实验14醋酸纤维素薄膜电泳法分离蛋白质ppt课件.ppt

醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质,实验目的,学习醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法。了解电泳技术的一般原理。掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。,实验原理,电泳 带电质点(分子、离子、胶体颗粒)在电场作用下向带相反电荷的电极移动的现象。除了电荷情况外，带电质点的重量、形状等也对它的移动产生一定的影响。各种蛋白质分子在不同的pH 条件下的带电情况不同，这取决于蛋白质的等电点pI值 pIpH 时，蛋白质带正电荷；pIpH时，蛋白质带负电荷。在这次实验的pH条件(8.6)下，样品蛋白质带负电荷在电场中向阳极移动。醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，具有均一泡沫样结构，有强渗透性，对分子移动无阻力。作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速，样品用量少等优点。,实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离血清蛋白。血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低，在相同碱性pH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。如以醋酸纤维薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳1 h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为1-、2-、-、-球蛋白。这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描，自动绘出区带吸收峰及相对百分比，临床医学常用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。,器材： 醋酸纤维薄膜（28cm） 常压电泳仪 点样器 培养皿（染色及漂洗用） 粗滤纸 玻璃板 竹镊试剂： 巴比妥缓冲液（pH=8.6，=0.07）： 巴比妥2.76克，巴比妥纳15.45克，加水至1000ml。 染色液：（可重复使用）。 含氨基黑10B0.25克，甲醇15.45g，冰醋酸10ml，水40ml。 漂洗液： 含甲醇或乙醇45ml，冰醋酸5ml，水50ml。 透明液：含无水乙醇7份，冰醋酸3份。 健康人血清。,实验器材及试剂,1.薄膜与电泳槽的准备：薄膜的准备：用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，在无光泽面上点样，并在角上做记号），放到巴比妥缓冲液中浸泡 20min。电泳槽的准备：在两个电极槽中，各倒人等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。,实验操作步骤,2.点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸去多余的液体，然后平铺在玻璃板或滤纸上，将点样器在血清中沾一下，再在膜条一端23cm处轻轻地水平落下并迅速提起，即在膜条上点上了细条状的血清样品。,图1 电泳装置示意图,3.电泳：用玻璃棒将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)、另一端平贴在阳极端支架上(如图所示)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。 用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，在室温下电泳，调节电压到110 V，电泳时间45min-1h。4.染色和漂洗：电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5 min，然后取出，再用漂洗液漂洗，连续更换3次漂洗液，可使颜色脱去，得到色带清晰的电泳图谱。,实验操作步骤,5. 定量 （可采用下面两种方法）将膜条用滤纸压平，吸干，按区带分段剪开，分别浸在5ml 0.4mol/l的NaOH溶液中，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，进行比色。将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡23min后，取出贴在洁净的玻璃板上，干后为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。,图2 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白； 2，3，4，5分别为1-，2-，-及-球蛋白； 6为点样原点。,点样前沿要平，点样好坏是电泳图谱是否清晰的关键。点样量要控制好，少则区带不清，多则有拖尾现象。电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。,实验操作注意事项,1. 贴出醋酸纤维素薄膜电泳结果并予以解释。2. 造成电泳图谱不整齐的原因有哪些？,实验结果与讨论,