒。,2022/12/19,生活周期： 吸附（adsorption）并穿透（penetration）侵入易感细胞。 脱壳（uncoating）。 合成核酸多聚酶。 合成核酸（nucleic acid synthesis）。 合成蛋白质及翻译后修饰（posttranslational processing）。 各部分组装（packaging and assembly）成病毒颗粒。 从宿主细胞释放出更多的病毒体。,病毒简介（病毒的复制）,2022/12/19,1、测量单位纳米（nm） 3、观察工具电子显微镜2、大多数病毒的直径小于150 nm,病毒的大小与形态,立克次体450nm,衣原体390nm,2022/12/19,天然产物抗病毒活性的原理与概要,原理：直接途径和间接途径直接抗病毒途径是药物对病毒的直接抑制或损伤作用（阻断病毒繁殖过程中的某一环节：侵入前的“直接杀灭”作用、阻止病毒颗粒对宿主细胞的吸附过程；侵入后抑制DNA病毒中一种特殊的逆转录酶活性或者抑制病毒再感染作用。间接抗病毒作用是药物通过对机体免疫系统的调节（促进机体细胞免疫和体液免疫的功能）而起到抗病毒的作用,这是中药抗病毒机制中不可勿视的重要方面。注意细胞毒性：考察药物对宿主具有毒性的浓度及其抑制病毒生长的浓度,2022/12/19,具有抗病毒活性的天然产物,原理：直接途径和间接途径直接抗病毒途径是药物对病毒的直接抑制或损伤作用（阻断病毒繁殖过程中的某一环节：侵入前的“直接杀灭”作用、阻止病毒颗粒对宿主细胞的吸附过程；侵入后抑制DNA病毒中一种特殊的逆转录酶活性或者抑制病毒再感染作用。间接抗病毒作用是药物通过对机体免疫系统的调节（促进机体细胞免疫和体液免疫的功能）而起到抗病毒的作用,这是中药抗病毒机制中不可勿视的重要方面。注意细胞毒性：考察药物对宿主具有毒性的浓度及其抑制病毒生长的浓度,2022/12/19,天然产物抗病毒活性的原理与概要,多糖:硫酸多糖.对单纯疱疹病毒HSV - 1 和HSV 2表现出选择性抑制活性.萜类:抑制HIV - 1 病毒的逆转录酶活性.生物碱:效阻止病毒糖蛋白gp120与宿主细胞的CD4 抗原分子选择性结合,从而阻止HIV 进入宿主细胞,抑制HIV 的复制.甾醇类核苷,2022/12/19,天然产物抗病毒活性的原理与概要,原理：直接途径和间接途径直接抗病毒途径是药物对病毒的直接抑制或损伤作用（阻断病毒繁殖过程中的某一环节：侵入前的“直接杀灭”作用、阻止病毒颗粒对宿主细胞的吸附过程；侵入后抑制DNA病毒中一种特殊的逆转录酶活性或者抑制病毒再感染作用。间接抗病毒作用是药物通过对机体免疫系统的调节（促进机体细胞免疫和体液免疫的功能）而起到抗病毒的作用,这是中药抗病毒机制中不可勿视的重要方面。注意细胞毒性：考察药物对宿主具有毒性的浓度及其抑制病毒生长的浓度,2022/12/19,天然产物抗病毒活性评价方法,组织培养法最常用的方法不能检出能够诱生干扰素或刺激宿主免疫反应的化合物不能检出药物抗病毒中的代谢物鸡胚接种法动物实验法,2022/12/19,（一）组织培养（最常用细胞培养）,1、优点： （1）便于纯化病毒； （2）可直接观察细胞变化（包括细胞出现病变或转化）； （3）可对病毒的复制进行基础性研究； （4）可进行空斑纯化病毒克隆； （5）可滴定病毒含量。,2022/12/19,天然产物的抗病毒活性评价,组织培养法病毒株：首选对人类威胁较大的常见疾病的病毒。细胞：肿瘤细胞适于大量样品的筛选；人胚肾细胞和人胚肺细胞更接近于正常人体。检测指标：比较经系列浓度药物处理及非药物处理对照细胞的病毒感染参数，如感染细胞的病毒产生量、病毒的致细胞病变作用、病毒的合成产物、病毒的某些功能和病毒的特异性酶等。,2022/12/19,天然产物的抗病毒活性评价,组织培养法条件易控制、方法规范、易于进行，可进行大规模的筛选性研究。凡在细胞培养上无活性的药物，几乎均在动物实验中无抗病毒活性。难以检测药物通过对宿主防御机能的影响而发挥的抗病毒感染的效果。,2022/12/19,天然产物的抗病毒活性评价,组织培养法用药量：研究前应首先测定药物对宿主细胞的影响，并选择不影响宿主细胞的药物浓度进行抗病毒实验。用药时间：加病毒之前或之后，也可与病毒同时加入。,2022/12/19,天然产物的抗病毒活性评价,组织培养抗病毒实验常用方法抑制病毒致细胞病变法（CPE）：病毒对感染细胞可产生明显的病变，如细胞变圆、折光增加、空泡形成、细胞融合和细胞溶解。细胞病变程度可分为无病变0、75%等级别。以抑制细胞病变50的药物最低稀释度为IC50。,2022/12/19,天然产物的抗病毒活性评价,组织培养抗病毒实验常用方法抑制病毒空斑形成法：单层细胞培养物接种病毒液，并于37C 令病毒吸附于细胞1h，加入含病毒的琼脂培养基覆盖细胞层，使琼脂固化， 37C 培养后病毒在细胞层内生长，形成空斑，计数空斑数以代表病毒增殖和致细胞病变情况。为使空斑易于计数，可在孵育结束前一定时间在培养琼脂表面加中性红，死亡细胞不着色，活细胞着色而显示清晰空斑。,2022/12/19,（二）鸡胚培养,1、接种途径有：尿囊腔、羊膜腔、卵黄囊、绒毛尿囊膜2、培养数天后，观察鸡胚情况或取培养物进一步鉴定,尿囊腔接种,羊膜腔接种,尿囊腔,羊膜腔,2022/12/19,卵黄囊接种,绒毛尿囊膜接种,卵黄囊,绒毛尿囊膜,2022/12/19,天然产物的抗病毒活性评价,动物体内实验法抗病毒的研究最终都应当通过动物实验的考核。动物模型：尽可能使动物模型密切模拟人体疾病；恰当选择病毒株和实验动物（小鼠可用于流感、脑炎、灰质炎I型和新城病毒等；家兔适于单纯疱疹病毒、牛痘苗病毒等）,2022/12/19,病毒的培养：,（一）动物接种 1、不同的病毒，易感动物不同，常用动物有：小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴等； 2、接种的途径也有多种，可：皮下、皮内、脑内、腹腔、静脉等接种； 3、病毒动物动物出现感染症状，据症状鉴定病毒或取病变组织进一步检查。,2022/12/19,天然产物的抗病毒活性评价,动物体内实验法药物及给药：注射给药时应注意其对宿主的毒性。给药时机重要，宜预防性给药，即预先给药3-5日再感染病毒，并持续给药至终。应给予大、中、小多剂量观察。药效判断标准：不同动物模型判断标准不一。对致死性感染用生存率、生存期作指标；特殊病变程度也作感染严重程度的指标；病毒复制情况也是重要指标。,2022/12/19,作 业,列举抗病毒天然产物的研究概况举例说明对天然产物抗病毒活性的评价方法。实验方法结果,