微生物发酵制药工艺课件.ppt

第2章 微生物发酵制药工艺,2,本章内容,2.1 微生物发酵与制药2.2 制药微生物生长与生产关系2.3 制药微生物菌种的建立2.4 培养基制备2.5 灭菌工艺2.6 微生物发酵培养技术2.7 发酵工艺过程的控制2.8 抗生素生产工艺2.9 氨基酸发酵生产工艺2.10 维生素生产工艺,3,2.1 微生物发酵与制药,4,一 发酵概念,发酵概念：通过微生物培养而获得产物的过程。发酵种类：用产品说明，冠以产物名而成，如青霉素发酵，维生素发酵；发酵工程按需氧分为好氧发酵和厌氧发酵。 初级代谢产物：在初级代谢过程中形成的产物，包括各种小分子前体、单体和多糖、蛋白质、脂肪、核酸等。生长所必须的。几乎所有生物初级代谢基本相同。氨基酸，核苷酸，有机酸。次级代谢产物：比较复杂的化合物，不是细胞生长必需的，对生命活动有意义（抗逆境条件）。抗生素，毒素，色素。,5,发酵制药种类,微生物菌体发酵微生物菌体发酵是以获得微生物菌体为目的，如：面包的酵母发酵、单细胞蛋白发酵（利用各种碳源）、真菌类（各种蘑菇、冬虫夏草）、生物防治剂（苏云金杆菌，伴孢晶体可以毒杀鳞翅目、双翅目害虫）。微生物酶发酵微生物酶发酵是以获得酶为目的的发酵，如青霉素酰化酶，用于半合成青霉素时，制备中间体6氨基青霉烷酸。微生物代谢产物发酵初级代谢产物：氨基酸，核苷酸，维生素，有机酸。次级代谢产物：最主要的是抗生素。微生物转化发酵利用微生物的一种或多种酶把一种化合物转变为结构相关的更有价值的产物的生化反应为转化发酵。,6,制药微生物的种类,生产药物的天然微生物主要包括细菌、放线菌和丝状真菌三大类。细菌主要生产环状或链状多肽类抗生素，如芽孢杆菌(Bacillus)产生杆菌肽（bacitracin），多黏芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）产生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。细菌还可以产生氨基酸和维生素，如黄色短杆菌（Brevibacterium flarum）产生谷氨酸，大小菌生产维生素C。放线菌主要产生各类抗生素，以链霉菌属最多，诺卡菌属较少，还有小单孢菌属。生产的抗生素主要有氨基糖苷类（链霉素、新霉素、卡那霉素等）、四环类（四环素、金霉素、土霉素等）、放线菌素类（放线菌素D）大环内酯类（红霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大环内酯类（制霉菌素、抗滴虫霉素等）。酸性、碱性和中性，但以碱性为多。真菌的曲菌属产生桔霉素，青霉素菌属产生青霉素和灰黄霉素等，头孢菌属产生头孢霉素等。脂环芳香类或简单的氧杂环类，多为酸性化合物。,7,发酵制药的基本过程,菌种选育,发酵工段,提炼工段,成品工段,孢子制备,种子制备,发酵控制,预处理分离提取浓缩纯化,成品工段,包装,原料药,实验室、种子库,发酵车间,提炼车间,包装车间,8,2.3 制药微生物菌种的建立,9,新药生产菌的选育,自然分离 自然选育 诱变育种 杂交育种 基因工程技术育种 基因组shuffling技术,10,2.8 抗生素生产工艺,以青霉素为例,11,一 概述发现,1929: Fleming在葡萄球菌培养皿中，污染的霉菌周围出现透明的抑菌圈。杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药物。1939：牛津病理家Howard Florey化学家Ernst Chain,Norman Heatley。发酵瓶培养霉菌，培养里提取，测活性，青霉素结晶。,12,发展,1940：8只鼠注射链球菌，提取物对4只治疗。未经治疗鼠在24小时内死亡，治疗鼠存活数天至数周。1941年2月开始治疗第一批人类病人。1943：威斯康辛大学小组，取得突破生产菌表面培养：几十个单位。深层培养产黄青霉：100U/ml。X、UV诱变育种：10001500U/ml。不产色素变种：6600070000U/ml目前：85000U/ml。,13,概述作用机理,细胞壁合成中的肽多糖合成的第三阶段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽类似物竞争性与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。生长中的细胞有效，静止细胞无效高效、安全的抗细菌感染药物,14,概述应用,临床抗感染治疗：大多数革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体等。毒性小，但需要皮试。各种半合成抗生素的原料：氨苄青霉素，磺苄青霉素，乙氧萘青霉素头孢菌素母核。,15,二 青霉素生产菌的生物学特性,产黄青霉：Penicillium chrosogenum孢子:绿色和黄色菌落：平坦或皱褶，圆形。,青霉穗:分生孢子链状深层培养菌丝：球状和丝状两种。,16,发酵条件下的生长过程,第1期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。第2期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。第3期：形成脂肪包涵体，机理贮藏物，没有空泡，嗜碱性很强。第4期：脂肪包涵体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生素。第5期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。第6期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶状。释放游离氨，pH上升。第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。,17,镜检,规定时间取样，显微镜观察7个时期的形态变化，控制发酵。14期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子。45期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。在第六期到来之前结束发酵。,18,三 发酵工艺过程,19,1 生产孢子制备工,斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固体培养基进行培养。米孢子：移植到小米或大米固体培养基上，生长7天，25。注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。,20,2 种子罐培养工艺,一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。空气流量1：3（体积比）；300-350rpm；pH自然，温度271, 40h二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等。1:1-1.5；250-280rpm；pH自然，251。10-14h质量：菌丝致密，菌丝粗壮，III期，倍增期6-8h,21,3 生产罐培养工艺,三级罐：生产罐；接种量20。培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3, 玉米油, 硅油。参数条件：通气量1：0.8-1.2；150-200r/min；前60小时:pH6.4-6.6，26；60小时后: pH6.7, 24。,22,4 发酵培养与过程控制,操作方式：反复分批式发酵。发酵罐：100M3，装料80M3。带放: 6-10次，带放量10，间隔24h。发酵周期：180-220h。,23,（1）过程控制补料分批操作控制基质浓度,前40小时：培养基中的主要营养物40小时后：低速连续补加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，维持一定的最适浓度。半饥饿状态：延长合成期，提高产量。碳源占成本12以上，采用糖化液流加,降低成本。糖与6APA结合形成糖基-6APA，影响青霉素产量。,24,流加碳源控制,根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。葡萄糖的波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶。残糖0.3-0.6左右，pH开始升高时流加糖。浓度：500kg/m3，流速:1.0-2.5kg/m3h。,25,流加氮源控制,玉米浆: 最好，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。补加无机氮源：硫酸铵、氨水、尿素。氨基氮浓度：0.01-0.05%。,26,盐离子控制,无机盐：硫、磷、镁、钾等。铁对青霉素合成有毒，30-40 ug/ml以下。罐壁涂环氧树脂保护层。,27,（2）添加青霉素侧链前体,时期：合成阶段。种类：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸。毒性：抑制细胞生长和青霉素合成。策略：低浓度流加。浓度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%。控制：保持供应速率略大于生物合成需要。,28,提高产量的其他物质流加,表面活性剂：新洁尔灭、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯、三油酸酯可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇其他：剪切保护剂；分散剂,29,（3）温度控制,适宜菌丝生长温度30，分泌青霉素20。20青霉素破坏少，周期很长。变温控制，不同阶段不同温度。生长阶段:较高温度，缩短生长时间；生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。前期控制26左右，后期降温控制24。,30,（4）pH控制,合成适宜pH6.46.6左右，避免超过7.0直接加酸或碱：自动控制流加葡萄糖：恒速；变速，依赖pH变化快慢。pH下降：补加CaCO3、通氨、尿素或提高通气量pH上升：补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）,31,（5）溶氧控制,30饱和度，产率急剧下降；10，造成不可逆的损害。临界溶氧浓度：30。通气比：1：0.81.5 。适宜的搅拌速度:保证气液混合，提高溶氧。调整搅拌转速:各阶段的生长和耗氧量不同。,32,（6）消沫,天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。策略：少量多次。注意：前期不宜多加入，影响呼吸代谢。,33,四 提炼工艺过程,青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定易溶于有机溶剂，水中溶解度很小青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性防止降解，条件温和、快速。,34,1 预处理,青霉素的存在部位：发酵液。浓度较低：1030kg/m3。含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等。目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。预处理:发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白。,35,2 过滤,鼓式真空过滤机过滤：一次滤液：pH6.2-7.2，略浑，棕黄或绿色，蛋白质含量0. 5-2.0%。板框式过滤机过滤：硫酸调节pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土为助虑剂。二次滤液：澄清透明，用于提取（收率90）,36,3、溶剂萃取,原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而霉素盐易溶于水。萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白质：加0.05-0.1%乳化剂PPB。萃取：23次。,37,逆流萃取过程,正相萃取：酸化pH1.8-2.0，滤液：醋酸丁酯1：0.3，碟片式离心机分离（浓缩1.5-2.1）反相萃取：pH6.8-7.4（磷酸盐、碳酸盐缓冲液）。把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。反复萃取23次，达到结晶要求。萃取条件：10下。萃取罐冷冻盐水冷却。,38,4 脱色,萃取液中添加活性炭，除去色素。过滤，除去活性炭。,39,5 结晶直接结晶,加醋酸钠乙醇溶液反应：得到结晶钠盐。加醋酸钾乙醇溶液：得到青霉素钾盐。,40,5 结晶共沸蒸馏结晶,萃取液，再用0.5 M NaOH萃取pH6.4-6.8下得到钠盐水浓缩液。加3-4倍体积丁醇，16-26，真空0.67-1.3KPa）下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥（60真空16h），磨粉，装桶，得到青霉素产品。,41,2.9 氨基酸发酵生产工艺,42,一 氨基酸类药物得基本概念,氨基酸,43,氨基酸及其衍生物在医药中的应用,氨基酸的营养价值及其与疾病治疗的关系必需氨基酸人和哺乳动物自身不能合成，需要由食物供应，称为必需氨基酸。赖氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，苏氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸等8种。治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸及其盐酸盐，谷氨酰胺，乙酰谷酰胺铝，甘氨酸及其铝盐，硫酸甘氨酸铁，维生素U及组氨酸盐酸盐等。治疗肝病的氨基酸及其衍生物精氨酸盐酸盐，磷葡精氨酸，鸟天氨酸，谷氨酸钠，蛋氨酸，乙酰蛋氨酸，瓜氨酸，赖氨酸盐酸盐，及天冬氨酸等。,44,治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸钙盐及镁盐，氢溴酸谷氨酸，色氨酸，5羟色氨酸、左旋多巴等。用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物偶氮丝氨酸，氯苯丙氨酸，磷天冬氨酸及重氮氧代正亮氨酸等。其它氨基酸类药物的临床应用,45,二 氨基酸类药物的生产方法,1 发酵法2 水解法3 酶法转化,46,L异亮氨酸的制备,培养液,灭菌,灭菌培养液,菌种培养,接种,发酵,发酵液,过滤,上层液,酸化,滤液,离子交换,洗脱液,减压蒸馏,浓缩液,活性炭脱色,滤液,减压浓缩,浓缩液,氨水中和,沉淀,水,结晶,干燥,L异亮氨酸成品,1 发酵法,47,工艺过程,1）菌种培养种子培养基组成（）为：葡萄糖2，尿素0.3，玉米浆2.5，豆饼水解液0.1，pH6.5。二级种子培养基加菜籽油，其余同一级种子培养基。一级种子培养：1000ml三角烧瓶中培养基装量为200ml，接种一环牛肉膏斜面AS1.998菌种，摇床3016h。二级种子培养：接种量3.5，培养8h。逐级放大。2）灭菌、发酵发酵培养液组成（）：硫酸铵4.5，豆饼水解液0.4，玉米浆2.0，碳酸钙4.5，pH7.2，淀粉水解还原糖粗糖浓度11.5。灭菌，接种1菌种（v/v），搅拌，发酵。,48,3）除菌体，酸化发酵结束后，发酵液加热至100并维持10min，冷却过滤，滤液加工业硫酸和草酸至pH3.5，过滤除沉淀。4）离子交换、吸附分离上述滤液每分钟以树脂量1.5的流速进H型732离子交换柱（40 100cm), 以100L去离子水洗柱，再以60,0.5mol/L氨水按3L/min的流速进行洗脱。分部收集洗脱液。5）浓缩赶氨6）脱色、浓缩、中和7）精制，烘干,49,1 水解法,（一）基本原理蛋白质水解方法酸水解法、碱水解法、酶水解法氨基酸分离方法溶解度法、特殊试剂沉淀法、吸附法、离子交换法氨基酸精制方法结晶，重结晶,50,L胱氨酸的制备：,人发或猪毛,水解液,L半胱氨酸粗品,滤液,L半胱氨酸粗品,滤液,L半胱氨酸,盐酸水解,氢氧化钠中和,盐酸，活性炭,氢氧化钠中和,盐酸，活性炭,中和，氨水,水解法举例,51,延胡索酸NH3,固定化天冬氨酸酶,转化,转化液,LAsp粗品,分离,L-Asp精品,转化液,固定化LAsp脱羧酶,浓缩结晶,LAla粗品,LAla精品,精制,3 酶法转化,天冬氨酸和丙氨酸的制备,52,工艺过程,1）菌种培养大肠杆菌（E. coli） AS 1.881 的培养斜面培养基为普通肉汁培养基摇瓶培养基成分（）：玉米浆7.5，反丁烯二酸2.0，硫酸镁（7水）0.02，氨水调pH6.0，煮沸后过滤，500ml三角烧瓶中装液量50-100ml。从新鲜斜面上或液体中培养种子，接种子于摇瓶培养基中，37振摇培养24h，逐级扩大培养至10002000ml规模。培养结束后用1mol/L HCl调pH5.0，升温至45并保温1h，冷却至室温，离心收集菌体。德阿昆哈假单胞（Pseudomonas dacunhae）68变异株的培养斜面培养基组成（）为蛋白胨0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，NaCl0.5，pH7.0，琼脂2.0。种子培养基与斜面培养基，不加琼脂，250ml三角烧瓶中培养基装量40ml。摇瓶培养基组成（）为L谷氨酸3.0，蛋白胨，酪蛋白水解液0.5，磷酸二氢钾0.05，MgSO4.7H2O 0.01，用氨水调pH7.2，500ml三角烧瓶中培养基装量为80ml。将培养24h的新鲜斜面菌种接种于种子培养基中，30振摇培养8h，再接种于摇瓶培养基中， 30振摇培养24h，逐级放大。,53,2）细胞固定化E coli的细胞固定化取湿菌体20kg，悬浮于生理盐水中，保温至40，再加入90L保温至40的12明胶溶液及10L1.0戊二醛溶液，充分搅拌均匀，放置冷却凝固，再浸入0.25戊二醛溶液中。于5过夜后，切成35mm的立体小方块，浸入0.25戊二醛溶液5过夜，蒸馏水充分洗涤，滤干得含天冬氨酸酶得固定化。假单胞菌体固定取湿菌体20kg，加生理盐水搅拌至稀释至40L，另取溶于生理盐水的5角叉菜胶溶液85L，两液均保温至45后混合，冷却至5成胶。浸于600L2KCl和0.2mol/L已二胺的0.5mol/L pH7.0的磷酸缓冲液中，5下搅拌10min，加戊二醛至0.6mol/L浓度， 5搅拌30min，取出切成35mm的立体方块，用2KCl溶液充分洗涤后，滤去洗涤液，即得固定化脱羧细胞。,54,3）生物反应堆的制备4）转化反应5）产品纯化与精制,55,L脯氨酸,4 化学合成法,56,L谷氨酸乙醇,硫酸,三乙胺,L谷氨酸乙酯,KBH4,还原,LPro反应液,五氯酚,沉淀,氨水解析,滤液,活性炭,滤液,乙醚,固形物,精制,L脯氨酸成品,57,2.10 维生素生产工艺,58,一 概述,维生素是一类生物生长发育起调节作用的、化学结构不同的、小分子有机化合物，人体内不能合成，必须从食物等中摄取。人体需求量很少，但不足时，出现相应的缺乏症。已知维生素13种，根据溶解性，一般分为水溶性和脂溶性维生素两类。主要维生素的生产有三种方法。2002年我国维生素原料产量达8.2万吨，其中维生素C超过5万吨，成为世界上最大的原料药生产国和出口国。维生素制剂年产量260280亿支/片/瓶，以片剂、注射液和胶囊为主。,59,2 维生素C生产工艺,目前，工业上生产维生素C采用二步发酵法，此法是在1975年由中国科学院上海生物技术研究所研究出来的，属我国首创。发酵法生产维生素C可以分为发酵、提取和转化三大步骤。即先从D-山梨醇发酵，提取出维生素C前体2-酮基-L-古龙酸，再用化学法转化为维生素C。第一步发酵黑醋酸菌（Acetobacter suboxydans）经种子扩大培养，接入发酵罐，种子和发酵培养基主要包括山梨醇、玉米浆、酵母膏、碳酸钙等成份，pH 5.05.2。醇浓度控制在2427%，培养温度2930 ，发酵结束后，发酵液经低温灭菌，移入第二步发酵罐作原料。D-山梨醇转化L-山梨糖的生物转化率达98%以上。,60,第二步发酵氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans，小菌)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，大菌)混合培养。生产维生素C的发酵罐均在100 m3以上，瘦长型，无机械搅拌，采用气升式搅拌。种子和发酵培养基的成份类似,主要有L-山梨糖、玉米浆、尿素、碳酸钙、磷酸二氢钾等，pH 值为7.0。大、小菌经二级种子扩大培养，接入含有第一步发酵液的发酵罐中，2930 下通入大量无菌空气搅拌，培养72h左右结束发酵，L-山梨糖生成2-酮基-L-古龙酸的转化率可达7085%。 2-酮基-L-古龙酸的分离提纯经二步发酵法两次发酵以后，发酵液中仅含8%左右的2-酮基-L-古龙酸，且残留菌丝体、蛋白质和悬浮的固体颗粒等杂质，常采用加热沉淀法、化学凝聚法、超滤法分离提纯。传统工艺是加热沉淀法，发酵液经静置沉降后通过732氢型离子交换树脂柱，调节pH至蛋白质等电点，并加热使蛋白质凝固，然后用高速离心机分离出菌丝、蛋白和微粒，清液再次通过阳离子交换柱，酸化为2-酮基-L-古龙酸的水溶液，浓缩结晶后得到2-酮基-L-古龙酸。,61,2-酮基-L-古龙酸的化学转化将维生素C前体2-酮基-L-古龙酸转化为维生素C，常采用碱转化法。2-酮基-L-古龙酸在甲醇中用浓硫酸催化酯化生成2-酮基-L-古龙酸甲酯，加NaHCO3转化生成维生素C钠盐，经氢型离子交换树脂酸化得到维生素C。粗品经结晶精制得维生素C成品。,62,3 维生素B2生产工艺,维生素B2（vitamin B2）又称核黄素(riboflavin)，国内约有l0家核黄素生产商。目前国内外广泛采用微生物发酵法工业生产维生素B2。能够产生维生素B2 的微生物有细菌、真菌和霉菌，工业生产中主要以阿舒假囊酵母(Eremotherecium ashbyii)为生产菌种。维生素B2 的工业发酵一般为二级发酵，发酵液先沉淀再氧化进行分离提纯。,63,发酵培养基中以植物油、葡萄糖、糖蜜或大米等作为主要碳源，植物油中以豆油对维生素B2产量的促进效果最为显著,有机氮源以蛋白胨、骨胶、鱼粉、玉米浆为主，无机盐有NaCl、K2HPO4、MgSO4。种子扩大培养和发酵的通气量要求均比较高，通气比一般在1.0，罐压0.05 MPa左右，搅拌功率要求比较高。阿舒假囊酵母的最适生长温度在2830 ，种子培养3438h后接入发酵罐，发酵培养40h后开始连续流加补糖，发酵液的pH值控制在5.46.2,发酵周期为150160h。维生素B2的产量在50 g/L左右。维生素B2的分离提取与纯化发酵液酸化后加热,然后加入黄血盐、硫酸锌沉淀蛋白，过滤后滤液调pH 1.52.0酸化，静置2040h沉淀，压滤后将沉淀物酸溶，加入硝酸铵，氧化抽提，氧化液经结晶、过滤后，湿晶在80 以下干燥20h，得到维生素B2成品。,64,本章结束,