复和修复医学知识宣讲课件.ppt

1,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,I consider molecular biology t,分子生物学在分子水平上研究核酸与蛋白质的功能,1. 基因组在细胞和世代中的维持DNA的复制、修复和重组2. 基因的表达与调控基因的转录和翻译、蛋白质的修饰，原核与真核基因表达调控3. 基因表达与细胞信号的偶联 4. 分子生物学技术及其应用DNA操作技术、基因工程、基因诊断、基因治疗,2,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,分子生物学在分子水平上研究1. 基因组在细胞和世代中的维持2,分子生物学发展简史,奠基时代（18691952） 物理学与生物学的融合 遗传物质化学本质（DNA）的确定黄金时代（19531972） DNA双螺旋结构和复制机制的发现 分子生物学所有基本原理于此诞生基因工程时代（1973今） 基因工程的诞生与发展 分子生物学技术进入生命科学所有领域 迈向“组学”时代（2000 ）,3,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,分子生物学发展简史奠基时代（18691952）3复和修复医,兼顾“假说导向”与“发现导向” 的科学研究方法,4,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,兼顾“假说导向”与“发现导向” 的科学研究方法实验室为主体规,医学分子生物学的研究主题是健康与疾病的分子机制,人类发育调控和功能调控的分子基础疾病的分子机制生物工程与生物制药预防医学基因诊断与基因治疗,5,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,医学分子生物学的研究主题是健康与疾病的分子机制人类发育调控和,分子生物学在医学领域的应用,用基因敲除技术探讨发育的分子机制,6,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,分子生物学在医学领域的应用用基因敲除技术探讨发育的分子机制6,单个抑癌基因的突变即可导致肿瘤的发生,7,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,单个抑癌基因的突变即可导致肿瘤的发生7复和修复医学知识宣讲1,重组蛋白技术用于药物生产,8,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,重组蛋白技术用于药物生产8复和修复医学知识宣讲10/2/20,这些金色的转基因大米里含有 b-胡萝卜素,食用这种大米可以预防维生素A缺乏症。,9,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,这些金色的转基因大米里含有 b-胡萝卜素,9复和修复医学知识,RFLP技术在法医学中的应用,10,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,RFLP技术在法医学中的应用Defendantsbloo,DNA的合成及重组 DNA Biosynthesis and Recombination,第十六章,11,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,DNA的合成及重组第十六章11,DNA生物合成,校正复制中可能出现的错误，并修复受到损伤的DNA,细胞中酶促修复系统,自然界DNA重组和基因转移的基本方式,12,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,DNA生物合成DNA复制（DNA指导的DNA合成）逆转录,基因组复制的主要特点The General features of Genome Replication,第一节,13,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,基因组复制的主要特点第一节13复和修复医学知识宣讲10/2/,一、基因组是细胞或病毒全部遗传信息的总和,含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质，称为基因组（genome）。在真核生物体中，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列。,14,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,一、基因组是细胞或病毒全部遗传信息的总和 含有一种生物的一整,15,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,核基因组线粒体基因组人类基因组包括15复和修复医学知识宣,人类基因组（Genome）,人类基因组包含22条常染色体和X、Y两条性染色体上的遗传物质（核基因组）和线粒体的遗传物质（线粒体基因组）。,16,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,人类基因组（Genome）16复和修复医学知识宣讲10/2/,人类染色体的RxFISH图谱,17,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,人类染色体的RxFISH图谱17复和修复医学知识宣讲10/2,基因,假基因,重复序列,人类基因组7号染色体-TCR基因座的某50kb区域,基因片段,18,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,基因假基因重复序列人类基因组7号染色体-TCR基因座的某5,全长16,569bp，含37个基因。其中13个基因编码蛋白质，其余24个编码rRNA和tRNA。,人线粒体基因组图谱,19,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,全长16,569bp，含37个基因。人线粒体基因组图谱19复,人类基因组各成分所占比例,20,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,人类基因组各成分所占比例20复和修复医学知识宣讲10/2/2,二、基因组DNA复制具备一些共同特征,复制是半保留的在复制的生长点形成复制叉复制是双向的复制是半不连续的复制起点由多个短重复序列组成DNA的复制必须有引物复制需要多种酶和蛋白因子的参与基因组复制是高保真的,21,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,二、基因组DNA复制具备一些共同特征复制是半保留的21复和修,1. DNA复制是半保留复制,DNA双螺旋中的每一条链都作为合成互补链的模板，其结果就使得两条子代的双螺旋都和母本完全一致。,22,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,1. DNA复制是半保留复制DNA双螺旋中的每一条链都作为合,Meselson-Stahl实验,23,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,Meselson-Stahl实验23复和修复医学知识宣讲10,2. DNA复制的生长点形成复制叉,24,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,2. DNA复制的生长点形成复制叉复制叉复制叉复制泡复制起点,3. DNA复制是双向复制,25,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,3. DNA复制是双向复制25复和修复医学知识宣讲10/2/,4. DNA复制是半不连续复制,冈崎片段,26,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,4. DNA复制是半不连续复制冈崎片段26复和修复医学知识宣,两个原因造成了DNA的半不连续复制：DNA双链是反向平行的；DNA合成的方向只能是5-3。在一条模板上，DNA能进行连续的合成，DNA聚合酶简单地尾随着复制叉，此模板所指导合成的新DNA链称为前导链。在另一条模板上，DNA聚合酶与复制叉做反向运动，此模板指导合成的是后随链。后随链上形成的新链DNA片段，称为冈崎片段。,27,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,两个原因造成了DNA的半不连续复制：27复和修复医学知识宣讲,5. 复制起点有特殊的结构,复制的起始并非一个随机的过程，它总是在DNA分子上的同一个或多个位置开始的，这些位点被称为复制起始点（Origin of Replication）。环状的细菌基因组只有一个复制起点，这意味着每一个复制叉要复制几千kb的DNA。酿酒酵母约有300个复制起点，每一个起点对应40kb；而人类有20,000个起点，每个起点对应约150kb的DNA。,28,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,5. 复制起点有特殊的结构复制的起始并非一个随机的过程，它总,E.coli复制起始点 oriC,29,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,GATTNTTTATTT GATCTNTTNTAT,真核生物有多个复制起始点,酿酒酵母的第三号染色体是已知最小的真核生物染色体，它包含180个基因和 9 个复制起点。,30,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,真核生物有多个复制起始点酿酒酵母的第三号染色体是已知最小的真,真核生物复制起始点的结构,复制起点（OBR）由一些短重复序列组成。酵母OBR结构已被阐明，哺乳动物OBR精细结构尚在研究中。结合OBR并启动复制的蛋白复合物称为复制起点复合物（ORC）。,31,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,真核生物复制起始点的结构复制起点（OBR）由一些短重复序列组,6. DNA复制需要引物,多数DNA复制使用新合成的短RNA引物。个别DNA复制以DNA、tRNA或蛋白质做引物。,32,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,6. DNA复制需要引物多数DNA复制使用新合成的短RNA引,7. 复制需要多种酶和蛋白因子的参与,33,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,7. 复制需要多种酶和蛋白因子的参与原核生物真核生物引物酶D,8. 基因组复制是高保真的,DNA聚合酶每添加105个核苷酸中，仅掺入一个不正确的核苷酸；校正外切核酸酶使不正确配对的的概率降低到10-7；错配修复系统使最终的出错机率降低到10-10。这相当于每复制1000个细菌基因组，仅出现一个错误的核苷酸。,34,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,8. 基因组复制是高保真的 DNA聚合酶每添加105个核苷酸,三、不同基因组DNA通过不同的模式 进行复制,（一）真核生物基因组DNA复制过程涉及反转录 （端粒的复制）（二）单链DNA病毒基因组通过复制中间体复制 （三）HBV基因组通过RNA中间体进行复制 （四）双链环状DNA也有不同的复制方式,35,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,三、不同基因组DNA通过不同的模式 进行复制,DNA复制过程Process of DNA Replication,第二节,36,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,DNA复制过程第二节36复和修复医学知识宣讲10/2/202,一、细菌的DNA复制,37,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,一、细菌的DNA复制复制的起始复制叉上的DNA复制复制的终止,E.coli 复制起始点 oriC,38,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,E.coli 复制起始点 oriC GATTNTTTATTT,E.coli DNA复制起始和复制叉的形成,39,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,E.coli DNA复制起始和复制叉的形成 39复和修复医学,在E.coli复制起始过程中，DnaA、DnaB/C（解螺旋酶）、DnaG（引物酶）和DNA聚合酶III依次加入，形成最初的复制叉。DNA聚合酶催化的复制反应复制叉上的DNA合成,40,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,在E.coli复制起始过程中，DnaA、DnaB/C（解螺旋,（一）DNA聚合酶催化的复制反应,41,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,（一）DNA聚合酶催化的复制反应41复和修复医学知识宣讲10,DNA复制反应的底物是dNTP和引物-模板连接处,反应由DNA聚合酶催化,42,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,DNA复制反应的底物是反应由DNA聚合酶催化42复和修复医学,所有的DNA聚合酶都有相似的空间结构,43,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,聚合酶外切核酸酶所有的DNA聚合酶都有相似的空间结构43复和,与DNA聚合酶结合的金属离子催化核苷酸的添加,44,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,与DNA聚合酶结合的金属离子催化核苷酸的添加44复和修复医学,DNA聚合酶能分辨正确与错误的碱基,45,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,DNA聚合酶能分辨正确与错误的碱基45复和修复医学知识宣讲1,DNA聚合酶能分辨dNTP与NTP,46,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,DNA聚合酶能分辨dNTP与NTP46复和修复医学知识宣讲1,DNA聚合酶具有延伸能力,DNA聚合酶的延伸能力（processivity）定义为每次酶与引物-模板接头结合时所添加核苷酸的平均数；每种DNA聚合酶都有其特征性的延伸能力，从几个到50000个核苷酸不等；DNA聚合酶与完全包围DNA的“滑动夹”蛋白之间的相互作用，可进一步提高延伸能力。,47,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,DNA聚合酶具有延伸能力DNA聚合酶的延伸能力（proces,外切核酸酶活性校正新合成的DNA,影响DNA聚合酶精确度的主要因素是碱基变成“错误”的互变异构体（亚氨基或烯醇基）；错配的核苷酸激活3-5外切核酸酶活性；错配核苷酸去除后，构象恢复，DNA聚合反应继续进行。,48,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,外切核酸酶活性校正新合成的DNA影响DNA聚合酶精确度的主要,（二）复制叉上的DNA合成,前面我们讨论了引物-模板接头处DNA的合成，然而在细胞内，DNA的双链是同时复制的。这就必须解决：半不连续复制；RNA引物的合成和去除；解开复制叉及相关的拓扑学问题。,49,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,（二）复制叉上的DNA合成前面我们讨论了引物-模板接头处DN,复制叉上DNA的合成是半不连续的,前导链,后随链,合成方向与解链方向相同,合成方向与解链方向相反,50,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,复制叉上DNA的合成是半不连续的前导链后随链合成方向与解链方,RNA引物的合成与去除,所有的DNA聚合酶都不能从头合成DNA链；RNA聚合酶具有从头合成核苷酸链的能力；细胞利用一种特殊的RNA聚合酶来启动复制：引物酶，能在单链DNA模板上合成5-10个核苷酸长度的短RNA引物，DNA聚合酶随后延伸这些引物。E.coli的引物酶是DnaG蛋白，真核生物的引物酶是DNA聚合酶的p48亚基。,51,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,RNA引物的合成与去除所有的DNA聚合酶都不能从头合成DNA,原核与真核生物RNA引物的合成,聚合酶转换,52,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,原核与真核生物RNA引物的合成聚合酶转换52复和修复医学知识,RNA引物的去除,53,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,RNA引物的去除53复和修复医学知识宣讲10/2/2022,RNase H可去除DNA:RNA杂交链中的RNA；DNA聚合酶（ E.coli中是DNA聚合酶 I，真核生物中目前认为是DNA聚合酶 或 ）填补去除引物后留下的空隙（gap）；DNA连接酶连接两个相邻的核苷酸。,54,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,RNase H可去除DNA:RNA杂交链中的RNA；54复和,在复制叉上有多种蛋白质协同解开双螺旋,DNA聚合酶本身不能解开双螺旋，因此还需要多种酶和蛋白因子的协同作用，它们完成以下三项任务：将DNA双螺旋分开以形成两条单链DNA模板；保证复制前单链DNA保持伸直状态；解决分开DNA双螺旋而引起的拓扑学问题。,55,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,在复制叉上有多种蛋白质协同解开双螺旋DNA聚合酶本身不能解开,解螺旋酶解开DNA双螺旋,DNA解螺旋酶通常是六聚体蛋白，环绕着DNA，因此有很高的延伸能力；解螺旋酶利用ATP的能量解开双螺旋；所有解螺旋酶都有极性（polarity），即特异性地结合DNA双链中的一条。,56,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,解螺旋酶解开DNA双螺旋DNA解螺旋酶通常是六聚体蛋白，环绕,E.coli的解螺旋酶是DnaB蛋白，它本身是六聚体，又与六个DnaC蛋白共同组成解螺旋复合物；人类的解螺旋酶目前认为是Mcm2-7复合物，同样是六聚体；DnaB解螺旋方向为5-3，即结合后随链的模板。,57,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,E.coli的解螺旋酶是DnaB蛋白，它本身是六聚体，又与六,单链结合蛋白使单链DNA稳定,58,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,单链结合蛋白使单链DNA稳定DNA解螺旋酶打开双螺旋后，新生,59,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,59复和修复医学知识宣讲10/2/2022,拓扑异构酶除去解螺旋时产生的超螺旋,DNA复制中的拓扑学难题：在解链过程中伴随着DNA分子的旋转：双螺旋中每10bp形成一周；以人的1号染色体为例，1号染色体长250Mb，复制时就必须旋转2500万次； 细菌和噬菌体等环状基因组，则不可能以旋转的方式解螺旋。,60,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,拓扑异构酶除去解螺旋时产生的超螺旋DNA复制中的拓扑学难题：,解链过程中正超螺旋的形成,61,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,解链过程中正超螺旋的形成61复和修复医学知识宣讲10/2/2,拓扑异构酶的作用机制,62,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,拓扑异构酶切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结,拓扑异构酶的作用机制,63,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,拓扑异构酶的作用机制拓扑异构酶切断DNA分子两股链，断端通,本图显示拓扑异构酶 II 除去由复制叉所产生的正超螺旋：通过“断裂-再连接”的方式，将未复制的DNA的一部分通过未复制区域的断裂点以消除正超螺旋。该反应使连环数减少2，因此每复制20bp将会发生一次。,64,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,本图显示拓扑异构酶 II 除去由复制叉所产生的正超螺旋：64,复制叉酶扩大了DNA聚合酶的底物范围,DNA聚合酶本身只能延伸已合成的引物，但是引物酶、解螺旋酶和拓扑异构酶的加入极大地扩大了DNA聚合酶可能的底物范围：引物酶使得DNA聚合酶能复制任何单链DNA；DNA解螺旋酶和拓扑异构酶使得DNA聚合酶能复制任何双链DNA。 没有这些酶的参与，复制叉是不可想象的。,65,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,复制叉酶扩大了DNA聚合酶的底物范围DNA聚合酶本身只能延伸,66,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,66复和修复医学知识宣讲10/2/2022,DNA聚合酶是高度特化的,细胞内有多种DNA聚合酶，它们为执行不同的生物学功能而高度特化了：E.coli有5种DNA聚合酶，其中Pol III是复制酶；真核生物有超过10种DNA聚合酶，其中DNA聚合酶有引物酶活性，DNA聚合酶和是复制酶。,67,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,DNA聚合酶是高度特化的细胞内有多种DNA聚合酶，它们为执行,TLS,1,Rev 1,TLS，体细胞高变,1,Pol ,相对准确的TLS（穿越环丁烷二聚体）,1,Pol ,TLS,1,Pol ,体细胞高变（somatic hypermutation）,1,Pol ,减数分裂相关的DNA损伤修复,1,Pol ,TLS,1,Pol ,DNA交联损伤修复,1,Pol ,DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复,4,Pol ,DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复,23,Pol ,线粒体DNA复制和损伤修复,3,Pol ,碱基切除修复,1,Pol ,合成引物,4,Pol ,功能,亚基数目,真核生物,TLS（translesion synthesis）,3,Pol (UmuC, UmuD),DNA损伤修复，穿越损伤合成（TLS）,1,Pol (Din B),染色体DNA复制,9,Pol 全酶,染色体DNA复制,3,Pol 核心酶,DNA损伤修复,1,Pol ,去除RNA引物，DNA损伤修复,1,Pol ,功能,亚基数目,原核生物（E. coli）,68,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,TLS1 Rev 1TLS，体细胞高变1Pol 相对准确的,延伸能力差，只能延伸20个核苷酸左右。功能：切除引物，填补冈崎片段间的空隙、DNA损伤的修复。,DNA pol I（109kD）,69,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,延伸能力差，只能延伸20个核苷酸左右。DNA pol I69,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,枯草杆菌蛋白酶,DNA pol I,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,70,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,323个氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Kl,2个核心酶（、 3种亚基） 1个复合物（、 6种亚基） 可滑动的DNA夹子（含1对-亚基）,DNA聚合酶III的结构,全酶结构包括：,一次延伸达500000个核苷酸，催化速度达1000bp/s，有校对功能，是细菌复制延长中真正起催化作用的酶。,71,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,2个核心酶（、 3种亚基）DNA聚合酶III的,亚基有聚合酶活性亚基有3-5校正核酸酶活性亚基协助核心酶固定在DNA模板上复合物连接两个核心酶,72,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,亚基有聚合酶活性72复和修复医学知识宣讲10/2/2022,细菌复制叉上DNA的合成（小结）,复制叉上的前导链和后随链同时合成；DNA聚合酶III全酶同时复制DNA的双链；前导链迅速复制。后随链进行不连续的合成；引物酶、解螺旋酶、拓扑异构酶和SSB蛋白协助DNA聚合酶III完成复制过程。 以上统称“长号模型”。,73,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,细菌复制叉上DNA的合成（小结）复制叉上的前导链和后随链同时,74,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,74复和修复医学知识宣讲10/2/2022,75,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,75复和修复医学知识宣讲10/2/2022,E.coli基因组的复制终止,E.coli基因组复制由oriC开始，到ter终止；Tus蛋白识别复制终点使复制终止；复制完成还包括去除引物和连接冈崎片段；拓扑异构酶解开套在一起的两个DNA分子。,76,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,E.coli基因组的复制终止E.coli基因组复制由oriC,复制受到DnaA-ATP水平和SeqA的调控,E.coli基因组的oriC的GATC序列（双链）的A通常是甲基化的，只有甲基化的oriC可启动复制。新合成链oriC的GATC在未甲基化之前，可与SeqA蛋白结合，而丧失启动复制的能力；DnaA-ATP蛋白在复制过程中转变为DnaA-ADP，而丧失启动复制的能力；以上机制共同使E.coli在oriC的新拷贝上启动新一轮复制的能力显著降低。,77,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,复制受到DnaA-ATP水平和SeqA的调控E.coli基因,78,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,78复和修复医学知识宣讲10/2/2022,虽然如此，但这并不意味着E.coli的oriC在一轮复制周期中就只起一次作用；E.coli每20分钟就分裂一次，而基因组的复制时间就需要40分钟，在快速生长期，基因组在上一轮复制完成之前就要启动下一轮复制，而使染色体上出现6个复制叉；所以，确切的说法是：每一轮细胞分裂只有一轮自oriC的复制起始。,79,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,虽然如此，但这并不意味着E.coli的oriC在一轮复制周期,真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶/转换；切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNase H和FEN1等。,二、真核生物的DNA复制,真核生物与原核生物DNA复制的差异：,80,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；二、真核生,(一)常见的真核细胞DNA聚合酶有5种,A家族与大肠杆菌Pol同源，包括Pol 和Pol B家族与大肠杆菌Pol 同源，包括Pol 、和C家族与大肠杆菌Pol 同源，仅在真菌中发现X家族与大肠杆菌DNA聚合酶并无同源性，却与末端转移酶同源，成员包括Pol 、Y家族（ UmuC/DinB超家族），近年发现一个特殊的真核及原核DNA聚合酶家族，成员包括Pol 、和Rev1,81,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,(一)常见的真核细胞DNA聚合酶有5种A家族与大肠杆菌Pol,Pol 负责合成引物Pol 负责DNA复制、核苷酸切除修复和碱基切除修复Pol 的功能与Pol 相似（其确切功能尚待定）Pol 可能和碱基切除修复有关Pol 负责线粒体DNA复制和损伤修复,常见的真核DNA聚合酶有5种：,82,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,Pol 负责合成引物常见的真核DNA聚合酶有5种：82复和,拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方产生的正超螺旋,Tol和Tol,DNA双螺旋解链，参与组装引发体,DNA解旋酶,连接冈崎片段,DNA连接酶,核酸酶，切除RNA引物,RNase H,核酸酶，切除RNA引物,FEN1,DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复,Pol /,合成RNA-DNA引物,Pol /引发酶,夹子装载器，促使PCNA结合于引物-模板链，有依赖DNA的ATPase活性，结合于引物-模板链，激活DNA聚合酶,RFC,可滑动的DNA夹子，激活DNA聚合酶和RFC的ATPase活性,PCNA,单链DNA结合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易结合DNA,RPA,功 能,蛋白质,真核DNA复制叉主要蛋白质的功能,(二)真核DNA复制叉主要蛋白质的类型和功能与原核基本相似,83,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方,DNA聚合酶（Pol ）分子含有4个亚基：,1. DNA聚合酶/引发酶复合物合成RNA-DNA引物,180：催化亚基p48：具有引物酶活性p58：p48的稳定性和活性所必需的p70：与组装引发体有关,84,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,DNA聚合酶（Pol ）分子含有4个亚基：1. DNA聚,功能：合成RNA引物反应过程：调节：磷酸化的调节作用,Pol /引发酶复合物,首先，合成RNA引物；其次，利用DNA聚合酶活性将引物延伸，产生起始DNA（initiator DNA，iDNA）短序列，形成RNA-DNA引物；最后，Pol /引发酶脱离模板链DNA，发生DNA聚合酶转换（switch）。,85,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,功能：合成RNA引物Pol /引发酶复合物首先，合成RNA,原核与真核生物RNA引物的合成,聚合酶转换,86,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,原核与真核生物RNA引物的合成聚合酶转换86复和修复医学知识,结构： p70、p34和p11组成异源三聚体功能：,2. RPA的功能与E.coli的SSB相似,复制蛋白A（replication protein A，RPA）,结合单链DNA促使双螺旋DNA解旋激活Pol /引发酶活性为Pol 依赖复制因子C（RFC）和增殖细胞核抗原（PCNA）合成DNA所必需RPA三聚体与SV40 T抗原结合，组装引发体复合物所必需RPA参与DNA重组和修复,87,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,结构： p70、p34和p11组成异源三聚体2. RPA的功,140 结合PCNAp40、p37和p36组成稳定的核心复合物，具有依赖DNA的ATPase活性p38可能在p140和核心复合物之间起连接作用,3. RFC与E.coli DNA聚合酶的-复合物功能相似,复制因子C（replication factor C，RFC）,结构：有p140，p40，p38，p37、p36 5个亚基,88,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,140 结合PCNA3. RFC与E.coli DNA聚合,促使可滑动的DNA夹子PCNA结合于引物-模板链，是Pol 在模板DNA链上组装并形成具有持续合成能力全酶所必需的。,RFC的功能：,89,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,促使可滑动的DNA夹子PCNA结合于引物-模板链，是Pol,PCNA是Pol 的进行性因子，使Pol 获得持续合成能力。PCNA是协调DNA复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期调控的核心因子。PCNA水平是检测细胞增殖的重要指标。PCNA能激活Pol 。,4. PCNA是可滑动的DNA夹子,增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）,结构：,功能：,同源三聚体，可形成闭合环形的可滑动DNA夹子。,90,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,PCNA是Pol 的进行性因子，使Pol 获得持续合成能,不同生物的夹子结构相似,E.coli的亚基二聚体 T4噬菌体 PCNA蛋白三聚体 gp45蛋白三聚体,91,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,不同生物的夹子结构相似E.coli的亚基二聚体,125：催化亚基，具有DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性，其N端区与PCNA相互作用p50：辅助PCNA激活p125,5. DNA聚合酶合成前导链和后随链,结构：Pol 分子是异源二聚体（p125和p50）,功能：Pol 合成前导链和后随链,DNA聚合酶,92,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,125：催化亚基，具有DNA聚合酶活性和35核酸外切,FEN1（flap endonuclease 1）具有核酸内切酶和53核酸外切酶活性。FEN1参与去除冈崎片段5端的RNA引物。,6. FEN1和RNAse H切除RNA引物,93,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,FEN1（flap endonuclease 1）具有核酸内,DNA复制需要DNA解旋酶Mcm2-7打开DNA双螺旋，使复制模板链得以暴露。,7. DNA解旋酶打开双螺旋以暴露复制模板,94,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,DNA复制需要DNA解旋酶Mcm2-7打开DNA双螺旋，使复,8. 真核复制叉有1个Pol 和2个Pol 复合物,真核DNA复制叉模型,95,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,8. 真核复制叉有1个Pol 和2个Pol 复合物真核D,(三) 引发和延伸发生DNA聚合酶/转换,识别染色体DNA复制起点和DNA局部解旋后，Pol /引发酶复合物结合于复制起点，这一步叫做引发体组装。引发体组装包括DNA解旋酶与Pol /引发酶相互作用。,1. 解旋酶与Pol /引发酶相互作用组装引发体,96,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,(三) 引发和延伸发生DNA聚合酶/转换识别染色体DNA,前导链：出现在引发后期后随链：发生于每个冈崎片段合成之际发生DNA聚合酶/转换的原因是Pol 不具备持续合成能力DNA聚合酶/转换的关键蛋白是RFC,2. DNA聚合酶/转换,97,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,前导链：出现在引发后期2. DNA聚合酶/转换97复和修,真核DNA聚合酶转换和后随链合成,98,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,真核DNA聚合酶转换和后随链合成98复和修复医学知识宣讲10,(四) 切除RNA引物有两种机制,RNAse H/FEN1,Dna2/FEN1,99,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,(四) 切除RNA引物有两种机制RNAse H/FEN1D,(五) 真核染色体在每个细胞周期只能复制一次,真核基因组复制仅发生在 S 期，在此期间，所有的DNA都必须且只能复制一次，这意味着所有的复制器都仅被利用一次；真核生物的复制起始子是复制起点识别复合物（ORC），它募集相关蛋白因子，形成前复制复合体（pre-RC）；对pre-RC形成和激活的调控使每个细胞周期内仅有一轮复制发生。,100,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,(五) 真核染色体在每个细胞周期只能复制一次真核基因组复制仅,真核细胞的细胞周期,101,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,真核细胞的细胞周期101复和修复医学知识宣讲10/2/202,re-RC的形成,ORC是起始子；Cdc6和Cdt1是解旋酶装载蛋白；Mcm2-7是解螺旋酶。pre-RC虽然只在G1期形成，但只在S期才激活。,102,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,re-RC的形成ORC是起始子；102复和修复医学知识宣讲,对pre-RC的调控使得每个细胞周期只有一轮复制,103,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,对pre-RC的调控使得每个细胞周期只有一轮复制103复和修,104,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,104复和修复医学知识宣讲10/2/2022,(六)端粒酶确保染色体末端复制完整,前导链产生完整的子染色单体。后随链3端留下缩短的未复制的ssDNA区。,105,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,(六)端粒酶确保染色体末端复制完整 前导链产生完整的子染色单,端粒（telomeres）由富含TG的重复序列组成。人的端粒重复序列为5-TTAGGG-3。这些重复序列多为双链，但每个染色体的3端比5端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题。,106,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,端粒（telomeres）由富含TG的重复序列组成。106复,端粒酶的结构,107,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,端粒酶的结构107复和修复医学知识宣讲10/2/2022,端粒延长机制（爬行模型）,108,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,端粒延长机制（爬行模型）108复和修复医学知识宣讲10/2/,端粒酶对端粒3端的延长解决了末端复制,109,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,端粒酶对端粒3端的延长解决了末端复制109复和修复医学知识,DNA的反转录合成Reverse transcription,第三节,110,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,DNA的反转录合成第三节110复和修复医学知识宣讲10/2/,RNA肿瘤病毒DNA原病毒（或前病毒） RNA肿瘤病毒,Temin等提出，原病毒（provirus）DNA是RNA肿瘤病毒在复制过程中的中间物。,*反转录的发现发展了中心法则,111,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,RNA肿瘤病毒Temin等提出，原病毒（provirus）D,Crick：我本人的思想是基于两个基本原理，序列假说和中心法则。sequence hypothesis ： 核酸片段的特异性完全由其碱基序列所决定，而且这种序列是某一蛋白质氨基酸序列的密码。central dogma ： 遗传信息只能从核酸传向蛋白质，而不能从蛋白质传向核酸。,112,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,Crick：112复和修复医学知识宣讲10/2/2022,反转录病毒（retroviruses ）： RNA病毒，含有反转录酶,反转录：在反转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。,113,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,反转录病毒（retroviruses ）： RNA病毒，含有,RNA指导的DNA聚合酶活性；DNA指导的DNA聚合酶活性；RNase H的活性是指它能够从53和35两个方向水解DNA-RNA杂合分子中的RNA。,一、反转录酶以tRNA为引物合成双链cDNA,反转录酶有3种酶的活性：,114,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,RNA指导的DNA聚合酶活性；一、反转录酶以tRNA为引物合,反转录酶的结构,115,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,反转录酶的结构115复和修复医学知识宣讲10/2/2022,反转录病毒的基因组结构,116,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,反转录病毒的基因组结构116复和修复医学知识宣讲10/2/2,反转录病毒RNA基因组转变为双链cDNA的途径,117,复和修复医学知识宣讲,12/16/2022,反转录病毒RNA基因组转变为双链cDNA的途径117复和修复,二、反转录病毒在宿主