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筛选具有优良组织培养特性的小麦品种及成熟胚半胚培养的有效性生物科学2002级 陈黎指导教师 晏本菊 教授摘 要：为了筛选具有良好组织培养特性的优良小麦品种作为转基因受体，使转基因小麦能尽快得到应用，四个小麦品种绵阳11、川农12、川农17、川农18的幼胚和成熟胚以及七个2004年参加四川省区试的小麦品系的成熟胚被用来进行离体培养，考察其组织培养特性。结果表明，十三个品种（系）的成熟胚成愈率都达90%以上，但成熟胚来源的愈伤组织的植株再生率存在很大差异：七个小麦品系的植株再生率都低于20%，而四个小麦品种的植株再生率都达35%以上。另外，四个小麦品种的幼胚成愈率及植株再生率都分别达90%和63%以上。因此本研究为小麦的遗传转化提供了几个新的优良受体品种。而且，本研究进行成熟胚培养时，采用半胚培养的方式，一方面有效地克服了成熟胚在诱导培养基上直接萌发的现象，另一方面提高了成熟胚来源的愈伤组织分化为多苗的能力。该再生体系可以作为小麦胚培养的参考。关键词：小麦，幼胚，成熟胚，组织培养特性，植株再生Culling elite wheat cultivars with good tissue culture response and cultivating half-mature embryos effectivelyChen Li Biological Science, Grade 2002 Directed by Yan Benju (Prof. Ph. D)Abstract: In order to screen elite wheat cultivars with good tissue culture response as recipients of wheat transformation and speed up the application of transgenic wheat, the immature and mature embryos of four wheat cultivars “Chuannong12”, “Chuannong17”, “Chuangnong18”, “Mianyang11” and of seven wheat lines, which were used for area test in Sichuan province in 2004, were cultured in vitro. The results indicate that mean callus induction rate of mature embryos was over 90%. However, significant differences were observed among the callus initiated from these mature embryos. The plant regeneration rate of callus initiated from mature embryo of the seven wheat lines were less than 20% and plant regeneration rate of callus initiated from mature embryo of the four wheat cultivars were more than 35%. Moreover, the callus induction rate and plant regeneration rate of immature embryos of the four wheat cultivars were in excess of 90% and 63%, respectively. So this research supplies three new elite recipient cultivars for wheat transformation. Furthermore, in this research, half-mature embryos were cultivated, which can decrease efficiently germination of embryos in callus induction media and increase the multiple-plantlet regeneration rate of callus from mature embryos. This wheat plant regeneration system could be a reference for other wheat genotypes.Keyword: wheat,immature embryo, mature embryo,tissue culture response,plant regeneration rate小麦是世界上种植面积和产量均居榜首的重要粮食作物。综合世界粮农组织(FAO)的统计报告，1999年，世界小麦种植面积达2.14亿hm2，1997和1999年世界平均总产量为5.88亿t。而且小麦蛋白质含量可达其干重的10%，是人类蛋白质的主要摄入来源 1。实践证明，利用植物基因工程改良小麦品质是一个行之有效的途径。虽然转化方法较多并且日趋成熟，但限制其发展的一个重要因素是小麦的植株再生频率低，而且建立稳定的小麦再生体系也比较困难。所以，在小麦组织培养过程中，建立高频率的植株再生体系是小麦转化成功的重要基础和保证，而研究小麦组织培养条件和植株再生频率的影响因素则是小麦生物技术育种中一个亟待解决的课题。众所周知，转基因方法在小麦的改良中起着举止轻重的作用。通过转基因的方法，可以将单个外源优良基因导入小麦而不受种间不亲和性的干扰。另外也不会把不利基因导入小麦背景中。然而，转基因小麦的实际应用还受到很多的限制。主要有两方面原因：一是不能找到大量合适的外源基因受体。 在目前的小麦转基因方案中，通过组织培养获得转基因植株的方法还不能被忽视。这就要求转基因受体具有良好的组织培养特性。此外，外源基因受体的整体农艺性状必须优良，这样才能更快获得能用于大田生产的转基因小麦。目前已被审定推广的优良小麦品种很多，但我们并不清楚哪些品种具有优良的组织培养特性。因此我们需要从这些优良的小麦品种中不断地筛选出组织培养特性好的品种作为转基因受体，这样的筛选工作可以促进小麦转基因研究的发展。二是小麦组织培养方案中外植体的选择范围狭窄，主要集中于幼胚和成熟胚两种植体。虽然研究者们普遍认为幼胚是小麦组织培养的最佳外植体2，3，前人也在小麦成熟胚的离体培养方面已取得很大进展4，5，这为小麦转基因研究提供了一个方便的途径。然而，小麦胚的组织培养特性受基因型的影响极大2，69，因此找到适合于某些优良小麦品种的植株再生体系也是必要的。本研究考察了十三个小麦品种（系）的幼胚及成熟胚的组织培养特性，建立了一个比较有效的小麦植株再生体系，筛选出优良的具有组织培养特性的小麦品种，并比较成熟胚和半胚培养的有效性，为小麦转基因的研究提供参考。1 试验材料与方法1.1 材料实验材料包括在2004年四川省区试中表现高产的七个小麦品系CP93-17-31、G33、2L-21、SW18155、02048、640002和小观54的种子；四个小麦品种绵阳11、川农12、川农17和川农18的种子和幼胚。1.2 培养基愈伤组织诱导培养基和继代培养基：MS2 mg/L 2，4D0.1 g/L水解酪蛋白30 g /L蔗糖；分化培养基：MS2 mg /L KT 0.5 g /L水解酪蛋白20 g /L蔗糖；生根培养基：1/2MS0.1 mg/L KT+0.5 mg/L NAA20g/L蔗糖。所有培养基用8 g/L琼脂固化，pH调至5.8， 121下经1.1 kg/m2高压湿热灭菌20min。1.3 小麦成熟胚、幼胚的离体培养成熟胚培养：选择饱满种子，用75%乙醇消毒5min，换以0.1% HgCl2消毒25min，无菌水冲洗56次，置于适量无菌水中，室温下浸泡1416h，然后剥离成熟胚，横切为两段，将含胚芽的一段（以后称为半胚）接种于诱导培养基上。其中一部分胚以完整胚（以后称为全胚）的形式接种，以便和半胚比较培养效果。 幼胚培养：取开花后14 d的四个小麦品种的幼嫩种子，用75%乙醇消毒1min，再用0.1% HgCl2消毒10min，无菌水冲洗56次，剥离幼胚接种于诱导培养基上。每个品种都接种120枚半胚、120枚全胚和120枚幼胚，各设3次重复。将胚放置在24±2的条件下暗培养以诱导愈伤组织。形成的愈伤组织每隔7d继代一次，成熟胚愈伤组织在继代培养基中共培养28 d。幼胚愈伤组织在继代培养基中共培养49 d，继代时除去直接萌发出芽的愈伤组织，随后将60枚愈伤组织转入分化培养基中，于24±2、16 h光照（2000Lux）条件下培养，设3次重复。1.4数据统计及处理萌发率（在诱导培养基上直接萌发的胚数/120）×100%出愈率（愈伤组织块数/120）×100%分化率（分化出苗的愈伤组织数/60）×100%多苗率（分化出多苗的愈伤组织数/60）×100% 对所得数据进行F检验及t-检验分析。因七个小麦品系的成熟胚愈伤组织的分化率远低于四个小麦品种的成熟胚愈伤组织的分化率，所以七个小麦品系的植株再生率没有参与比较。2 试验结果与分析2.1小麦胚的成愈率比较 供试的十三个小麦品种（系）的半胚、全胚及幼胚的平均成愈率都在90%以上。十三个品种（系）之间相比，半胚和全胚的成愈率都无显著差异（半胚：F= 0.226 ，全胚：F0.213，F0.052.30）。这表明愈伤组织的诱导无基因型差异。且半胚和全胚的成愈率也无显著差异（F=0.147，F0.05 2.30），表明成熟胚被分为两半后不影响愈伤组织的形成。另外，四个小麦品种的幼胚和半胚之间相比，其成愈率无显著差异（表1），表明半胚形成愈伤组织的能力和幼胚相似。表1 四个小麦品种幼胚和半胚平均成愈率（）比较Table 1 mean callus induction rate (%) of immature embryoand half-mature embryo of four wheat varieties小麦品种varieties幼胚成愈率(%)callus induction rate of immature embryo半胚成愈率(%)callus induction rate of half of mature embryot值t-value川农1292.7891.940.313ns川农1792.5091.381.265ns川农1891.9491.380.707ns绵阳1195.2591.941.211nsns表示在p0.05的水平上差异不显著。ns means no sign difference at p=0.05.2.2半胚与全胚发芽率比较 成熟胚在形成愈伤组织的同时，其胚芽会直接萌发成苗。全胚的萌发现象最为严重，平均萌发率在43%以上。半胚的萌发率明显比全胚低，平均在9%以下。全胚和半胚的萌发率存在显著差异（F= 74.199，F0.05= 2.30），表明半胚能很好地克服胚直接萌发的现象。而十三个品种之间相比，半胚和全胚萌发率无显著差异（半胚：F= 0.238，全胚：F=0.441，F0.05= 2.30）。这表明在这十三个品种（系）中，胚直接萌发的现象无基因型影响。2.3基因型不同及来源不同的愈伤组织对植株再生的影响 供试的七个小麦品系的半胚和全胚所形成的愈伤组织，其植株再生率都分别在15%和20%以下，明显低于四个小麦品种相应愈伤组织的植株再生率，因此没参与比较。这说明植株再生率存在基因型差异。四个小麦品种的半胚和全胚所形成的愈伤组织，其植株再生率分别都达35%和47%以上（表2），且四个小麦品种之间无显著差异（半胚：F= 2.458，全胚：F=1.733，F0.05(3,8)= 4.07）。半胚和全胚来源的愈伤组织都能分化出多苗（图1A）。尽管全胚愈伤组织的植株再生率比半胚愈伤组织的植株再生率高，且两者之间存在明显差异（表2），但半胚来源的愈伤组织分化多苗的能力远远高于全胚来源的愈伤组织（表2）。而四个小麦品种的幼胚形成的愈伤组织的植株再生率都在63%以上（表3），且品种之间不存在显著差异（F= 0.247，F0.05=4.07）。幼胚来源的愈伤组织的植株再生能力比半胚来源的愈伤组织高（表3），且四个品种幼胚来源的愈伤组织全都分化为多苗（图1B）。表2 半胚、全胚愈伤组织植株再生率（）、多苗率（）比较Table 2 mean plant and multiple-plantlet regeneration frequency (%) of callus induced from intact mature embryo and half - mature embryo品种varieties植株再生率plant regeneration rate(%)多苗率mean multiple-plantlet regeneration frequency(%)半胚全胚t-值半胚全胚t-值川农1237.6749.447.297*21.117.7816.971*川农1736.6748.8911.000*20.008.899.998*川农1835.5647.7815.556*18.897.7714.142*绵阳1138.3350.5611.000*21.679.4411.000*表示在p0.01水平上差异极限著。* means significant difference at p=0.01 .图1A 箭头所指是分化的多苗 图1B幼胚愈伤组织上的多苗表3 四个品种的幼胚和半胚的愈伤组织平均分化率（）比较Table3 mean plant regeneration frequency (%) of callus induced fromimmature embryo and half-mature embryo in four wheat varieties小麦品种varieties半胚愈伤组织分化率 plant regeneration frequency of callus induced from half-mature embryo (%)幼胚愈伤组织分化regeneration frequency of callus induced from immature embryo (%)t 值t-value川农1237.6763.3321.927*川农1736.6762.7811.750*川农1835.5662.2216.971*绵阳1138.3363.8917.387*表示在p0.01水平上差异极显著。* means significant difference at p=0.013 讨论在小麦转基因研究过程中,选择不恰当的小麦品种作为受体会给小麦品种的改良带来困难。比如选择农艺性状差的小麦作转基因受体就难以从整体水平上使小麦得到改良。众所周知，小麦品种Bobwhite具有良好的组织培养特性，但因其整体农艺性状欠佳，通过转基因的方法并没有使其得到改良并被推广应用。因此为了尽快使小麦转基因得到应用，有必要从大量已审定并推广的优秀小麦品种中筛选具有优良组织培养特性的品种作为转基因受体，而且这项工作应当持续开展。本实验结果表明，供试的十三个品种（系）中，四个小麦品种具有较好的组织培养特性，并且川农12、川农17和川农18具有高产、抗病、抗衰老等优良的农艺性状10,11。因此这几个小麦品种在小麦转基因研究中具有潜在的优势。供试的四个品种中，绵阳11是其余三个品种的亲本之一10,11，有可能川农12、川农17、川农18的优良组织培养特性来源于绵阳11。这几个品种可以用来进一步研究小麦胚组织培养特性的遗传规律。在本研究中，虽然幼胚表现出了比成熟胚更好的组织培养特性，但成熟胚取材方便并且也表现出了较好的组织培养特性。因此，在没有幼胚的情况下，可以作为替代幼胚的外植体。对于成熟胚的离体培养，本研究采用了半胚的培养方式，有效地克服了成熟胚在诱导培养基上直接萌发的现象。对于这一点，可以考虑以提早收获成熟胚的方式克服萌发现象，但需要进一步试验证明其是否可行。随后的实验表明提早收获的成熟胚随着存放时间的延长，其成愈率明显下降（数据没显示）。另外，以全胚的方式进行培养，形成的愈伤组织绝大多数再生单个植株，这样的植株极有可能是潜伏的胚芽在细胞分裂素作用下直接长成的植株，而不是再分化植株，用这样的愈伤组织接受转化是不容易得到转基因植株的。而以半胚的方式接种，胚芽容易脱分化形成愈伤组织而不是处于潜伏状态，所以半胚愈伤组织分化多苗的机率高。本研究之所以没有采用含胚根的半胚进行培养，是因为胚根部分形成的愈伤组织分化率极低，结果已有报道12。 本实验所选用的再生体系和以往报道的成功再生体系不同4,13-15。尽管该培养体系没有被证明是最好的，但它在很大程度上适应以上四种优良的小麦品种，这可以作为其它小麦基因型的参考。参考文献：1 李娜，焦浈，谷运红，秦广雍。小麦组织培养研究进展。河南农业科学，2005，8：11-152 Ahloowalia BS. 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