基因工程的基本操作步骤7课件.ppt

基因工程的基本操作步骤7,2022/12/16,基因工程的基本操作步骤7,基因工程的基本操作步骤72022/9/23基因工程的基本操作,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程的基本操作步骤7,基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,也有一些具有调控作用的因子,2、获取目的基因的方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,_,基因工程的基本操作步骤7,一、目的基因的获取1、目的基因主要是指_,(一)从基因文库中获取目的基因,1.基因文库,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,2.基因文库的分类:,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,基因工程的基本操作步骤7,(一)从基因文库中获取目的基因1.基因文库 将含有某种,基因文库的构建过程,通过对受体菌群体的培养而储存一种生物的全部基因。,基因组文库,3.基因文库的构建方法,基因工程的基本操作步骤7,基因文库的构建过程限制酶拼接到载体上导入受体细胞扩增 基因组,提取生物某发育时期的mRNA,单 链DNA,逆转录酶,DNA聚合酶,双链CDNA(只含该生物部分基因),与载体连接导入到受体菌群储存,cDNA文库,基因工程的基本操作步骤7,提取生物某发育时期的mRNA单 链DNA逆转录酶DNA聚合酶,基因组文库和cDNA文库比较,基因工程的基本操作步骤7,基因组文库和cDNA文库比较基因工程的基本操作步骤7,原核细胞的基因结构(补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质 ,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子,启动子,基因工程的基本操作步骤7,原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上,真核细胞的基因结构（补充内容）,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,基因工程的基本操作步骤7,真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,基因工程的基本操作步骤7,原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白,真核生物mRNA的形成,编码区,非编码区,RNA聚合酶结合位点,非编码区,转录,加工（剪切、拼接）,成熟mRNA,只对应外显子部分,初级转录物,补充资料,基因工程的基本操作步骤7,真核生物mRNA的形成编码区非编码区RNA聚合酶结合位点非编,基因组文库和cDNA文库比较,基因工程的基本操作步骤7,基因组文库和cDNA文库比较基因工程的基本操作步骤7,依据：目的基因的有关信息如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,4.从基因文库中得到目的基因的方法,基因工程的基本操作步骤7,依据：目的基因的有关信息4.从基因文库中得到目的基因的方法基,概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_ 、 _ 、_,原理：_,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,模板DNA,四种脱氧核苷酸,DNA引物,热稳定DNA聚合酶,（二）利用PCR扩增目的基因,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：_,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内大量扩增,基因工程的基本操作步骤7,概念：PCR全称为_，是一项,过程,a、变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、复性（复性55-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,前提_,有一段已知目的基因的核苷酸序列,基因工程的基本操作步骤7,过程a、变性（90-95）：双链DNA模板b、复性（复,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成（DNA合成仪）,（三）人工合成,若基因_，核苷酸序列_ ，可用此法。,较小,已知,（化学合成法）,基因工程的基本操作步骤7,蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推,mRNA,cDNA单链,cDNA分子,逆转录酶,DNA聚合酶,（三）人工合成,（反转录法）,与直接提取的DNA相比cDNA不含有_ 和_等结构。,基因工程的基本操作步骤7,mRNAcDNA单链cDNA分子逆转录酶DNA聚合酶（三）人,真核生物mRNA的形成,编码区,非编码区,RNA聚合酶结合位点,非编码区,转录,加工（剪切、拼接）,成熟mRNA,只对应外显子部分,初级转录物,补充资料,基因工程的基本操作步骤7,真核生物mRNA的形成编码区非编码区RNA聚合酶结合位点非编,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在 并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,1、基因表达载体的构建目的,二、表达载体的构建,基因工程的基本操作步骤7,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在b、同时使目的基因能表达和,2、基因表达载体的组成：,目的基因,标记基因,启动子,终止子,基因工程的基本操作步骤7,2、基因表达载体的组成： 目的基因 标记基因,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,基因工程的基本操作步骤7,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合,用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。用_切断目 的基因，使其产生_ _。,3、基因表达载体的构建,将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,(插入式),基因工程的基本操作步骤7,用一定的_切割3、基因表达载体的构建将切,用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。用_切断目 的基因，使其产生_ _。,将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,用同种限制酶分别切割质粒和目的基因，使之露出相同的黏性末端，在加入DNA连接酶。,基因工程的基本操作步骤7,用一定的_切割将切下的目的基因片段插入质,三、将目的基因导入受体细胞,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca+处理法,基因工程的基本操作步骤7,三、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入将目的基因导入将目的,1、将目的基因导入植物细胞的方法：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：,农杆菌特点：,（1）农杆菌转化法,Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,基因工程的基本操作步骤7,1、将目的基因导入植物细胞的方法：易感染双子叶植物和裸子植物,过程：,1、将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上,2、将重组Ti质粒导入农杆菌,3、用农杆菌感染植物体细胞,基因工程的基本操作步骤7,过程：1、将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上2、将重组,（2）基因枪法,适用于单子叶植物,基因工程的基本操作步骤7,（2）基因枪法适用于基因工程的基本操作步骤7,（3）花粉管通道法,基因工程的基本操作步骤7,（3）花粉管通道法基因工程的基本操作步骤7,2、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法程序：,取卵,显微注射,受精卵,早期胚胎培养,胚胎移植,基因工程的基本操作步骤7,2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法取卵显微注射受精,3、将目的基因导入微生物细胞,用Ca2+处理细胞,原核生物特点：,繁殖快、单细胞、遗传物质少,方法：,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA分子,感受态细胞,基因工程的基本操作步骤7,3、将目的基因导入微生物细胞用Ca2+处理细胞,四环素抗性基因,氨苄青霉素抗性基因,四、目的基因的检测与鉴定,基因工程的基本操作步骤7,四环素氨苄青霉四、目的基因的检测与鉴定大肠杆菌基因工程的基本,四、目的基因的检测与鉴定,抗原抗体杂交法,分子杂交法,DNA分子杂交法,目的基因是否翻译,目的基因是否转录,目的基因是否导入,方法,检测对象,结果,个体水平的鉴定,是否显示出杂交带,基因工程的基本操作步骤7,四、目的基因的检测与鉴定抗原抗体杂交法分子杂交法DNA分子,基因探针：（制作探针的要求）, 含有目的基因, 单链, 标记放射性同位素或荧光,基因工程的基本操作步骤7,基因探针：（制作探针的要求） 含有目的基因 单链 标,四、目的基因的检测与鉴定,个体水平的鉴定（受体是否表现出相应性状）,1、鉴定转基因抗虫棉是否具有抗虫性可采用 _ 实验,2、如何鉴定转基因抗盐烟草是否成功？,接虫,在转基因抗盐烟草田中浇灌盐水，观察其是否有抗盐特性,3、用乳腺生物反应器生产人血清白蛋白，如何 确定转基因羊培养成功？,检测羊乳中是否含有人的血清白蛋白,基因工程的基本操作步骤7,四、目的基因的检测与鉴定个体水平的鉴定（受体是否表现出相应性,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR技术人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：是否有转基因特性,基因工程的基本操作步骤7,归纳: 基因工程的基本操作程序获取目的基因基因工程的基本操作,一、乳腺生物反应器,1.目的基因是什么？,药用蛋白基因,2.目的基因前需加的什么启动子？,乳腺蛋白基因的启动子,3.受体细胞是什么？,受精卵,4.分泌蛋白质的细胞是？,乳腺分泌细胞,5.将目的基因导入受体细胞的方法？,显微注射法,基因工程的基本操作步骤7,一、乳腺生物反应器1.目的基因是什么？药用蛋白基因2.目的基,练习：继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：,1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是_。,显微注射,2）进行基因转移是，通常要将外源基因转到_中，原因是 ：,受精卵, 具有发育的全能性；, 体积大，易操作。,3）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的_细胞中特异表达。,膀胱上皮,基因工程的基本操作步骤7,练习：继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱1）将人的生长激素,练习：继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：,4）通常采用_技术检测外源基因 是否插入了小鼠的基因组,DNA分子杂交,6）与乳腺生物反应器相比，膀胱反应器有什么 优点？, 不受性别的限制；, 没有是否处于生殖期的限制。,5）检测人的生长激素是否成功表达可采用 _ 技术,抗原-抗体杂交,基因工程的基本操作步骤7,练习：继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱4）通常采用_,1、基因治疗概念：,二、基因治疗曙光初照,将健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，从而达到治疗疾病的目的。（增补策略）,2、基因治疗的类型,3、基因治疗的发展现状：,处于初期的临床试验阶段,基因工程的基本操作步骤7,1、基因治疗概念：二、基因治疗曙光初照 将健康的外源基,三、蛋白质工程的崛起,蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。,前提：,了解蛋白质的结构和功能,途径：,目的：,改造基因（基因修饰或基因合成）,定向改造或制造蛋白质,获得自然界没有的蛋白质,基因工程的基本操作步骤7,三、蛋白质工程的崛起蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其,1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防。疫苗的主要成分是该病毒的一种结构蛋白VP1。科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗，过程如下图所示。请据图回答。,（1）口蹄疫病毒的遗传物质为RNA，要获得VP1基因可用 _的方法合成DNA，再用_ 将VP1基因片段切下。,反转录法,限制酶,基因工程的基本操作步骤7,1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接,1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防。疫苗的主要成分是该病毒的一种结构蛋白VP1。科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗，过程如下图所示。请据图回答。,（2）过程的培养基中除了加入各种必需营养物质和_等激素外，还需要添加 _ 筛选出含有重组质粒的叶片小段。,基因工程的基本操作步骤7,1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接,2、某研究小组进行了甲型H1N1流感病毒的疫苗研制工 作，下图为他们前期研究工作的简要操作流程图：,（1）实验步骤所代表的反应过程是 _；在步骤之前扩增H基因常采用的方法是_。,逆转录,PCR技术,（2）步骤构建重组表达载体A和重组表达载体B必须使用的酶_ 。,限制酶、DNA连接酶,（3）构建重组表达载体时，一般需要将H基因与载体结合，常用做基因工程载体的是_；在检测受体细胞中是否已经导入目的基因时，常常要借助载体上 _ 的表达。,质粒,标记基因,基因工程的基本操作步骤7,2、某研究小组进行了甲型H1N1流感病毒的疫苗研制工,3、科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。图6是转基因抗盐烟草的培育过程，含目的基因的DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。请分析回答：,（1）在基因工程中，抗盐基因被称为 _，它可用PCR技术扩增，该技术需用_ 酶。,目的基因,热稳定DNA聚合,（2）用图中的质粒和目的基因构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因是_。图中、过程为防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，应选用限制酶 _ 对外源DNA、质粒进行切割。,基因工程的基本操作步骤7,3、科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草并培育成转基因抗盐,3、科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。图6是转基因抗盐烟草的培育过程，含目的基因的DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。请分析回答：,（3）为筛选出已导入重组质粒的农杆菌，应在培养基中加_。,M抗生素,（4）为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，在个体水平上鉴定之前，常用 _作探针进行分子杂交测试。,放射性同位素标记的抗盐基因,基因工程的基本操作步骤7,3、科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草并培育成转基因抗盐,4、在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因afp对提高农作物的抗寒能力有较好的应用价值。右图所示是获得转基因莴苣的技术流程，请据图回答下列问题：,(1)获取目的基因的主要途径包括从自 然界已有的物种中分离和_。,(2)过程需要的酶有_、_。,(3)重组质粒除了带有抗冻蛋白基因afp以外，还必须含有启动子、终止子和_，这样才能构成一个完整的基因表达载体。,人工合成,限制酶,DNA连接酶,标记基因,基因工程的基本操作步骤7,4、在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因afp对提高农作物的抗寒,4、在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因afp对提高农作物的抗寒能力有较好的应用价值。右图所示是获得转基因莴苣的技术流程，请据图回答下列问题：,(4)如果受体细胞C1是土壤农杆菌，则将目的基因导入它的目的是利用农杆菌的_，使目的基因进入受体细胞C2，并将其插入到受体细胞C2中_上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，形成转基因莴苣。经过程获得的转基因莴苣中的目的基因是否表达，在分子水平上可用_法进行检测，如果出现杂交带，说明目的基因已经表达蛋白质产品，转基因莴苣培育成功。,转化作用,染色体DNA,抗原-抗体杂交,基因工程的基本操作步骤7,4、在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因afp对提高农作物的抗寒,根据基因工程的有关知识，回答下列问题：,（1）限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有 _和_ 。,（2）质粒运载体用EcoR 切割后产生的片段如下：AATTCGGCTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR 切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是 _。,（3）按其来源不同，基因工程找那个所使用的DNA连接酶有两类，即 _DNA连接酶和 _ DNA连接酶。,粘性末端,平末端,切割产生的DNA片段末端与EcoR 切割产生的相同；,大肠杆菌,T4,基因工程的基本操作步骤7,根据基因工程的有关知识，回答下列问题：（1）限制性内切酶切割,演讲完毕，谢谢听讲!,再见，see you again,2022/12/16,基因工程的基本操作步骤7,演讲完毕，谢谢听讲!再见，see you again2022,