液相色谱基础知识及应用课件.ppt
HPLC的基础知识及应用,2007年10月26日,工业催化与反应器设计实验室内部学术交流活动,徐 帅,Contents,5,样品分析方法的建立,液相色谱的维护及注意事项,软件的简单介绍及示范,1 液相色谱发展历史与分类,1.1 色谱的起源 (1903),M.S. Tswett,IUPAC definition of chromatography (1993) :Chromatography is a physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two phases, one of which is stationary while the other moves in a definite direction.固定相（stationary phase）：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。流动相（mobile phase）：带动样品向前移动的另一相。色谱法：是一种物理化学分离方法，它利用不同组分与两相（固定相和流动相）之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，样品在两相中做相对移动时，各组分在两相间进行多次平衡，使不同物质达到相互分离。,1.2 色谱的定义,1.3 色谱的发展历程,1.4 色谱中的分离过程,色谱中的分离过程,咖啡,流动相,固定相,利用混合物中各组份在不同的两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离,1.5 色谱的分类,按流动相的物态分: 气相色谱(Gas Chromatography, GC)： 用气体作为流动相(又叫载气) 液相色谱(Liquid Chromatography, LC)： 用液体作为流动相(又叫洗脱剂)按固定相的形态分: 平面色谱 纸色谱 薄层色谱 柱色谱按流动相和固定相的相对极性正相色谱(Normal Phase Chromatography) 固定相的极性大于流动相反相色谱(Reversed Phase Chromatography) 固定相的极性小于流动相,HPLC 与 GC 的应用差异,HPLC 与 GC 的应用差异,挥发,非挥发,疏水性,亲水性,糖,环氧化合物,多氯联苯,脂肪酸甲酯,芳香酯,C2/C5 碳氢化合物,无机离子,氨基酸,糖类衍生物,香精油,聚合物单体,甘油三酸酯,磷脂,亚硝胺,有机磷杀虫剂,酒精,多环芳烃,芳族胺,脂溶性维生素,抗体,天然食用色素,类黄酮,抗生素,腈类,抗氧化剂,乙二醇,脂肪酸,磺胺类,挥发性羧酸,醛酮类,甘草膦,合成食用色素,苯酚,黄曲霉毒素,酶,糖醇,2. 色谱方法基本原理,色谱的主要理论热力学理论以相的平衡观点研究色谱过程 塔板理论为代表 (Martin & Synge)动力学理论以动力学观点研究各种动力学因素对色谱峰的影响 Van Deemter 方程为代表,Martin,Synge,分离的原理,样品组分在固定相和流动相之间的分配 流动相带动样品经过色谱柱 不同组分与固定相之间相互作用 的强度不同 不同组分在固定相上移动速度不同， 形成分离分配系数 KDXm Xs KD1 = Xs / XmYm Ys KD2 = Ys / Ym,流动相,固定相,样品组分的分离,进样、分配、移动、流出、分离,KD2 KD1 ，所以 Y 先流出來,分配系数K,分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。,样品组分分离情况,A. 样品与色谱柱固定相无任何作用 三种样品在 t0 时间流出， 无保留无保留时间B. 样品组分保留时间一致与色谱柱作用力相同 C. 样品组分保留时间不一致 样品各组分与色谱柱作用力不同 D. 实际分离状况高斯分布曲线,色谱出峰形状,实际出峰形状为高斯分布曲线 (Gaussian curve)样品的扩散效应,无扩散,样品扩散,分离度,分离度（Resolution)两个相邻峰的分离程度。以两个组份保留值之差与其平均半峰宽值的比来表示：,R=? 时两峰认为已分开?,不同分离度 R,相邻两吸收峰分离度R=1.0, 98%, 基线分离R=1.5, 99.7%R=1.5 時，完全分离（中国药典规定）两色谱峰被视为 分开,分离度R 的数学表达,分离度R的基本公式k: 容量因子 (capacity factor) 反映吸收峰的保留特性: 选择因子 (selectivity factor) 反映相邻两色谱峰的分离程度 色谱过程热力学因素N: 理论塔板数，反映色谱柱的分离效率 (column efficiency)色谱过程动力学因素有关,柱效,选择因子,容量因子,容量因子 k,测量溶质在固定相和流动相中分布的摩尔数（量）之比 与温度有关 (GC)与流动相溶剂种类及组成有关 (LC),k 决定样品能进入色谱柱固定相的量 k太小，在固定相上保留太短，很快流出，难以确定保留时间 k太大，在固定相上保留太强，洗脱时间太长， 理想的 k为 15,分离效果与 k 值的最优化,k值的优化改变溶剂成分、梯度条件 (洗脱强度),选择因子,色谱柱分开两组份的能力 1 时两组分分离表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。,t0,tR1,tR2,Injection,选择因子 的影响因素,影响 的因素 改变流动相成分，包括改变 pH 值改变柱温 (在 LC 不明显)改变固定相成分使用特殊化学效应,理论板数 N,塔板理论热力学平衡理论色谱柱效的量化从分馏法技术衍生而来分离法依组分挥发性不同而分馏色谱法依组分分配系数不同而分离分配系数 K=Cs/Cm理论板数 N、塔板高度 H柱效随 N增大和 H减小而增加分配色谱流程模型,理论塔板数N 与半峰宽W1/2和保留时间的关系如下在相同保留时间色谱峰越尖锐，则色谱柱效越高,分离效能的最优化,增加容量,增加选择因子,增加柱效,增加 k 值可增加分离度但会增加分析时间,改变流动相、固定相成分 增加 值可增加分离度但不能因此影响 k 值,液相色谱仪设备概述,液相色谱仪器组成,溶剂传输系统（泵系统）,进样系统,检测器,工作站,组分收集（选项）,液相色谱仪器结构组成示意图,流动相储液瓶,单元或多元泵,梯度混合器,预柱,手动-进样器自动-进样器,保护柱,色谱柱,柱后反应器,柱温箱,检测器,馏分收集器,积分仪,工作站,计算机,接口,温度控制单元,样品制备单元,3. 样品分析方法开发,样品预处理,样品预处理的目的是为了纯化样品。完成纯化的方法有:稀释- 用一种互溶的且比流动相弱的溶剂或流动相本身稀释样品过滤- 有不同孔径的过滤材料. 提示: 有的化合物可能吸附在过滤器上，从而影响定量.离心- 可除去样品中的颗粒物质.萃取-液液萃取，固相萃取挥发- 采用惰性气体通过样品鼓泡或抽真空除去溶剂,优化概览,优化应当是系统进行的，也就是说每个参数应当逐步变化. !每次运行只改变一个参数!,目标是在最短的分析时间内获得最好的分离结果.,优化溶剂强度 流速 温度 柱长 固定相*,流动相的选择,流动相的选择原则是： 样品易溶，且溶解度尽可能大。 化学性质稳定，不损坏柱子。 不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。 粘度低，流动性好。 易于从其中回收样品。 无毒或低毒，易于操作。 易于制成高纯度，即色谱纯。 废液易处理，不污染环境。反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇,系统方法开发,) 选择初始色谱柱 (直径, 长度, 填料粒度 ）- 4.6 x 250 mm, 5 m使用适当的孔径初始运行采用与流动相组成条件一致的pH) 优化 k* (保留)梯度范围, 时间, 斜率流动相 - 很小变化) 优化回收率样品的溶解性温度的作用键合相的作用有机改性剂) 优化 * (选择性)温度键合相pH (最后的手段) 优化 N (色谱柱条件)流速长度填料粒度,分离度与 k, N, 和 的关系,梯度范围, 斜率,流速, 填料粒度, 柱长,温度、流动相、pH,色谱的定性分析,色谱定性分析: 用保留值定性和色谱联用技术（如LC-MS、LC-FTIR)定性利用保留值定性基本依据：两个相同的物质在相同的色谱条件下应该有相同的保留 值。但是，相反的结论却不成立，即在相同的色谱条件 下，具有相同保留值的两个物质不一定是同一个物质利用已知物直接对照进行定性分析用绝对保留值定性一般要求用自动进样用相对保留值定性用已知物增加峰高法定性利用文献值对照进行定性分析采用保留指数(I),检测器信号响应与时间的关系测量每个峰的保留时间,色谱的定量分析,检测器信号响应与时间的关系测量每个峰的峰面积,定量分析的基本公式： Mi i组分的量；Aii组分的峰面积；fi i组分的校正因子，与检测器的行为和被测组份的行为有关。 定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比，但相同含量的物质由于物理、化学性质的差别，即使在同一检测器上产生的信号也不同，直接用响应信号定量，必然导致较大误差。故引入校正因子。校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位面积所代表的被测组分的量。,1. 面积百分法 (Area Percent)2. 外标法 (External Standard)3. 内标法 (Internal Standard)4. 归一化法 (Normalized Percent),色谱定量分析方法的种类,面积百分法,最简单的计算方法样品中的所有成分对检测器的响应值相同样品中的所有成分必须完全分离表示样品中单一组份相对于其他组份的含量 面积 % = ( AI / A ) * 100 AI = 单一色谱峰的面积 A = 全部色谱峰的面积之和不要求进样量准确不适用于选择性检测器,归一化法(Normalized %),将样品中所有组份的含量之和定为100%。计算其中某一组份百分含量的定量方法：其中：xi试样中组份I的百分含量 fi组份I的校正因子 Ai组份I的峰面积或峰高,归一化法示例,化合物 峰面积校正因子峰面积校正因子 百分比含量C8 2001.2 240240/1708=14.1%C12 2301.6 368368/1708=21.5%C16 2001.8 360360/1708=21.1%C18 3001.8 540540/1708=31.6%C20 1002.0 200 200/1708=11.7% 1030 1708 100%优点：方法简便，进样量与载气流速的影响不大缺点：样品中所有组份必须都能出峰，并且必须知道各自组份的校正因子（校正因子需要由已知的标准品来求得）。归一化法主要用于气相色谱的定量测定。且一般只适用于通用型检测器。,直接峰面积归一化无校正因子法 % (NOCalibration),当样品中各组份的校正因子近似相等，如同系物或同分异构体，可直接用峰面积归一化进行定量。即简化为下式：示例：给出了采用校正因子和不用校正因子进行归一化法的定量结果,多点校正的定量分析,单点校准,峰面积,进样量,峰面积,进样量,响应值 =样品量unn =,峰面积,响应值,峰面积,进样量,多点校准,外标法（External Standard)又称校正曲线法,在相同分析条件下，比较标准物质与样品的色谱峰面积或峰高1. 用已知的标准品配成不同浓度的标准系列，在与被测样品相同的色谱条件下，等体积准确进样，测量各种浓度的峰高或峰面积，绘制响应信号与百分含量的关系曲线；2. 测量样品的峰面积或峰高，在校正曲线上查出其对应的百分含量。,外标法定量,样品结果直接在标准工作曲线上读出，非常简单，尤其对大量样品分析时特别适合。要求进样量、色谱分析条件严格不变；容易出现较大误差。,内标法(Internal Standard),用DBP做内标测定Pynamin. 配制标准溶液：准确称量200mgDBP和220mg90%的Pynamin配制成溶液100ml。色谱测定得到As=12000,Ai=10000,则相对校正因子为：,配制样品溶液：称量210mgDBP和220mg的样品，配制成溶液100ml。色谱测定得到As=12500,Ai=9500,则样品中Pynamin的含量为：,故样品中Pynamin的百分含量为：,4.液相色谱仪（HPLC）的保养,1、HPLC的日常操作条件：温度：10-30摄氏度；相对湿度 80；最好是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备。 2、泵的保养：1）使用流动相尽量要清洁；2）进液处的沙芯过滤头要经常清洗；3）流动相交换时要防止沉淀；4）避免泵内堵塞或有气泡。3、进样器的保养：每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。,4、柱的保养：1）柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；2）当柱子和色谱仪联结时，阀门或管路一定要清洗干净；3）要注意流动相的纯度；4）避免使用高粘度的溶剂作为流动相；5）进样样品要提纯；6）严格控制进样量；7）每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；8）每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；9）若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。5、检测器（UV）的保养：1） 紫外灯的保养：在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器；2） 样品池要保养。,流动相的制备,气泡的形成空气在混合溶剂中的溶解度低于纯溶剂多余的气体离开溶剂形成气泡,过滤,将流动相种的微粒去除储液罐需加盖保护过滤头置于溶剂进口处,当正相柱与反相柱互换时,需用能跟两种流动相互溶的溶剂冲洗!,5.示范一下软件,Click to edit company slogan .,Thank You !,
