苯丙氨酸的紫外吸收峰为260nm课件.ppt

第四章 蛋白质化学,蛋白质的分子组成,第一节,一、蛋白质的元素组成,含氮量,由于体内含氮物质以蛋白质为主，因此，通过测定含氮量即可大致推算出样本中蛋白质的含量，这是凯氏定氮法测定蛋白质含量的依据。,100g样品蛋白质的含量（g%）=每克样品含氮克数100/16100 =每克样品含氮克数6.25100,蛋白质用酸、碱或酶水解均可得到含有不同氨基酸的混合液，因此氨基酸（amino acid）是蛋白质的基本结构单位。,二、蛋白质的基本结构单位,（一）氨基酸的结构,存在于自然界中的氨基酸有300余种，但组成蛋白质的氨基酸只有20种，称为基本氨基酸。这些氨基酸有相应的遗传密码，也称为编码氨基酸（coding amino acid）或标准氨基酸（standard amino acid）。,L-氨基酸 D-氨基酸,（二）氨基酸的分类,根据R侧链理化性质不同可分为： 1. 非极性疏水氨基酸 2. 极性中性氨基酸 3. 酸性氨基酸 4. 碱性氨基酸,1.非极性疏水氨基酸,2.极性中性氨基酸,4. 碱性氨基酸,一般情况下，非极性疏水氨基酸在水溶液中的溶解度较极性中性氨基酸要小，酸性氨基酸的侧链含有羧基呈酸性电离，碱性氨基酸的侧链含有氨基、胍基和咪唑基呈碱性电离。 氨基酸还可根据其R侧链的化学结构进行分类，如芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；含硫氨基酸包括半胱氨酸和甲硫氨酸；含有羟基的氨基酸包括苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸。,（三）氨基酸的理化性质,1两性电离与等电点,2芳香族氨基酸具有紫外吸收特性,3茚三酮反应,当溶液为某一pH值时，氨基酸主要以兼性离子的形式存在，分子中所含的正负电荷数目相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点（pI）。 在pI时，氨基酸在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于两性离子状态。,氨基酸的等电点,芳香族氨基酸因含苯环，具有共轭双键，可吸收一定波长的紫外光，其中酪氨酸和色氨酸的紫外吸收峰为280nm，苯丙氨酸的紫外吸收峰为260nm。其吸光度（A280）与氨基酸的浓度在一定范围内成正比关系。,芳香族氨基酸具有紫外吸收特性,三种芳香族氨基酸的紫外吸收峰,氨基酸与茚三酮水合物共热时，氨基酸发生氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物与氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色的化合物，后者最大吸收峰在570nm处。这一性质常被用于氨基酸的定性和定量分析。,茚三酮反应,三、肽键和肽,（一）肽键,一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基缩合脱去一分子水形成的化学键。,肽键的形成,肽键具有特殊性质。从键长看，肽键键长（0.132nm）介于CN单键（0.146nm）和双键（0.124nm）之间，具有部分双键的性质，不能自由旋转；从键角看，肽键中键与键的夹角均为120。因此，与肽键相连的6个原子（C、C、O、N、H、C）始终处在同一平面上，构成刚性的“肽键平面”（peptide bond plane），又称“酰胺平面”或肽单元（peptide unit）。肽单元中，与C-N相连的氢和氧原子与两个碳原子呈反向分布。,肽键平面,（二）肽,多个氨基酸通过肽键相连形成的化合物称为肽。 由2个氨基酸形成的肽称为二肽。 3个氨基酸形成的肽称为三肽。 一般10个以下氨基酸形成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由10个以上氨基酸形成的肽称为多肽（polypeptide）。 组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,多肽链,多肽链中形成肽键的原子和碳原子交替重复排列构成主链骨架，而伸展在主链两侧的R基被称为侧链。蛋白质分子结构可含有一条或多条共价主链和许多侧链。,多肽链的结构具有方向性。一条多肽链有两个末端，有自由-氨基的一端称为氨基末端或N端；有自由-羧基的一端称为羧基末端或C端。肽链中的氨基酸因形成肽键而分子不完整被称为氨基酸残基。,（三）生物活性肽,体内存在着许多具有生物活性的低分子量肽，有三肽，有寡肽或多肽，如谷胱甘肽、抗利尿激素、血管紧张素II、-内啡肽、催产素及表皮生长因子等。这些活性肽在代谢调节、神经传导等方面起着重要作用。,体内重要的生物活性肽,体内重要的生物活性肽,第 二 节蛋白质的分子结构与分类,蛋白质是生物大分子，由许多氨基酸通过肽键连接形成。具有生理功能的蛋白质都具有有序的三维空间结构。蛋白质的分子结构分为一级结构和空间结构，空间结构又称高级结构，包括二级、三级和四级结构等。一级结构是基础，决定蛋白质的空间结构。,一、蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构（primary structure）是指多肽链中氨基酸残基的组成和排列顺序。蛋白质分子中氨基酸排列顺序是由遗传密码决定的，是蛋白质作用的特异性、空间结构的差异性和生物学功能多样性的基础。蛋白质一级结构中除肽键外，有些还含有少量的二硫键，是由两分子半胱氨酸残基的巯基脱氢而生成的，可存在于肽链内，也可存在于肽链间。,例如人的胰岛素是由两条多肽链共51个氨基酸残基构成，其中A链包括21个氨基酸残基，B链包括30个氨基酸残基。A链和B链之间有两个二硫键连接。在A链第6位与第11位的两个半胱氨酸残基之间还有一个链内二硫键。,人胰岛素的一级结构,二、 蛋白质的空间结构,蛋白质分子的空间结构又称立体结构、高级结构和三维构象等。天然蛋白质的多肽链由于分子内单键的旋转形成复杂的卷曲和折叠，构成蛋白质特定的三维空间结构，包括二级结构、三级结构和四级结构。蛋白质分子的空间结构是决定蛋白质性质和功能的结构基础。,（一）蛋白质二级结构,蛋白质的二级结构是指肽链的主链骨架原子若干肽单位各自沿一定的轴折叠而形成的有规则的构象。只涉及主链构象及链内/间形成的氢键。主要有螺旋、 折叠、转角、无规卷曲。,1. 螺旋,螺距0.54nm，含3.6个AA残基，链内形成氢键与轴平行，多为右手螺旋。,螺旋,由两/多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成。肽链主链呈锯齿状折叠构象。,2. 折叠,3. 转角,肽链主链骨架180的回折结构。 特点：由4个连续的氨基酸残基组成。第一个残基C=O第四个残基NH,形成氢键,O （ 氢 键 ） H C（NHCHCO）2N R,泛指没有规律性的多肽片段。,4. 无规卷曲（random coil）,（二） 蛋白质的超二级结构,蛋白质的超二级结构是指两个或两个以上的二级结构在空间折叠中彼此靠近，相互作用形成有规则的二级结构的聚集体，完成特定的生物学功能。,蛋白质的的结构域是指位于超二级结构和三级结构间的一个层次。是蛋白质分子空间结构内独立折叠单元，通常是几个超二级结构单元的组合。 结构域存在的原因： 1.局域分别折叠比整条肽链折叠在动力学上更为合理。 2.结构域之间由肽链连接，有利于结构的调整。,（三）蛋白质的结构域,30k 40k 20k 75k,60k,35k 30k,肝素纤维蛋白肌动蛋白,细胞,胶原蛋白,纤维蛋白,肝素,纤维蛋白,（四）蛋白质的三级结构,蛋白质的三级结构是指在二级结构、超二级结构或结构域的基础上，由于侧链R基的相互作用，进一步盘曲折叠构成的特定空间结构，包括整条肽链中全部氨基酸残基的所有原子在三维空间的排布位置。 维系力有氢键、疏水作用、离子键、范德华力。,（五）蛋白质的四级结构,蛋白质的四级结构是指由两条或两条以上的具有独立三级结构的多肽链相互作用，经非共价键连接成特定空间构象。 亚基：指四级结构中每条具有完整三级结构的多肽链。 维持力：是离子键、氢键，不包括共价键。,（一）按化学组成分类 1. 单纯蛋白质 2. 结合蛋白质 （二）按分子形状分类 1. 纤维状蛋白质 2. 球状蛋白质,三、蛋白质的分类,第 三 节蛋白质结构与功能的关系,一、蛋白质的一级结构与功能的关系,（一）一级结构是空间结构的基础 一级结构决定多肽链中氨基酸残基的种类、数量及排列顺序，也决定多肽链中氨基酸残基R侧链的位置，R侧链的大小、性质决定着肽链如何盘曲折叠形成空间结构。（二）一级结构与空间结构及功能的关系 一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能，通过比较蛋白质的一级结构可预测蛋白质的同源性。同源蛋白质是由同一基因进化而来的蛋白质，其一级结构、空间结构和生物学功能极为相似。,二、蛋白质的空间结构与功能的关系,肌红蛋白与血红蛋白,第 四 节蛋白质的理化性质,大多数蛋白质分子中含有酪氨酸和色氨酸残基，蛋白质在280nm波长处有特征性吸收峰。在一定范围内，蛋白质A280与其浓度成正比关系，利用此特性测定其在280nm处吸收度，用于蛋白质的定量分析。,一、蛋白质的紫外吸收,二、蛋白质的呈色反应,1.双缩脲反应 凡是含有两个或两个以上肽键的化合物均能与碱性硫酸铜反应生成紫红色的化合物。蛋白质分子中肽键的反应，肽键越多反应颜色越深，氨基酸及二肽无此反应。2.酚试剂反应 蛋白质分子中酪氨酸能与酚试剂（磷钼酸与磷钨酸）反应生成蓝色化合物，颜色深浅与蛋白质的量成正比。 3.米伦试剂反应 蛋白质溶液中加入米伦试剂（亚硝酸汞、硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液）后产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。含有酚基的化合物有此反应。,三、蛋白质的胶体性质,胶体溶液的特点： 分子直径在1100 nm内； 溶于水； 不易聚集沉淀； 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液； 同种蛋白带同种电荷，相互排斥； 水化膜。,四、蛋白质的两性电离与等电点,蛋白质含有酸/碱氨基酸残基，具有两性电离的特性。 碱/酸越大pI 越大。,I 通常在 6.0左右。,蛋白质的解离状态可用下式表示：,五、蛋白质的变性与复性,在某些理化因素的作用下，蛋白质特定的空间结构遭到破坏，导致其理化性质的改变和生物学活性的丧失，这种现象称为蛋白质变性。,有些蛋白质变性后，采用一定条件去除其变性的因素，能恢复或部分恢复原来的空间构象，并恢复其生物学活性，这种现象称为蛋白质复性。,六、蛋白质的沉淀,蛋白质从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀（precipitation）。 常用沉淀蛋白质的方法： 盐析 有机溶剂沉淀 重金属盐沉淀 生物碱试剂沉淀,常用沉淀蛋白质的方法,1. 盐析法 低盐浓度可使蛋白质表面吸附某种离子，导致其颗粒表面同性电荷增加而排斥加强，同时与水分子作用也增强，从而提高了蛋白质的溶解度；高盐浓度时，因破坏蛋白质的水化层并中和其电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，称为盐析作用（salting out）。,2. 有机溶剂沉淀法,在蛋白质溶液中加入一定量的与水可互溶的有机溶剂(如乙醇、丙酮、甲醇等)能破坏蛋白质分子表面的水化膜，使蛋白质的解离度降低，相互聚集而从溶液中析出。在等电点时加入有机溶剂更易使蛋白质沉淀。,3. 重金属盐沉淀法 蛋白质在pH大于pI的溶液中呈负离子，可与重金属离子（Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag2+等）结合成不溶性蛋白质盐而沉淀，沉淀条件是溶液pHpI。重金属盐沉淀蛋白质往往会使蛋白质变性。,4. 生物碱试剂沉淀法 生物碱试剂如苦味酸、鞣酸、磷钨酸、磷钼酸、三氯乙酸等的酸根离子可与带正电荷的蛋白质结合形成不溶性盐而沉淀。,第 五 节蛋白质的分离纯化,1. 样本的选择 原则是样本中应含大量的所需蛋白质，且来源方便。当然，由于目的不同，有时只能用特定的原料。 2. 组织细胞破碎 某些蛋白质以可溶形式存在于体液中，可直接分离。但大多数蛋白质存在于细胞内，并结合在一定的细胞器上，故需先破碎细胞，再用适当的溶剂提取。应根据动物、植物或微生物原料不同，选用不同的细胞破碎方法。 3. 蛋白质提取的条件 按其性质选用适当的溶剂和提取次数以提高回收率。防止细胞内外蛋白酶对其水解破坏作用和其他因素对蛋白质特定构象的破坏作用。蛋白质提取的条件是十分重要的。,一、蛋白质的提取,二、蛋白质的分离与纯化方法,（一）透析和超滤利用蛋白质分子不能透过半透膜将其与小分子物质分开。半透膜为玻璃纸或纤维素材料。,血液透析,小分子被带出,透析机,透析液,加压,血液,3、凝胶过滤,1. 低温有机溶剂沉淀法 其原理是有机溶剂的介电常数比水低，蛋白质分子间极性基团的静电引力增加，水化作用降低，促使蛋白质聚集沉淀。 2. 盐析沉淀法 因一定浓度的中性盐可破坏蛋白质胶体的稳定因素而使蛋白质沉淀。 3. 免疫沉淀法 是将某一纯化蛋白质免疫动物，从而获得抗该蛋白质的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原-抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,（二）低温有机溶剂沉淀法、盐析法和免疫沉淀法,（三)根据电荷不同的分离方法电泳,原理：蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0分子大小不同，电场中移动速度也不同,等电聚焦电泳,蛋白质在偏离其pI的溶液中为带电颗粒，在电场中会向与其电性相反的电极泳动，这种通过电荷性质、数量和分子量不同的蛋白质在电场中泳动速度不同从而达到分离各种蛋白质的技术，称为电泳。 蛋白质在电场中移动的速度和方向主要取决于蛋白质分子所带的电荷的性质、数量及分子大小和形状。带电粒子在电场中的电泳速度以电泳迁移率表示，即单位电场下带电粒子的泳动速度。带电粒子的泳动速度除受本身性质决定外，还受其他外界因素的影响，如电场强度、溶液的pH、离子强度及电渗等。,（三）电泳法,层析是蛋白质分离纯化的重要手段之一。 根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等使待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相），待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。层析种类很多，有离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。,（四）色谱法又称层析法,（五）超速离心法,超速离心法既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。,第 六 节氨基酸、多肽和蛋白质类药物,（一）临床常用氨基酸类药物的特点 1甘氨酸 又称氨基乙酸。 2丙氨酸 3丝氨酸 4胱氨酸 5赖氨酸,一、临床常用氨基酸类药物的特点及分类,（二）临床常用氨基酸及其衍生物类药物的分类,1治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物 2治疗肝病的氨基酸及其衍生物 3治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物 4用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物5. 其他氨基酸药物的临床应用,二、临床常用多肽和蛋白质类药物的特点及分类,多肽、蛋白质类药物的分类： 从化学组成的角度来看，蛋白质和多肽没有本质的区别，仅是分子结构不同。在这类药物的应用过程中，习惯上将多肽、蛋白质类药物划分为多肽激素类药物、细胞因子、抗体药物、抗菌肽和酶类药物等五种类型。其中，来源于动植物有机体的多肽、蛋白质类药物称为生化药物，来源于基因工程菌表达生产的多肽、蛋白质类药物称为基因工程药物。,（一）多肽激素类药物,多肽可作为信息的使者，调节体内各种生理活动和生化反应。分子量小，易于修饰改造。 多肽以完整的形式直接进入血液循环到达机体各个部位，具有低耗或不需消耗能量的特点。药物多肽吸收具有不饱和性，各种肽之间运转没有竞争性和抑制性。 人工合成的多肽类药物表面有一层保护膜，不会受到体内酶和酸碱物质的水解。吸收快速，又称生物导弹。多肽还具有主动、优先被机体吸收的特点，可作为载体，运载营养物质，特别是钙等对人体有益的微量元素。,（二）细胞生长因子,作用特点：（1）大多数为分子量小的糖蛋白；（2）通常以旁分泌或自分泌形式作用于邻近细胞或者是本身；（3）多重高效的调节作用。,（三）抗体药物,抗体是机体受抗原刺激后由B淋巴细胞产生，能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白，主要分布于血清中，在组织液和外分泌液中也存在。因其能与细菌、病毒或毒素等异源性物质结合而发挥预防、治疗疾病的作用。,（四）抗菌肽,抗菌肽以物理的方式作用于细菌的细胞膜，使细胞膜穿孔，细胞质外溢达到杀菌目的。抗菌肽具有疏水和亲水的两亲性特征，带正电荷的分子与细胞膜磷脂分子的负电荷形成静电吸附，随后抗菌肽分子的疏水端插入细菌细胞膜中，牵引整个分子进入质膜，扰乱质膜原有的排列顺序，再通过抗菌肽分子间的相互位移而聚合形成跨膜离子通道，导致细胞质外流，细胞内离子大量丢失，细菌不能维持胞内渗透压而死亡。 抗菌肽只对原核生物细胞产生特异的溶菌活性，对最低等的真核生物如真菌及某些植物的原生质体，某些肿瘤细胞等也有一定的杀伤力，而对人体正常的细胞无损伤作用。,