项目名称：动脉粥样硬化发病机制及其诊治与干预的基础研究首.docx

项目名称：动脉粥样硬化发病机制及其诊治与干预的基础研究首席科学家：刘德培 中国医学科学院基础医学研究所起止年限：2011.1至2015.8依托部门：卫生部二、预期目标总体目标：本项目旨在从我国AS人群特有的遗传背景及分析致病的内外环境危险因素为切入点，结合系统生物医学观念和手段,针对在AS发生中起重要作用的内外环境中有利和不利因素，阐述AS发生、发展和转归的规律,揭示血管重塑和AS斑块不稳定的机理,结合临床研究为制定适合我国国情的针对AS及其并发症的早期预警和早期干预策略及防治方案提供新的思路和科学依据，积极推进临床转化。五年预期目标：阐明能量限制和特殊饮食，脂质代谢紊乱和含硫氨基酸家族等因素影响AS发病的细胞分子机制；初步阐明血管重塑和动脉粥样硬化斑块不稳定的影响因素及分子机制。寻找出1-2个可用于AS新的早期预警分子，并建立其检测方法和预警指标确定35种新的抗AS靶点分子，明确其功能及临床意义。培养博士生80名，硕士生60名。培养优秀中青年人才，产生杰出青年与长江学者,建设一支优秀的转化医学研究人才梯队。申请一批发明专利，促进开发有自主知识产权的成果转化。本项目实施中取得的基础性研究成果将在国际刊物上发表影响因子（IF）>5.0有代表性学术论文60篇，其中IF>10的论文15篇，顶级杂志论文2-5篇。三、研究方案本课题项目分为六个部分，第一部分开展中国人群AS疾病分子遗传基础;第二部分紧密联系内外环境因素中限制能量饮食和特殊饮食，研究有利和不利因素和机体相互作用在AS发病中的机制;第三部分阐明脂代谢紊乱，尤其是TG和HDL代谢紊乱导致AS的分子机制;第四部分阐述含硫氨基酸家族特别是Hcy与 H2S在AS发生和发展中炎症和免疫作用及其分子机制；第五部分针对血管重塑是AS管腔狭窄的关键因素，研究影响血管重塑的因素和作用的分子机制；第六部分针对AS斑块不稳定及早期防治，研究斑块从不稳定向稳定的方向转变的分子机制和干预策略。这六个部分结合系统生物医学观念和手段，从临床提出科学问题，围绕着AS的发生发展和转归的分子调控机制和早期干预这个科学核心进行研究，寻找AS早期预警分子，并建立其检测方法和预警指标,确定抗AS新靶点分子,探讨防治AS的有效方法和降低心脑血管疾病发病率和死亡率的途径。动脉粥样硬化发病机制及其诊治与干预的基础研究 第一部分 中国人动脉粥样硬化遗传分子基础学术思路与技术途径：1.结合中国人群心肌梗死GWAS和国外人群的研究结果，同时选择炎症、脂代谢以及血压调控通路相关基因，在10000例急性冠脉综合征病例对照样本中筛查AS新的基因和遗传变异。2.采用临床技术手段测定颈动脉内膜中膜厚度、脉搏波速度等AS亚临床表型和多种生物标记物，综合评价遗传因素与AS发生/发展、以及斑块稳定性的关系。3.探讨重要多态对易感基因转录活性的调控作用，寻找与多态可能结合的转录因子，进而研究多态对易感基因所在信号通路的调控作用及细胞生理活性改变。应用microRNA技术，确定斑块发生发展过程中炎症反应系统表达谱，研究炎症在冠状AS斑块发生发展过程中的作用及机制；并利用动物模型寻找冠状AS疾病新的遗传易感基因。4.对2000例社区高危人群进行前瞻性随访，动态监测AS相关生理指标的变化和AS的进展情况。评价遗传位点及其联合作用与AS指标间的关系，计算人群归因危险度，构建遗传因素及环境危险因素的预测模型。亚临床指标：颈动脉IMT、PWV等SNPs、CNVs及单体型血脂代谢、炎症反应、血压相关通路基因AS斑块钙化及稳定性评价确定遗传变异位点中国人群GWAS研究数据的深入挖掘人体测量、血脂、生物标记物检测2000例社区高危人群10000病例对照人群验证欧美人群GWAS报道的AS相关位点高危人群随访，构建预测模型功能研究揭示遗传分子机制研究特色与创新：结合中国人群GWAS研究中200万个遗传变异信息以及多个代谢通路基因网络，基于通路和遗传网络系统分析SNPs、CNVs和单体型变异信息，采用CART、MARS、MDR、贝叶斯网络、随机森林等数学模型，构建遗传因素及环境危险因素的预测模型，找到检查、定量临床疾病亚型的干预靶点，监测疾病进展，确定高危患者，最终实现定量风险评估和个性化早期预警。可行性分析：目前收集了高质量的20000例冠状动脉综合征、冠心病和心肌梗死的病例对照资料，为开展大规模重复验证奠定了基础。完成了30余个基因与冠心病和脑卒中的关联和功能研究，发现了数个在国人冠心病和脑卒中发病中具有重要作用的SNPs及单体型。已经应用Affymetrix 500K芯片完成了1500例心梗病例对照的全基因组关联研究，在此基础上进行了imputation，获得200万个遗传变异信息，并发现一系列显著关联位点和区域。应用CART和MARS模型开展了相关代谢通路中11个候选基因的33个SNPs的多基因统计分析，发现SNPs位点间的交互作用在高血压发生中具有重要作用（Hypertension 2006，47：1147-54）。在易感基因功能研究方面，具备分子生物学、真核基因表达调控的研究梯队，并已开始进行心血管疾病易感基因/多态的功能研究。第二部分 内外环境因素影响动脉粥样硬化发生发展的分子机制学术思路与技术途径：1.首先构建AS的诱导模型，引进ApoE-/-鼠或LDLR -/-鼠并给与高脂饮食饲养诱导AS模型。给与辣椒素及黄酮类物质喂食，分离动脉，油红O染色观察斑块面积大小。观察对于斑块形成和面积大小是否有影响。转录组学发现辣椒素和黄酮类物质影响AS发生发展过程相关的信号途径和分子。对于能量限制，由于小鼠体内致AS必需要高脂饮食，无法直接观察能量限制对于AS的影响，因此我们在体内和细胞水平进行能量限制，通过转录组学发现能量限制影响到的基因，对该基因进行深入研究。2.对找到的分子，进行体内和体外实验阐明其功能。在细胞水平，我们通过过表达，干扰以及分子的激活剂和抑制剂处理观察对于不同细胞功能的影响，如对内皮细胞的衰老，对平滑肌细胞的增殖和迁移，对巨噬细胞的吞噬功能的影响；在动物水平，我们构建转基因和基因敲除动物，并与ApoE-/-鼠杂交，同时给予高脂饮食，最后观察对于斑块的形成及面积大小有无影响。3.对于这些分子的起作用的机制，我们利用蛋白质相互作用的技术方法找到这些分子的相互作用蛋白，阐明信号通路；并通过基因表达调控的方法和技术，阐明对于下游基因表达和调控的影响。通过明确信号通路和下游基因构建小范围的相互作用图谱。4对于研究中发现起作用的关键分子，探讨其作为诊防治靶点的可能性。获取临床标本，观察AS发病与关键分子的RNA、蛋白表达水平是否存在相关性；分析关键分子的激活剂或抑制剂是否抑制或促进AS的发生发展。明确该分子是否可作为AS诊防治的靶点。血管功能与AS斑块分析转基因/基因敲除等动物实验过表达或干扰等分子生物学技术信号通路与细胞功能变化提供诊、防、治靶点与措施基因表达谱改变，蛋白质组学变化AS关键调控分子构建分子作用小网络组蛋白修饰，DNA甲基化等表观遗传学变化能量限制及辣椒素，黄酮等类物质的特殊饮食研究特色与创新：1.本研究从能量限制这个新视角探讨AS的发病机制，具有很强的原创性和新颖性。2.提出辣椒素等特殊饮食对于AS发病的影响。将外源性环境因素与其内源性作用靶点联系起来，探讨动脉粥样发病的分子机制。可行性分析：课题组长期从事AS的研究，对于内外环境因素影响AS的发病及其机制的研究具有较好的实验基础。前期已系统研究了一些特殊饮食的作用及靶点和能量限制的相关分子，建立了各种血管细胞的原代培养模型和多种检测细胞功能的方法；拥有成熟的分析基因表达调控和信号传导以及表观遗传调控的分子生物学方法。有转基因动物构建技术和平台，并有辣椒素靶点TRPV1敲除鼠及能量限制相关分子Sirtuins基因家族的转基因动物、组织特异性转基因动物和基因敲除动物。第三部分 脂代谢紊乱导致动脉粥样硬化发病的分子机制学术思路与技术途径：体外研究：1.原代培养血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞，与不同类型富含TG脂蛋白以及II型糖尿病患者HDL共培养，用氧化应激和炎症通路相关因子矩阵PCR和蛋白组学方法，确认特异性的氧化应激途径；明确促进内皮环氧合酶2（COX2）活性和表达的分子机制；2.应用RNA干扰、特异性抗体和特异性激动和阻断剂，对脂质沉积、细胞活化、增殖和凋亡等AS病变以及COX2表达等细胞生物学终点进行干预分析；3.免疫共沉淀法确认与清道夫受体A（SR-A）胞浆域特异结合的分子，并通过筛选噬菌体肽库钓取与胞浆区特异性结合的多肽，进一步对这些分子和多肽进行抗AS功能分析。体内研究：1.制备AS易感的高TG小鼠模型，喂饲高脂食物以及损伤其动脉壁加速AS形成，检测动脉、心脏和肝脏的基因组、蛋白组和代谢组学的改变，并分析这些组织的氧化应激、炎症以及脂代谢通路中相应的改变，并用其他动物模型进一步验证。2.在此基础上选择数个干预靶点进行实验性治疗。同时寻找对高TG所致AS有预测性的生物标识物，并在相应的临床病人中进行验证。3.制备干扰SR-A胞浆结合域功能的转基因小鼠模型，以验证在体内是否能够减缓AS的形成。并应用从多肽库筛选得到的干扰SR-A胞浆结合域的多肽进行实验性治疗，为临床防治AS提供新的措施。血管壁、心脏和肝脏的基因组、蛋白组及代谢组学分析氧化应激和炎症通路矩阵PCR和蛋白组学确认靶分子；结合分子对体外实验确认的靶点实验性治疗RNAi、抗体、抑制剂拮抗验证激活、增值、脂质沉积、COX2表达；SR-A胞浆域结合分子原代血管内皮、平滑肌、巨噬细胞，表达SR-A的293细胞高脂食物诱导和动脉壁球囊损伤（体内研究方案富含TG脂蛋白、II型糖尿病患者HDLAS易感的ApoCIII转基因和LPL缺陷高TG动物模型不同类型的AS病变形成，心、肝其它器官的血管病变体外研究方案 对比 分析 阐明高TG导致AS的新通路确定新的抗AS靶点提出早期干预AS的新措施研究创新性：高甘油三酯血症可通过氧化应激导致AS形成；证明清道夫受体A的胞浆域在AS发生中起关键作用；发现HDL具有调节内皮细胞环氧化酶1的新功能。应用系统生物学手段对这些新发现进行从分子、细胞到整体水平进行深入探索，从而提出新的假说和理论。可行性分析：围绕本课题的设置，已经建立了多项实验技术，并取得了较多相关的预实验结果，包括：1)发现了富含TG脂蛋白携带大量的脂质过氧化产物，并通过氧化应激反应引起内皮细胞的活化，有可能成为AS形成的始动因素；2)通过对巨噬细胞中的清道夫受体SRA1胞浆域的相互作用研究，发现了具有结合胞浆域功能并干扰氧化LDL内吞作用的基因GRP78。据此合成的多肽H11可以减少巨噬细胞中脂质的沉积。3)通过对化合物库的筛选，发现了一种化合物GYY4137可显著减少ApoE基因敲除小鼠的AS面积，并改善主动脉舒张功能；对血浆胆固醇和HDL没有影响却可降低TG水平。4)糖尿病患者的HDL能显著增加内皮细胞环氧化酶2（COX2）表达，促进了PGI2 的释放，表现为对AS的代偿性保护作用。5)构建了新的具有HDL受体功能的ATP合酶腺病毒载体，将应用于已知HDL载体SRB1基因敲除小鼠研究，从而发现HDL功能异常的新机制。6）在前期工作中，已经解决了技术难题，成功制备了高TG的ApoCIII转基因小鼠、家兔和小型猪。第四部分 含硫氨基酸家族在动脉粥样硬化发生中的炎症和免疫调节作用及分子机制学术思路与技术途径：本课题采用系统生物医学的观念和手段，特别采用功能蛋白质组学分析的方法，以血管细胞和管周脂肪细胞及免疫细胞（巨噬细胞， T细胞， 树突状细胞）为对象，探讨关键炎性因子的主要来源及其受含硫氨基酸家族调控的机理，阐明细胞内起关键作用的蛋白质靶分子及其修饰机制。最后在整体AS动物模型乃至临床病人中，探讨血管局部炎症和抗炎症系统如何失衡从而介导了血管慢性炎症的发病机制，并改变关键蛋白靶点后进行功能验证。以寻找出主要慢性炎症生物标记物与含硫氨基酸家族作用的主要途径，分析环境致病因素单独或协同作用引起相同或相似的动脉血管损伤的原因，以及同一致病因素在不同人群和个体引起不同损伤的炎症和抗炎症机制，为发现具有抗动脉硬化慢性炎症潜在药物的作用靶点奠定基础。 研究创新性：含硫氨基酸家族代谢成员间的动态平衡关系以及它们的效应间的“网络”调节两个层面出发，探索AS的炎症免疫发病新的调控机制。可行性分析：国内合作十年已经形成了包括本课题主要成员在内的从内源性含硫氨基酸家族（代谢同源分子），包括Hcy与H2S及其主要代谢酶在AS发生、发展中的作用的精良的研究队伍；本课题组已经在国内建立了很好的学科交叉和优势互补合作研究，包括在蛋白质组学和系统生物学以及分子病理生理学和临床研究的优秀团队，用新的思维和新的研究模式对内源性含硫氨基酸家族（代谢同源分子）代谢物存在和功能展开全面研究；本课题主要承担和合作单位均具有良好的蛋白组学平台和系统生物学平台以及工作经验；本课题组还拥有研究所需的多种转基因和基因敲除AS实验动物模型，为工作的顺利开展提供了必要条件。第五部分 血管重塑与动脉粥样硬化发生发展的分子机制学术思路与技术途径：本课题建立和优化心肌桥物理仿真模型，探索内皮损伤导致血管重塑造成血管再狭窄分子机制，研究如何在抗再狭窄-内皮修复-血管正性重构-远期预后支架寻求平衡点，阐明外膜的细胞成分对于应答血管损伤和导致血管重塑的具体的分子机制。1.以内皮细胞作为工作重点，检测不同AS模式动物内皮细胞在不同剪切应力作用下的功能变化，内皮细胞如何感应机械剪切力，并把机械信号转变为分子信号传递到核内并引起一系列下游事件改变。2.基于生物医学工程建立心肌桥物理仿真模型，搭建研究心肌桥近段壁冠脉易发AS的研究平台，探索该处复合应力对内皮细胞结构功能的影响，阐明桥近段冠脉易发AS分子机理，为心肌桥是否能成为AS新的解剖因素提供理论依据。3.在药物支架抗再狭窄-内皮修复-血管正性重构-远期预后链中寻求平衡点，寻求在血管过度正性重塑中具有预报价值的信号分子；通过新型的影像学检测手段跟踪药物支架植入后血管重构的影像学特征，探索并构建早期筛查再狭窄和晚期支架内血栓及贴壁不良风险预报的临床参数系统。4.以血管外膜为研究对象，研究成纤维细胞分泌因子的相互作用及其信号通路；从细胞及器官水平阐明外膜在血管重塑中的作用，寻找新的干预靶点。特色与创新性：心肌桥物理仿真模型逼真模拟符合体内不同程度的心肌桥模型；率先进行药物支架内皮化的分子调控研究和药物支架涂层材料分子生物学研究；识别血管外膜产生的血管活性因子，探索调控细胞分化和表型转化的机制，以确定外膜在AS发生中的地位。可行性分析：本课题组已经从国外引进SMS2KO小鼠、SMS2LTg小鼠等AS模式动物，与本项目有关的关键设备层流切应力平行板装置由上海理工大学研制，能保证细胞受到不同水平的恒流剪切力作用，经过10多年的使用和不断完善，具有更好的可比性和稳定性；已经初步建立符合体内血流动力学的心肌桥模型，可以调节不同的压迫程度；还建立了相关的内皮细胞三维培养体系，这个培养体系可以放置到心肌桥模型中进行观察。第六部分 动脉粥样硬化斑块不稳定性和早期防治学术思路与技术途径：1.构建斑块不稳定动物模型，在ApoE-/-背景下过表达促进斑块不稳定的基因并评价其作用。2.利用构建的斑块不稳定动物模型，研究免疫炎症和氧化应激对于斑块不稳定性的影响及其分子机制。3.同时研究调节血管内皮细胞凋亡的关键因子在斑块不稳定性的作用以及信号转导网络。4.比较稳定和不稳定斑块中主要细胞成分组蛋白修饰状态的差异，寻找不稳定斑块组成细胞中出现组蛋白表观遗传学异常的分子机制以及这些组蛋白修饰差异对斑块稳定性的意义。5.研究不同生物力学变化对血管细胞形态、排列和生物学标志物以及斑块应变的影响。多方位探讨斑块不稳定的理化机制，寻找能够干预不稳定性斑块形成的新通路和新靶点。AS斑块不稳定动物模型的建立及评价氧化应激对于斑块免疫炎症的影响比较并寻找不稳定斑块的表观遗传学差异血管生物力学对易损斑块结构的影响血管内皮细胞凋亡对斑块不稳定的作用及机制免疫细胞和免疫调控分子影响斑块不稳定性的机制生物信息学方法确定内皮细胞凋亡和自噬的新因子利用组学技术探讨DNA甲基化和组蛋白修饰状态的调控机制明确导致斑块破裂的关键力学和分子偶联机制不稳定斑块干预的新通路和新节点研究的创新性：首次建立与人类不稳定斑块病变相似的具有高自发破裂率和高血栓发生率的“双高”ApoE-/-小鼠模型。发现的PC-PLC和ITGB4抑制剂寻找血管内皮细胞凋亡和自噬的新因子和新通路，发现凋亡和自噬信号通路的新节点。建立一种取得高纯度血小板的新途径，首次提出LPS通过血小板TLR4/PI3K/Akt信号通路引起血小板活化。首次提出针对不稳定斑块的多因子调控网络进行节点干预研究，提出力学与生物信号分子联合调控斑块易损的新机制和新思路，为防治易损斑块提出新的干预靶点。可行性分析：本课题一直从事AS不稳定斑块的基础和临床研究，承担多项国家重大和重点研究课题，形成了以AS不稳定斑块发生机制、预警技术和防治措施为突出特色的研究方向，已成为国内外知名的AS研究中心。主要包括：在不稳定斑块动物模型的研究方面，本课题组已建立了斑块破裂率高达80%的新西兰兔模型、斑块内出血的新西兰兔模型以及斑块自发破裂的ApoE-/-小鼠模型，在此领域中积累了丰富的经验，为本课题建立“双高”的ApoE-/-小鼠模型奠定了良好的基础；发现10多种小分子化合物对血管内皮细胞凋亡有重要调节作用，尤其发现PC-PLC抑制剂D609可显著抑制AS的发展，使斑块趋于稳定，证明3BDO能抑制血管内皮细胞自噬；创建了PGHS-1和PGHS-2的基因打靶的小鼠4种变异体包括PGHS-2 Y385F ，PGHS-1 Neo，PGHS-1>PGHS-2和PGHS-2 Neo；发现了多个稳定斑块的治疗新靶点，证明不同靶点的联合基因干扰较单一靶点的基因干扰可更有效地稳定斑块；用不同浓度LPS刺激血小板，建立了LPS刺激血小板活化的方法，为研究血小板TLR4受体的生物学活性提供了实验基础；已建立了研究血管生物力学的整套实验系统，保障了本课题的顺利实施；有先进完备的蛋白质组学技术平台和具有丰富经验的生物信息学、转录组和蛋白组学领域研究人员，已建立了完善的AS患者标本数据库，为本课题的实施提供了重要保障。四、年度计划年度研究内容预期目标第一年1. 筛查AS相关基因遗传变异。2. 建立动脉粥样硬化的动物模型和细胞模型以及能量限制，辣椒素处理方法和高脂诱导的方法。3. 探讨含硫氨基酸家族主要代谢产物及相应的代谢酶产生和降解等变化规律和特点。观察含硫氨基酸家族主要代谢产物对血管和免疫细胞致炎和抗炎功能的影响和可能的机制。4. 不同剪切应力对于内皮功能分子，细胞膜感受复合体的影响以及有关信号传导通路的影响。以内皮为研究核心，观察药物支架植入后对于血管重塑的正反作用及机制。5. 在ApoE-/-小鼠（高脂血症遗传背景）中给予高脂喂养（加速斑块形成）、颈动脉放置狭窄套管（造成内皮损伤和斑块定位）、应激状态（造成斑块炎症和自发性破裂）、组织因子TF或纤溶酶原抑制物PAI-1基因过表达（造成血栓形成），应用病理学技术测量和对比稳定和不稳定斑块的自发破裂率和血栓发生率，预期可导致“双高”的ApoE-/-小鼠模型。1. 筛查出潜在的与AS相关的遗传多态位点，用于进一步鉴定。2. 建立能量限制与特殊饮食影响动脉粥样硬化和细胞血管功能的体内和体外模型。3. 明确含硫氨基酸家族主要代谢产物及相应的代谢酶产生和降解等变化规律和特点；阐明其对不同细胞致炎和抗炎平衡的影响。4. 明确内皮细胞如何感应机械剪切力，将机械信号转变为分子信号传递到核内以及一系列下游事件改变。寻求在血管过度正性重塑中具有预报价值的信号分子。5. 建立与人类不稳定斑块病变相似的具有高自发破裂率和高血栓发生率的“双高”ApoE-/-小鼠模型，为不稳定斑块的发生机制和干预策略研究提供理想的动物模型。第二年1. 综合分析遗传变异与急性冠脉综合征以及中间表型的关系。2. 在细胞水平，观察能量限制，辣椒素和高脂处理对于血管细胞功能和斑块形成和面积大小的影响。筛选高脂处理处理细胞引起的氧化应激、内质网应激、炎症通路的显著改变的靶点；采用系统生物医学的观念和手段寻找在高同型半胱氨酸加速动脉硬化发生和发展的慢性炎症过程中调控的关键炎性因子，并进行功能验证。3. 建立优化心肌桥物理仿真模型。检测心肌桥物理仿真模型对于内皮细胞形态、凋亡与增殖功能、自分泌及旁分泌功能，粘附分子、炎症因子、细胞外基质、氧化应激相关分子等的变化情况以及基因表达谱的影响。4. 分析POX对AS发生发展的影响；鉴定影响血管内皮细胞自噬、凋亡的新因子；分析免疫细胞和因子在不稳定斑块的作用和机制；研究LPS诱导血小板活化的关键靶分子；观察血管生物力学对易损斑块结构的影响；研究参与斑块细胞的全基因组表观遗传谱式和差异。1. 综合分析基因变异与急性冠脉综合征以及中间表型的关系。发现5-10个对AS发病危险具有重要作用的位点。2. 明确能量限制与辣椒素对于细胞，血管功能的影响和对于动脉粥样硬化是否具有的保护/促进作用。初步完成高脂处理和髙同型半胱氨酸处理的功能基因组学和蛋白质组差异分析，筛选出炎性反应通路中的主要途径和3-5个关键因子。3. 运用此模型，探索该处复合应力对内皮细胞结构功能的影响。4. 阐明POX活性对斑块氧化应激和斑块不稳定的影响及其分子机制。第三年1. 应用分子细胞生物学技术研究重要多态的生物学功能。2. 筛选与能量限制和辣椒素等相关的作用分子，对于能量限制和高脂饮食相关的分子构建重要分子的转基因和基因敲除的动物模型。3. 研究Hcy对关键靶分子蛋白的调控和翻译后修饰机制,探讨其受含硫氨基酸家族调控的可能机理以及分子结构学基础。4. 阐明心肌桥对不同节段内皮细胞变化及其机制。寻找引起内皮细胞变化的关键因素，建立血流动力学评估系统。观察药物支架植入后，内皮细胞和平滑肌细胞在重塑中的交互作用。5. 分析POX对AS易损斑块的影响；研究影响血管内皮细胞自噬、凋亡特异性胞内信号通路；分析免疫调控分子在斑块不稳定性中的作用和机制；分离、鉴定活化血小板中特异的磷酸化蛋白和磷酸化位点；观察不同剪切力分布的斑块局部炎症因子和胶原的测量；研究全基因组表观遗传谱式和分析差异生物信息学数据1. 确定重要多态在AS斑块进展中的生物学作用。2. 找到3-5个与能量限制与特殊饮食相关的重要调控分子。3. 明确不同细胞中，Hcy和H2S对靶蛋白分子的调控修饰机制。4. 阐明桥近段冠脉易发AS分子机理，为心肌桥是否能成为AS新的解剖因素提供理论依据。5. 明确血管内皮细胞自噬与斑块不稳定性的关系及其机制，发现控制血管内皮细胞自噬的新因子，揭示炎症因子引起血小板活化的信号转导通路，明确干预血小板活化的关键靶点，寻求有效预防血栓形成的策略，揭示炎症引起血小板活化的信号转导机制。第四年1.结合遗传学找到的遗传变异位点，能量限制、脂质代谢紊乱以及髙同型半胱氨酸研究中找到的关键分子，研究其生物学功能，并找出其相互作用分子和上下游信号分子，分别构建分子作用小网络。2.采用新型的影像学检测手段跟踪药物支架植入后血管重构的影像学特征。探索支架在如何防止过度重塑。3.观察系统性POX分析花生四烯酸代谢对易损斑块的影响；利用SiRNA、特异性阻断剂、转基因/基因敲除观察对易损斑块的影响；观察免疫抗体诱导或基因敲除阻断观察免疫细胞对易损斑块的影响；研究LPS诱导血小板活化的关键和有效靶点；筛选机械力与斑块破裂有关的关键因子和作用靶点；筛选表观遗传差异调控斑块破裂相关的关键作用因子。1. 探讨AS重要相关基因变异的分子遗传机制。初步明确重要调控分子起作用的信号网络。2. 探索并构建早期筛查再狭窄和晚期支架内血栓及贴壁不良风险预报的临床参数系统。3. 明确力学改变对斑块炎性因子、胶原代谢和血管新生的影响及其分子机制和信号转导通路，阐明导致斑块破裂的关键力学和分子偶联机制第五年1. 结合急性冠脉综合征病例对照和AS高危人群的前瞻性研究，评价遗传变异及其联合作用与AS评价指标间的关系。用于指导AS早期预警、风险评估和个性化防治。2. 对于能量限制机制、脂质代谢紊乱机制、高同型半胱氨酸机制中发现的关键调控分子，从临床获得标本，分析这些分子与临床表型的关系；明确该分子是否可作为AS的生物标记物和诊防治的靶点。3. 研究血管外膜对血管收缩/舒张功能的影响。阐明血管外膜损伤过程中的反应及其基因蛋白表达变化对血管重塑中的作用，为寻找新的干预靶点奠定基础。4. 在已知的多种黏附、趋化、炎症和细胞因子中，利用单一和联合基因过表达或基因干扰等方法，确定干扰的新靶点；比较稳定和不稳定斑块中主要细胞成分组蛋白修饰状态的差异，探讨表观遗传机制。1. 评价遗传变异及其联合作用与动脉粥样硬化评价指标间的关系。筛查出1-2个AS早期预警遗传标记。2. 寻找可用于AS新的相关分子；确定新的抗AS靶点分子，明确其功能及临床意义；申请国内外专利。3. 明确成纤维细胞分泌因子的相互作用及其信号通路。从细胞及器官水平阐明外膜在血管重塑中的作用，寻找新的干预靶点。4. 建立具有国际先进水平的斑块稳定性的基础研究和防治体系，围绕动物模型、内皮功能、氧化应激、炎症免疫、血小板活化、生物力学和蛋白组学等七个方面，提出稳定斑块的新理论、新观点和防治新靶点。一、研究内容AS是多基因，多因素，多阶段，长时程的疾病。AS的发病受遗传因素和内外环境的影响。AS受多个微效基因的影响，有家族史的人易发生AS；内外环境因素可诱发脂类平衡紊乱和炎症免疫反应，脂类沉积到内膜下，引起炎性细胞浸润，血管内膜增厚，斑块形成，长期积累效应使血管重塑，管腔狭窄，阻碍血流，器官功能发生障碍；不良环境因素的刺激可能诱发斑块不稳定而破裂，产生心梗和脑卒中等并发症。根据我国国情，遵循基础与临床紧密结合的方针，设置课题方向为1）中国人动脉粥样硬化遗传分子基础；2）内外环境因素影响动脉粥样硬化发生发展的分子机制；3）脂代谢紊乱导致动脉粥样硬化发病的分子机制；4）含硫氨基酸家族在动脉粥样硬化发生中的炎症和免疫调节作用及分子机制；5）血管重塑与动脉粥样硬化发生发展的分子机制；6）动脉粥样硬化斑块不稳定性和早期防治。第一部分 中国人动脉粥样硬化遗传分子基础关键科学问题：本研究综合全基因组关联研究数据和多个代谢通路相关基因网络，阐明AS发生发展过程中不同亚临床和临床表型遗传因素的作用，并最终阐明其分子遗传机制，为AS发生的早期预警提供依据。主要研究内容：1.综合全基因组关联研究数据和多个代谢通路相关基因变异信息，开展大规模多阶段的验证研究，筛查和鉴定我国人群AS疾病新的易感基因和遗传标记。2.应用分子生物学、细胞生物学、动物模型等手段，研究基因变异对基因表达或生物学功能的影响，明确新的易感基因或遗传标记的遗传分子机制。3.采用分子影像学和冠脉造影等技术手段检测正常人和高危人群的血脂水平、血栓形成、斑块钙化分级、颈动脉内中膜厚度、脉搏波速度和冠脉狭窄程度等AS相关亚临床和临床表型以及中间表型，动态和系统评价多种代谢通路基因间相互作用的遗传网络在AS发生、发展以及斑块稳定性及斑块进展程度的作用。4.在大规模前瞻性研究中评估验证遗传标记和环境因素的预警价值，建立AS发生发展的风险预测模型，寻找早期诊断、危险分层及临床干预的关键靶点。第二部分 内外环境因素影响动脉粥样硬化发生发展的分子机制关键科学问题：在前期研究基础上，深入探讨能量限制和特殊饮食等内外环境因素对AS发生发展的影响；研究这些因素起作用的表观遗传调节等的分子及其作用机制，构建作用小网络；并探讨关键分子作为防治诊靶点的可能性。主要研究内容：1.观察能量限制、辣椒素和黄酮类物质的作用。在细胞水平，观察能量限制，辣椒素及黄酮类物质对于血管细胞功能的影响。在动物水平，观察辣椒素及黄酮类物质对斑块形成和面积大小的影响。2.用不同饮食因素处理，寻找与AS发生发展过程相关的表观遗传调节的分子。3.对于已发现的Sirtuins基因家族和新发现的分子，构建转基因动物和基因敲除鼠，观察其对AS的影响，阐明其功能和作用机制。在细胞水平，观察对于不同类型细胞的功能的影响，包括内皮细胞的衰老状态和舒张功能，平滑肌细胞的增殖、凋亡、分泌和迁移功能，巨噬细胞的吞噬功能和脂质反向转运功能。明确这些分子起作用相关的表观遗传机制和信号通路，构建作用小网络。4.对于研究中发现起作用的关键分子，探讨其作为诊防治靶点的可能性。获取临床标本，观察AS发病与关键分子的表达是否存在相关性；分析关键分子的激活剂或抑制剂是否抑制或促进AS的发生发展。通过这些明确该分子是否可作为AS诊防治的靶点。第三部分 脂代谢紊乱导致动脉粥样硬化发病的分子机制关键科学问题：高TG伴低HDL是国人脂代谢紊乱的主要表型，本研究在前期工作基础上进一步阐明富含TG脂蛋白和低HDL诱发AS的途径及其作用机制，寻找防治AS的新靶点；明确干扰泡沫细胞形成的关键分子清道夫受体胞浆域功能来逆转AS的可能性。主要研究内容：1.应用原代培养的血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞，与不同的富含TG脂蛋白（乳糜微粒，乳糜微粒残体，极低密度脂蛋白，极低密度脂蛋白残体）培养后，以氧化应激和炎症通路矩阵PCR和蛋白组学方法，确认特异性的氧化应激途径，并应用RNA干扰、特异性抗体和特异性激动和阻断剂，对脂质沉积、细胞活化、增值和凋亡等AS病变的细胞生物学终点进行干预分析；应用LPL基因缺陷以及ApoCIII转基因的高TG模型小鼠，与ApoE和LDL受体缺陷的AS易感小鼠交配后，分别喂饲高脂食物以及通过动脉壁损伤加速AS形成，在不同的时间分别取动脉、心脏和肝脏，以基因组、蛋白组和脂质组学等系统生物学手段，检测和分析这些与AS密切相关组织的氧化应激通路、炎症通路以及脂代谢通路中相应的改变。并应用高TG的ApoCIII转基因家兔和小型猪进一步验证。在此基础上选择数个干扰靶点，进行实验性治疗。同时寻找具有对高TG所致AS严重度有预测生物标识物，并在相应的临床病人中进行验证。2.通过分析II型糖尿病患者的HDL蛋白组学，以及与内皮细胞孵育后细胞基因组和蛋白组的变化，以COX2的表达与活性改变为终点，明确和验证II型糖尿病患者HDL促进内皮环氧合酶2（COX2）的分子机制及其对AS代偿性影响的生理意义。3.发现和验证AS病变中泡沫细胞形成的新机制，制备干扰清道夫受体胞浆结合域功能的GRP78的转基因小鼠模型，以验证在AS易感小鼠体内是否能够减缓AS病变的形成，并应用从多肽库筛选得到的干扰清道夫受体胞浆结合域功能的多肽H11，进行AS实验性治疗，为临床防治AS提供新的措施。第四部分 含硫氨基酸家族在动脉粥样硬化发生中的免疫和炎症调节作用及分子机制关键科学问题：在以往长期系列研究的基础上，以含硫氨基酸家族代谢产物之间形成的网络，特别以Hcy与H2S为核心造成的致炎与抗炎作用之间调控机制为主轴,研究它们与重要蛋白质的相互作用机理及重要靶蛋白修饰的特点和规律,阐明它们在AS发生和发展不同阶段中的作用及机制。 主要研究内容：采用高通量的翻译后修饰位点的筛选方法，探索含硫氨基酸家族主要成员是否通过对血管细胞和免疫细胞膜或细胞内与炎症调控相关的特定靶分子进行翻译后修饰,促使或减缓AS发生发展。从内源性含硫氨基酸家族成员间的动态平衡关系和其效应间的“网络”调节关系中探寻拮抗高同型半胱氨酸引起的血管慢性炎症损伤的内源性保护小分子物质。1.在高同型半胱氨酸加速高脂引起的动脉硬化发生和发展的慢性炎症过程中, 含硫氨基酸家族主要代谢产物和代谢酶的变化规律，特别是它们产生和降解的特点。2.含硫氨基酸家族主要代谢产物对血管和免疫细胞致炎和抗炎功能的影响和机制，特别是探讨它们引起血管炎症和免疫细胞变化的靶蛋白翻译后修饰机制以及分子结构学基础。3.含硫氨基酸家族主要代谢产物（Hcy和 H2S）及其主要代谢酶(通过改变其基因和抑制蛋白的活性)在AS发生、发展及治疗中的作用；重点研究血管内皮、血管外膜成纤维及脂肪细胞与不同免疫细胞在上述AS病变发生和发展中的关键起始作用机制和对关键靶分子蛋白的调控和修饰机制。第五部分 血管重塑与动脉粥样硬化发生发展的分子机制 关键科学问题：AS血管重塑是通过血管内膜和外膜和其周围脂肪组织共同作用的结果。本课题将建立和优化心肌桥物理仿真模型，探索内皮损伤导致血管重塑造成血管再狭窄分子机制，研究如何在抗再狭窄-内皮修复-血管正性重构-远期预后支架寻求平衡点，阐明外膜的细胞成分对于应答血管损伤和导致血管重塑的具体的分子机制。主要研究内容：1.检测不同AS模式动物（SMS2KO、SMS2LTg）内皮细胞在不同剪切应力作用下的功能变化，内皮细胞如何感应机械剪切力，并把机械信号转变为分子信号传递到核内并引起一系列下游事件改变。2.检测心肌桥物理仿真模型对内皮细胞形态、凋亡与增殖功能、自分泌及旁分泌功能等的影响；探讨心肌桥对内皮细胞基因表达谱（NOS、ET-1、MCP-1、原癌基因等）的变化；阐明心肌桥对不同节段内皮细胞变化及其机制；通过模型分析，寻找引起内皮细胞变化的关键因素，建立血流动力学评估系统。3.以内皮为研究核心，观察药物支架植入后对于局部血管重塑的新特点，药物支架的涂层及药物对于血管重塑作用及机制；内皮细胞和平滑肌细胞在重塑中的交互作用及其中的分子信号通路的调控；探索支架在维持血管正性重塑稳定粥样斑块和内皮功能的完整并防止过度重塑的分子机制。4.研究血管外膜成纤维细胞的自分泌与旁分泌作用；研究血管外膜对血管收缩/舒张功能的影响；并以血管急慢性损伤模型为整体研究对象，阐明血管外膜损伤过程中的反应及其基因蛋白表达变化对血管重塑中的作用。第六部分 动脉粥样硬化斑块不稳定性和早期防治关键科学问题：促使AS斑块从不稳定向稳定的方向转变，是预防急性心血管事件的主要途径。本课题研究活动性炎症、免疫失衡、细胞凋