生物化学与分子生物学进展：细胞分化的分子机制课件.ppt

,细胞分化的分子机制,显微手术和基因组学揭开了发育控制之迷 基因克隆和测序展现出其分子机理 ,生化与分子生物学进展(基础),本章内容：,细胞分化的基本概念细胞分化与干细胞、肿瘤细胞参与细胞分化的信号转导通路基因表达与组织形成特异性蛋白基因表达的发育阶段性 基因表达的调控机制（非编码小RNA分子调控） 影响细胞分化的因素细胞分化异常与疾病,人类胚胎从何时起享有人的尊严？,胚胎是早期生命吗？,In vivo,In vitro,同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程。结果：在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞 与其从前的状态有所不同。本质：基因组选择性表达（时间、空间），通过不同 基因表达的开或关，产生标志性蛋白质,一、细胞分化（cell differentiation ）,(人体约有200种不同的分化细胞),细胞分化特点,1 ）全能性：分化潜能随个体发育进程逐渐“缩窄”： 全能 多能 单能 功能，是细胞分化的一般规律2 ）选择性：基因选择性表达，出现不同的表型时空性 时间上：细胞在不同的发育阶段有不同的形态和功能变化 如骨髓内造血干细胞的发生过程 空间上：子细胞因所处位置不同，其形态和功能也不一样 如外胚层来源细胞可发育成表皮细胞或神经细胞 3 ）适应性：分化与分裂状态和速度相适应 分化建立在分裂基础上：分化必然伴随着分裂，但分裂不一定分化； 分化程度越高，分裂能力越差4）稳定性：一般情况，分化一旦确立，分化状态稳定5）可逆性：特殊情况，已分化细胞逆转到未分化状态或转分化,指细胞分裂和再生的过程，细胞通过分裂进行增殖，使遗传信息传给子代，保持物种的延续和数量增多。,细胞增殖（cell proliferation ）,增殖与分化紧密相连 分化必然伴随着分裂，但分裂的细胞不一定就分化； 分化程度越高，分裂能力也就越差 细胞增殖分化异常从本质上讲是基因的调控异常。,相关概念：,13,细胞周期（cell cycle）,-细胞从一次分裂结束到下一次分裂终了的过程或间隔时间。G1 期：first gap phase, DNA 合成前期 S 期：synthetic phase, DNA 合成期G2 期：second gap phase, DNA 合成后期M 期：mitotic phase, 有丝分裂期,相关概念：,14,间期之一：G1期- DNA 合成前期,从上一次有丝分裂完成到本次DNA复制之前的过程。持续时间一般为6-l2h。本期事件：有mRNA和蛋白的合成积累能量和原料，为DNA复制作准备DNA复制所需酶和蛋白的基因开始表达,15,间期之二： S期-DNA 合成期,持续时间一般为6-8h本期事件：DNA含量增加一倍（ S期DNA的复制极其准确，每一段DNA只复制一次）细胞由二倍体变为四倍体染色质拓扑结构改变组蛋白合成,16,间期之三： G2期-DNA 合成后期,从DNA复制完成到有丝分裂开始的时间区间。持续时间一般为3-4h本期事件：活跃的RNA和蛋白质合成有丝分裂所需蛋白，微管蛋白合成线粒体复制,17,M期：有丝分裂期,持续时间一般为1h,18,G0期,指分裂后相对稳定的一段时期,也称静止期(resting or quiescent phase).所谓G0期不包括在细胞周期之内。细胞在适宜刺激下能被触发从静止状态进人增殖周期，G1期细胞在一定条件下也可退入G0期。近年来的研究表明，G0期细胞并不“静止”，而是进行着极为复杂的生化反应.,19,人体细胞分类 （根据细胞增殖状态）,周期性细胞：能连续按 G1 S G2 M 四个阶段循环进行分裂，如表皮细胞、骨髓干细胞、生殖细胞。 G0 细胞：这种细胞暂时脱离细胞周期，不进行增殖，但在适当刺激后可返回细胞周期，进行细胞增殖。如肝细胞、肾细胞。 终端分化细胞：细胞永远脱离细胞周期丧失分裂能力。如神经细胞、心肌细胞等。,21,细胞周期的特点,单向性：细胞周期只沿 G1 S G2 M 方向推进，不能逆行。 阶段性：细胞可因某种原因在某时相停滞，当条件适宜时，细胞又可重新活跃到下一时期。 检查点：增殖细胞在分裂过程中，为了保证 DNA 复制和染色体分配质量，细胞内存在监控机制 检测点。各时相交叉处存在检查点（ check point ），只有通过检查点的检查，细胞才能进入下一个时相。 微环境影响：细胞外信号、条件也能决定细胞周期是否顺利推进。,细胞分化的常见方式,倍增：未分化的干细胞产生新的未分化干细胞重构（reprogramming）：不改变基因序列的情况下，通过表观遗传修饰如DNA甲基化来改变细胞命运的过程去分化：分化的细胞逆转恢复到全能性状态（未分化状态）的过程。转分化：从一种分化细胞转化为另一种分化细胞的过程。再分化：去分化的细胞在适当条件下重新进入有序生长和分化状态的过程。再分化是再生的基础。,（Transdifferentiation）,（dedifferentiation ）,转分化（transdifferentiation）,一种类型的分化细胞转变成另一种类型的分化细胞的现象。如： 水母横纹肌细胞可形成神经细胞、平滑肌细胞、上皮细胞，甚至可形成刺细胞； 人的成纤维细胞或上皮细胞诱导分化成神经元细胞； 分化程度低的神经干细胞也可形成骨髓细胞和淋巴样细胞。,研究进展,转分化技术（Transdifferentiation）,转分化技术源自于iPS技术，同样是通过转录因子的导入，成体终末细胞可以转化为其他类型的细胞。如将成纤维细胞转分化为功能性的神经元、心肌细胞、胰岛细胞等。该技术的优势在于，可以直接将细胞转分化为目标细胞或目标细胞的干细胞，避免先经过iPS再进行分化的复杂阶段。是目前干细胞研究的热点。,一 基因组成熟分化的细胞保留着全部核基因组。,分化细胞的基因表达特征 基因循序差异表达,相关实验： 1964年Gurdon等进行的非洲爪蟾实验 1970年Steward等用悬浮培养的胡萝卜单个 细胞培养成可育的胡萝卜植株。 1996年英国学者克隆出 “多莉”羊,J.Gurdon 1964,悬浮培养的胡萝卜单细胞培养成了可育植株,（Steward,1970年）,Dolly的标本和伊恩博士,Dolly：1996.7.5.世界上第一只克隆羊Dolly由英国爱丁堡大学的伊恩博士研制成功，2003.2.14.由于肺结核而被安乐死，它的标本于2003年4月9日陈列于苏格兰首都爱丁堡国家博物馆。,多莉的出生与三只母羊有关，而多莉与提供细胞核的母羊最相似,遗传信息来自哪里？,多莉与哪个妈妈最相似？,克隆羊 1996年7月5日，伊恩维尔穆特科研小组克隆绵羊“多利”在位于苏格兰爱丁堡市郊的罗斯林研究所诞生。“多利”是世界上第一只通过成年哺乳动物体细胞克隆的动物。克隆猫 2002年初美国得克萨斯州大学威苏辛教授培育出世界上第一只克隆猫“”。它于2006年顺利产下3只猫崽。克隆马 2003年5月28日世界上第一匹克隆马“普罗梅泰亚”在意大利克雷莫纳市繁殖技术与家畜饲养实验室诞生，克隆马科研小组负责人是切萨雷加利教授。克隆狗 2005年8月韩国首尔大学教授黄禹锡研究小组将一条9周大的阿富汗猎犬“斯纳皮”介绍给公众，并宣布它是世界上第一条克隆狗。 克隆猴子胚胎 2007年11月美国俄勒冈州比弗顿的国家灵长类动物研究中心沙乌科莱特米塔利波夫研究小组利用一只10岁雄性恒河短尾猴成功克隆出胚胎，并从20个克隆胚胎中培育出两批胚胎干细胞，并从克隆胚胎中培育出成熟的猴子心脏细胞和大脑神经。 克隆人？,动物克隆进程,齐天大圣：“其实我在500年前就已经成功克隆过猴子了！”,这些实验说明：-即使是终末分化细胞，其细胞核同样也包含全部的遗传信息，即具有发育为完整个体的“全能性”。,细胞的全能性: 指已分化的细胞仍具有发育成完整个体的能力.,当精子及卵子结合，来自父代及母代的基因即发生组合，形成发育为一个完整个体所需的基因组。细胞最初是“基因组等同”，但逐渐启动不同的分化程序。每一特定类型的细胞只使用一小部分遗传信息，表达一套特异蛋白质。分化进程中，细胞有选择地启动某些基因并合成其它类型的细胞所不具备的蛋白质，以构成该种特定细胞的结构、产物及功能的基础。,这是细胞各自表达特异性基因的结果。一些胚胎细胞按其遗传潜能来说都是“全能”的，但其携带的遗传信息在发育过程中并不都能表达，而是按严格的时空顺序有选择地表达其中一部分。,分化是细胞命运决定过程中基因循序差异表达的结果,分化中为何出现动物细胞表型的差异?,细胞分化的机制,（1 ）“决定”先于分化 细胞决定（ determination ）是指细胞内某些基因永久地关闭，而另一些基因顺序表达，具备向某一特定方向分化的能力（稳定的、可遗传的）。 如，胚胎早期的外（神经细胞、上皮细胞、肛门上皮细胞）、中（泌尿、生殖）、内（呼吸、消化） 3 胚层在细胞形态上并无差别，但已预定要分化出各自不同的组织细胞。 （ 2 ）细胞质在决定细胞差别中作用 细胞质分配的不均匀，子代干细胞的胞质组分不同，导致子细胞产生差别（即分化的表现）。 （ 3 ）细胞间相互作用 位置效应：细胞分化与细胞所在位置及与其他细胞的联系有关，包括细胞间直接接触所进行信息转导和细胞外物质（细胞因子）的作用结果。,细胞内不同基因在不同发育阶段被选择激活，即基因在时空上的有序表达。,基因表达的阶段特异性（时）及组织特异性（空） 指特定基因的表达按照严格的时间顺序发生，同时，同一基因产物在不同的组织器官表达数量不同，不同的产物蛋白又分布于不同的细胞或组织器官。,细胞分化与选择性基因表达,在胚胎发育过程中，细胞基因组严格按时空顺序相继活化这一现象称为基因的差异表达（differential expression）或顺序表达（sequential expression）。从一个受精卵开始，在个体发育的过程中逐步分化产生各种细胞类型和组织，是不同特异性基因相继表达的结果。,分化就是不同特异性基因相继表达的结果,如果蝇和其他双翅目昆虫唾腺染色体所看到的膨松区的形成。膨松区是基因的活化区，即正转录区域。膨松区的位置和数目在相同发育阶段的同一类型细胞一致，但在不同类型的细胞中有区别，在不同的发育阶段也有明显变化。 膨松反映着器官特异的基因表达。,果蝇的染色体膨松：基因激活而失去等同,果蝇多线染色体,多线染色体是基因组不可逆变化以及失去基因组等同的一个实例,在发育分化期间，并不总是维持基因组等同的,用32P磷酸盐分别掺入前体细胞和原成红细胞，若珠蛋白基因有表达，则DNA可转录有32P标记的RNA。当用克隆的胚胎型样珠蛋白基因DNA探针与之杂交，发现在原成红细胞中有DNA-RNA杂交反应，而前体细胞中不发生杂交反应。说明前体细胞的胚胎型珠蛋白基因处于休止状态，直至发育到原成红细胞时才被活化。表明样珠蛋白基因具有严格的红系组织特异性和发育阶段专一性特点。,特异基因的阶段性表达,生物体细胞中含有决定生长分裂和分化的全部基因信息，按其与细胞分化的关系，可将这些基因分为两大类：奢侈基因和管家基因,奢侈基因与管家基因,从分子层次看，细胞分化主要是奢侈基因中某种（或某些）特定基因选择性表达的结果。某些基因的选择性表达合成了执行特定功能的蛋白质，从而产生特定的分化细胞类型。,组蛋白密码学说（表观遗传学）:修饰直接影响染色质或核小体结构；或募集其他调控的蛋白质，为其他功能分子与组蛋白结合搭建了一个平台,常见的组蛋白修饰包括组蛋白H3、H4发生乙酰化、甲基化和磷酸化三种；还有组蛋白的泛素化和ADP-核糖基化修饰等。乙酰化修饰通常减弱组蛋白与DNA的结合，从而松弛染色体，促进基因转录；甲基化修饰增强组蛋白与DNA结合，从而封闭染色体的基因转录。组蛋白磷酸化修饰在细胞有丝分裂和减数分裂间染色体浓缩和基因转录激活有关。,兔子胸腺和骨髓细胞的染色质重组实验 ： 未分离的胸腺染色质合成胸腺mRNA。 未分离的骨髓染色质合成骨髓mRNA。 骨髓染色质的DNA、组蛋白和非组蛋白在试 管中重组后合成骨髓mRNA。 胸腺染色质的DNA、组蛋白和非组蛋白重组 后合成胸腺mRNA。 骨髓DNA和组蛋白与胸腺DNA和组蛋白混合 在一起，加入胸腺非组蛋白时，重组后合 成胸腺mRNA。若加入骨髓非组蛋白，则重 组后合成骨髓mRNA。,非组蛋白质决定相应的特定基因的转录 调节细胞中转录过程的因素是非组蛋白质。,特异蛋白的选择性基因表达主要在转录水平进行,DNARNA多肽,转录翻译,eg:性别决定,Testis-determining factor (TDF)或 sex-determining region Y (SRY) 决定人类性别决定,A.) Blood vessels B.) Head of epididymis C.) Efferent ductules D.) Seminiferous tubules E.) Parietal lamina of tunica vaginalis F.) Visceral lamina of tunica vaginalis G.) Cavity of tunica vaginalis H.) Tunica albuginea I.) Lobule of testis J.) Tail of epididymis K.) Body of epididymis L.) Mediastinum M.) Vas deferens,spermatozoa from origin as germ cells to exit from the vas deferens,HbGowerII (22) HbF (22)Hb Portland (22） HbF(22) HbA2 (22)Hb GowerI (22) HbA (22) 95 胚胎期 胎儿 成人,eg:小儿血象特点, G A 5 3,11p15, 2 1 5 3,16p13,珠蛋白基因簇,珠蛋白基因簇,珠蛋白基因簇,-类珠蛋白基因的表达机体发育的整个过程中，-类珠蛋白基因表达出现一次转换，即胚胎期基因胎儿/成人期基因。基因簇5-端的基因在卵黄囊期首先开启表达。第五、六周造血功能从卵黄囊转移到胎肝后，-基因表达基本关闭，基因表达开始活跃。, 2 1 5 3,胚胎期,胎儿/成人期,-类珠蛋白mRNA3-非翻译区内有一段16个碱基的嘧啶富含区，和mRNA的差异只是一个与CG的突变，使-mRNA与结合蛋白的结合大大降低，组装形成mRNA的能力较弱，且其poly（A）较短，所以mRNA容易降解。转录后加工在mRNA的清除和关闭过程中起着关键作用，被认为是转录后调控的一个模式。,mRNA的稳定性影响-基因表达关闭,LCR: locus control regions位点控制区,eg:Neuro-D1,动物卵细胞中贮存有大量mRNA，呈非均匀分布；用转录抑制剂放线菌素D处理海胆受精卵，胚胎发育仍能进行至囊胚期用蛋白质翻译抑制剂嘌呤霉素处理受精卵，受精卵停止发育。卵裂后的细胞质的特性决定了子细胞核的分化命运。昆虫以表面卵裂的方式形成胚层细胞的。迁入卵的后端极质部的细胞发育为原始生殖细胞，用紫外线照射这一区域，破坏极质，卵将发育为无生殖细胞的不育个体。,细胞分裂的不对称性,细胞的不对称分裂使姐妹细胞产生了差异在细胞分裂时一些重要的分子被不均等地分配到两个子细胞中,基因与细胞分化无论是母体mRNA的作用还是细胞间的相互作用，其结果是启动特定基因的表达。根据对果蝇、家蚕等实验动物的研究表明：卵受精后，首先表达的是母体基因；母体基因的产物是转录因子，沿胚的前后轴形成一个浓度梯度，决定了胚的前后位置和头尾区域；控制其它基因的表达：母体基因 间隙基因 成对基因体节极性基因同源异形基因（homeotic gene，Hox）,Gene and Development,母体基因,间隙基因,成对基因,体节极性基因,同源异形基因,同源异型基因决定身体各部分的特异性,干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。,按发育阶段: 胚胎干细胞(embryonic stem cell)成体干细胞(somatic stem cell)。按发育潜能：全能干细胞(totipotent stem cell,TSC)：受精卵 多能干细胞（pluripotent/multipotent stem cell）： 胚胎干细胞 、诱导多能干细胞单能干细胞（unipotent stem cell）：成肌细胞,干细胞分类,发育进程逐渐缩窄,干细胞命运各不相同，但分化机制相似：调控基因指导特异性基因的转录及特定蛋白质的合成，从而细胞逐步发展为具有专门功能的特定细胞类型。同样，干细胞也对邻近细胞的生长信号发生反应，导致特定基因活化及相应蛋白质合成，参与细胞分化、运动或与其它细胞作用以形成组织。,研究干细胞的根本目的应用干细胞治疗疾病,干细胞具有的能够稳定生存增殖并保持多向分化潜能的特性使其在遗传性疾病和组织器官移植领域有巨大的应用前景。,研究进展,诱导多能干细胞（iPS细胞）,通过转录因子的导入，成体终末细胞可以转化为多能干细胞；iPS技术的诞生，可以获得个体化的iPS细胞，从而实现干细胞的自体移植，同时避免胚胎干细胞的伦理争议。Yamanaka. S. Cell, 2006.,研究进展,转分化技术（Transdifferentiation）,转分化技术源自于iPS技术，同样是通过转录因子的导入，成体终末细胞可以转化为其他类型的细胞。如将成纤维细胞转分化为功能性的神经元、心肌细胞、胰岛细胞等。该技术的优势在于，可以直接将细胞转分化为目标细胞或目标细胞的干细胞，避免先经过iPS再进行分化的复杂阶段。是目前干细胞研究的热点。,研究进展,核转移胚胎干细胞（ntES细胞）,通过将成体终末细胞的细胞核移植到去核的卵母细胞中，激活后可以发育为囊胚并建立核转移胚胎干细胞系（即克隆胚胎干细胞），同样可以获得个体化的iPS细胞而实现干细胞的自体移植。 与iPS技术相比，ntES细胞的优点是不需要导入外源基因，其基因组和细胞性质更稳定；但核转移技术难度大，效率低下，同时因使用卵母细胞而具有伦理争议。,Mitalipov, S. Cell, 2013,2004年2月韩国首尔大学科学家黄禹锡在科学杂志上发表论文，宣布在世界上率先用卵子成功培育出人类胚胎干细胞；2005年5月，又在科学杂志上发表论文，宣布攻克了利用患者体细胞克隆胚胎干细胞的科学难题。首尔大学调查委员会发表最终调查报告宣布，黄禹锡这两项突破性研究的实验数据是伪造的。黄禹锡2005年培育出第一条克隆狗 （最早克隆动物是1996克隆羊Dolly）,通过令高度分化的体细胞接受外来刺激，可以使细胞回到类似于干细胞的状态，称为“刺激触发性多能性获得细胞（Stimulus-Triggered Acquisition of Pluripotency cells，STAP）。 小保方晴子在自然杂志上发表了干细胞研究堪称里程碑的论文，弱酸性溶液处理小鼠细胞使其退回到未分化状态，并具有分化成任何细胞的潜能。但论文涉嫌造假遭撤回，STAP重复失败。,2014年科学界最大的丑闻： 小保方晴子和STAP细胞,三、参与细胞分化的信号传导通路,1Delta-Notch信号系统调节细胞分化 2Wnt/Frizzled信号系统调节细胞分化,Delta-Notch信号传导系统的组成和结构,Delta配体家族 Notch受体: 胞外区：与配体结合并激活Notch 跨膜区：产生活化形式的Notch细胞内区域（Notch intra-celluar domain, NICD） 胞内区：与多种细胞内蛋白结合，对细胞内信号的转导具有关键作用 Notch信号通路下游目的基因HES、CSL或ESR基因家族 编码转录调节因子家族Mash1、NeuroD和Ngn1，是神经元分化基因的转录因子，提高细胞对分化信号的内源性反应能力而向神经元分化,配体与Notch受体结合后，由蛋白酶TACE切割产生受体胞外区，由-分泌酶切割后产生活化形式的Notch细胞内区域（Notch intra-celluar domain， NICD），NICD核转位进入细胞核后通过其转录激活域（transcriptional activation domain，TAD）与转录因子CSL结合并相互作用，调节靶基因表达。核内抑制因子（co-repressor，CoR）与转录因子CSL结合抑制基因表达；NICD与CSL结合后，CoR 解离，同时激活因子（co-activators，CoA）结合并启动靶基因表达。,Delta-Notch信号传递过程,Figure 1. Notch pathway elements,protease TACE gamma-secretase NIC ： Notch intra- celluar domainTAD ：transcriptional activation domain NLS：Nuclear localization signals CSL：CBF1/suppressor of hairless/Lag-1，transcription factor,Delta-Notch信号系统功能,主要功能: 参与胚胎的分化发育，在多种细胞如神经细胞、淋巴细胞、上皮细胞等细胞的分化中起中心作用。“旁侧抑制机制”（lateral inhibition）：正常神经系统发育时，腹侧初始状态相同的单层外胚层细胞中，正在分化的神经细胞周围的其他细胞不再向神经元方向分化，而发育成上皮细胞，从而使神经细胞从原来的单层细胞中分离出去。Notch信号是“旁侧抑制”机制的主要行使者。,Notch信号通路行使“旁侧抑制机制”（lateral inhibition）,神经元,神经元,上皮细胞,Delta-Notch信号系统抑制细胞分化,Notch的活化使神经元分化基因的转录因子Mash1、NeuroD和Ngn1蛋白的功能下降，抑制前体细胞分化为神经元。Notch还可和Groucho蛋白一起抑制Achaete-Scute complex(Ac-Sc) 等前神经元基因，而Ac-Sc基因产物是将神经系统和上皮系统进行分离的ASC蛋白。因而，Notch的活化可以抑制未分化的前体细胞向神经细胞特异分化。,Delta-Notch信号系统抑制细胞分化,在一丛细胞中，主要表达Delta配体的细胞为“发放信号”的细胞，向神经元方向分化，而其周围主要表达Notch受体的细胞为“接受信号”的细胞，抑制其分化为神经细胞，但仍保持进行各种分化的活性状态，该丛细胞中的不同的细胞系因此得以分隔。,Delta-Notch信号系统紊乱后果,当Notch功能缺陷时，旁侧抑制机制消失，神经元产生过多，可导致胚胎死亡，但当Notch过度活化或异位活化时，胚胎中的神经细胞分化受到抑制，也可导致一系列的发育异常。某些人类疾病，如Alzheimers病、伴有皮层下梗死的常染色体显性脑动脉病和脑白质病、Alagille综合征等均与Notch-Delta的异常密切相关。,Jos Luis de la Pompa (CSIC investigator) PhD 1990 Autnoma University, Spain，Postdoctoral work at EMBL (Germany) and Amgen Institute (Canada)，Group Leader at EMBL (Italy),Investigator at Institut de Recerca Oncologica (Spain),At the Centro Nacional de Biotecnologa since 9/2003,Wnt/Frizzled信号通路及其信号分子,细胞外因子（Wnt）跨膜受体（Frizzled，Fz）胞质蛋白(-catenin，-连环蛋白)核内转录因子(TCF) 靶基因：多数参与细胞增生与凋亡，如cyclinD1, c-myc,WNT与受体结合后,信号在细胞内的传递过程包含了Wnt/-catenin经典途径和磷脂酶C-Ca2 +介导的两条途径。,经典Wnt途径,在经典Wnt途径中，-catenin蛋白是主要的胞浆内效应分子,Wnt信号传递取决于游离-catenin的胞浆水平,Wnt途径活化可引起胞内-catenin水平升高,大量游离-catenin通过核膜进入细胞核,与LEF/TCF家族的转录因子形成复合物,引起转录激活,进而调控特定基因的表达。低密度脂蛋白受体相关蛋白5、6(LRP5、6)作为一种共受体,和Frizzled受体一道参与了对WNT信号的传递。,-catenin是存在于细胞浆内的一类大分子, 缺乏WNT信号刺激时,-catenin在糖原合成酶激酶-3(GSK-3) 的作用下,经N末端丝氨酸/苏氨酸磷酸化降解。当WNT和Frizzled受体结合后,后者通过一个保守的序列结合并激活胞浆内另一信号分子Disherelled(Dsh)分子,激活的Dsh抑制了GSK-3的磷酸化作用,进而抑制了-catenin的降解,保证了其在胞浆内较高的浓度水平。,Wnt途径,Wnt/Frizzled系统的功能：维持细胞分化的平衡，保持正常的细胞发育,WNT家族分子中有正、负调控分子，促进或抑制细胞分化为成熟组织。例如，骨组织分化过程中经历了以下演变：间充质细胞聚集增殖型软骨细胞前肥大型软骨细胞肥大型软骨细胞软骨细胞凋亡、坏死、血管侵入、软骨内骨化。正、负调控机制共同维持着一种动态的平衡：WNT4、8及3a在体内软骨的发育过程中主要起正调控作用，在细胞分化的后期促进软骨细胞向终末期及肥大型软骨细胞分化。WNT5a、5b及7a可抑制软骨细胞成熟，主要表现为抑制聚集的间充质细胞解聚，进而阻滞其进一步分化，其作用机制是通过稳定-连环蛋白和N-钙黏着蛋白的连接，导致后者持续高表达，细胞解聚不能完成，阻止细胞间缝隙连接的形成从而抑制细胞分化成熟。,组织形成中的基因表达,动物及人体的基本组织类型,人体约200种不同的分化细胞归为四类： 1上皮组织:来源于外胚层，如皮肤表层 2结缔组织:由中胚层产生的，分布在表皮之内各 器官组织之间，如韧带、纤维、血浆 3肌肉组织:来自中胚层，又有平滑肌、骨胳肌和 心肌，主要组分是肌原纤维 4神经组织:来自外胚层，由神经元和神经胶质细 胞组成,一、哺乳动物骨骼肌发育中的基因调节,1骨骼肌细胞发育包括3个阶段1）由胚胎的体节细胞出现细胞决定（分化方向）， 并分化为成肌细胞；2）成肌细胞向胚胎肢芽迁移并保持增殖能力；3）成肌细胞停止分裂，彼此融合成多核体细胞（或 肌管），伴随细胞融合的出现，对骨骼肌发育 及其功能有关的各种肌细胞特异基因的表达使其 分化为成熟的骨骼肌细胞。,骨骼肌细胞发育程序包括3个阶段,已鉴定出4种控制骨骼肌细胞发育的基因：myoD、myf 5、myogenin及mrf4，分别表达相应的myoD、myf 5、myogenin及mrf 4蛋白，统称为myoD家族蛋白。这些蛋白均具有碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）结构，属DNA结合蛋白并行使转录因子的功能。,myoD家族蛋白在形成同源及异源二聚体后可与基因调控区中的CANNTG序列（又称Ebox）相结合，通过DNA-protein相互作用， myoD构象改变从而诱导肌细胞特异性的基因转录。,myoD诱导肌细胞特异性基因转录,基因 表型 myoD家族敲除 存活 成肌细胞 肌细胞 蛋白功能myoD 能 + + 不详myf 5 能 + + 不详myoD、myf 5 否 - -成肌细胞形成必须myogenin否 + - 成肌细胞向肌细胞分化所必须,表 1 myoD 家族基因敲除对小鼠 骨骼肌细胞分化发育的影响,从体节细胞分化为成肌细胞时需myoD和myf 5两种蛋白;myogenin蛋白对成肌细胞融合并分化为成熟的骨骼肌细胞必不可少,细胞融合前只有myoD及myf5基因表达，myogenin基因只有在细胞融合发生后表达，且受myoD及myf 5表达的诱导。myoD及myf 5基因控制体节细胞分化为成肌细胞，而从成肌细胞发育为成熟的骨骼肌细胞则依赖于myogenin基因,体节细胞,骨骼肌细胞,成肌细胞,Myf5MyoD,Myogenin,骨骼肌细胞分化中的基因调节,成肌细胞中，肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、肌钙蛋白（与肌肉收缩有关）、磷酸肌酸激酶及乙酰胆碱受体（传递神经刺激）等特异性蛋白的基因活性处于休止状态。成肌细胞融合后，开始激活表达并使之最终分化为形态及功能成熟的骨骼肌细胞。,成肌细胞融合激活特异性蛋白表达,myoD家族蛋白,总结：,Ebox,构象改变,二聚化,myoD家族蛋白,诱导特异蛋白表达，如肌球蛋白等,成肌细胞融合,组合调控对特异性蛋白基因表达的调节,组合调控（combinatorial control）是指一组基因调节蛋白共同协调地决定对某一基因表达的调节方式。 组合调控可使细胞分化成特定的细胞类型：,若将MyoD基因引入取自鸡胚皮肤的体外培养的成纤维细胞出现成肌细胞的特征，并融合成多核肌肉样细胞，表达肌动蛋白、肌球蛋白并组成收缩装置，质膜产生受体蛋白及离子通道蛋白，接受来自神经的刺激。,MyoD基因与成纤维细胞的基因组合，诱导出成肌细胞样特征,但若将MyoD基因引入非成纤维细胞， 细胞不转变为肌肉样细胞，说明成纤维细胞中已积累了其他必需的基因调节蛋白，在加入MyoD蛋白后，能完成特异的基因调节蛋白的组合，从而启动肌肉细胞的分化。而非成纤维细胞由于缺乏其他必需的基因调节蛋白，不能完成特异的基因调节蛋白的组合，不能启动分化成肌肉细胞。,组合调控在特定器官的发育中也起调节作用。眼发育中，一种关键性基因调节蛋白（果蝇称为Ey）能决定眼的发育。若将Ey基因人为引入将要发育成腿的果蝇细胞，在腿部表达Ey蛋白的细胞发育成果蝇眼。提示Ey蛋白与一些基因调控区的结合位点结合后，通过组合调控直接调节这些基因的表达。,通过一组基因调节蛋白的组合调控，共同协调决定对某一基因表达,二、神经发生的调节,神经系统：外胚层神经管和神经嵴，神经管脑、脊髓及视网膜在内的中枢神经系统;神经嵴周围神经系统。,神经管及神经嵴细胞发育为神经母细胞后，其子细胞停止分裂时产生神经元细胞。神经元细胞两端生长出树突及轴突，轴突定向生长延伸至靶细胞部位，末端与靶细胞形成突触连接，最终从形态及功能上发育分化成熟。,神经元细胞分化,果蝇基因组中鉴定出一种约lOOkb的基因复合物 AS-complex （AS-c）。ASc对刚毛器官发育起调节作用。果蝇的刚毛器官是毛干细胞、神经元、鞘细胞和牙槽细胞等4种细胞构成的触觉器官。刚毛器的发育始于第二胸部体节的翅成虫盘细胞，经神经原细胞至神经前体细胞的发育, 前体细胞经过两次分裂后的4个子细胞发育成上述4种特化细胞。,神经元细胞分化过程中的基因,ASc含4种基因achaete（ac）、scute（sc）、Lethal of scute（Lsc）及asense（a），产物均为HLH蛋白。ac及sc两种基因在神经原细胞中表达，使其向神经前体细胞方向分化。发育至神经前体细胞时，ac及sc停止表达，a及其他有关基因开始表达并导致神经元分化。,神经元细胞分化过程中的基因表达,神经原细胞,神经前体细胞,ac,a,L-sc,sc,ac及sc的表达受另两种基因daughterless（da）及 extramachrochaete（emc）的调节，da及emc产物亦为bHLH蛋白，均可与ac及sc蛋白结合成异二聚体，前者通过调节转录促进神经原细胞向神经前体细胞分化，而后者则起抑制作用。Notch 和Delta蛋白抑制ac及sc基因的表达，并阻止向神经前体细胞方向分化。,神经元细胞分化过程中的基因表达调节,神经原细胞,神经前体细胞,ac,a,L-sc,sc,da(+),emc(-),Notch(-)Delta(-),Delta-Notch激活抑制神经元细胞分化,Notch的活化使神经元分化基因的转录因子Mash1、NeuroD和Ngn1蛋白的功能下降，抑制前体细胞分化为神经元。Notch还可和Groucho蛋白一起抑制Achaete-Scute complex(Ac-Sc) 等前神经元基因，而Ac-Sc基因产物是将神经系统和上皮系统进行分离的ASC蛋白。因而，Notch的活化可以抑制未分化的前体细胞向神经细胞特异分化。,Delta-Notch不平衡表达抑制细胞分化,邻近的细胞可能是在内、外源信号的作用下Notch和Delta的表达量有所不同，且随着时间的延长，两者的表达量差距越来越大。在一丛细胞中，主要表达Delta配体的细胞为“发放信号”的细胞，向神经元方向分化，而其周围主要表达Notch受体的细胞为“接受信号”的细胞，抑制其分化为神经细胞，但仍保持进行各种分化的活性状态，该丛细胞中的不同的细胞系因此得以分隔。,Delta-Notch信号系统紊乱后果,当Notch功能缺陷时，旁侧抑制机制消失，神经元产生过多，可导致胚胎死亡，但当Notch过度活化或异位活化时，胚胎中的神经细胞分化受到抑制，也可导致一系列的发育异常。某些人类疾病，如Alzheimers病、伴有皮层下梗死的常染色体显性脑动脉病和脑白质病、Alagille综合征等均与Notch-Delta的异常密切相关。,三、脂肪细胞的分化（白色和棕色脂肪组织 ）Adipocyte differentiation（White and brown adipose tissues）,White adipose tissue,For letter symbols, see slide 36,WAT,BAT,For letter symbols, see slide 36,Characteristics of brown and white adipocytes,White adipocyte,Unilocular adipocyte ( 200m)Lipid storage and mobilization (+)Mitochondria (+)Fatty acid oxidation (+)Respiratory chain (+)UCP1 (0)PGC-1a (+),proliferation,fat cell-specific gene expression,differentiation,Transcriptional control of adipocyte differentiation,J. Lipid Res., 2002, 43, 835-860,SREBP1c: Sterol Regulatory Element Binding Protein 1cRXR: Retinoid X receptorPPAR: Peroxisome proliferator-activated receptorsC/EBP: CCAAT/enhancer-binding protein,Genes Dev, 2000, 14, 1293-1307,Thermogenesis,Fat storage &mobilizationEndocrine organ,PGC-1a,Biochem J. 2006 398:153-68,PRDM16,PGC-1a:perosome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,Macrophages,Adipocytes,Preadipocytes,Endothelial cells,Monocytes,Lymphocytes,Cell types in white adipose tissue- adipocytes (lipid-filled cells) 30%- preadipocytes and fibroblasts- matrix of collagen fibres- blood vessels (capillaries/endothelial cells)- immune c