10项目九 花卉植物组织培养技术.docx

10项目九 花卉植物组织培养技术学习目标知识目标：1.牢固掌握花卉植物组织培养的基本原理和基本过程。2.熟悉常见花卉植物组织培养影响因素。能力目标：1.熟练掌握花卉植物实验室组织培养的技术。2.具备花卉植物快繁和工厂化育苗基本技能。3.具备独立完成常见花卉的组织培养设计方案的制定和评价能力。任务分析花卉植物组织培养，就是分离花卉植物体的一部分，如茎类、茎段、叶、花、幼胚等，在无菌试管，并配合一定的营养、激素、温度、光照等条件，使其产生完整植株。由于其条件可以严格控制，生长迅速，1-2个月即为一个周期，因此在花卉植物的生产上有重要应用价值。通过组织培养对一些难繁殖的名贵品种花卉及一些短期内大量急需生产的花卉，应用很广，实现快速繁育。对于菊花、香石竹、非洲菊等一大批花卉靠无性繁殖法繁殖，病毒逐代传递积累，危害日趋严重。而分离花卉植物0.10.5mm大小的生长点，培养得到的基本上是无病毒苗。所以，通过组织培养可以实现无病毒苗培育。因此这一技术已在花卉无病毒苗的培育中广泛应用。同时还有许多花卉可以进行远缘杂交，由于生理代谢等方面的原因，常使杂种胚早期败育，因而得不到杂种植物。而在试管中进行胚培养，可使其顺利生长，得到远缘杂种。此外还可采用愈伤组织诱变、花粉培养等多种方法，来进行花卉育种。针对当前市场需求量大，栽培面积广的花卉，本项目分解为六个任务来完成（12课时）：第一个任务是菊花组织培养技术（2课时）；第二个任务是香石竹菊花组织培养技术（2课时）；第三个任务是非洲菊菊花组织培养技术（2课时）；第四个任务是兰花菊花组织培养技术（2课时）；第五个任务是红掌菊花组织培养技术（2课时）；第六个任务是观赏凤梨菊花组织培养技术（2课时）。10.1任务1 菊花在组织培养技术学习目标1.掌握菊花组织培养的基本知识。 2.熟悉菊花的组织培养方法和流程。3.熟悉常用脱毒苗检测方法。任务要求1.通过菊花的茎尖培养获得无病植株2.通过愈伤组织途径或丛芽途径获得菊花试管苗3.菊花试管苗生根培养 一、任务提出 教师通过向学生展示菊花不同生长与分化阶段的试管苗和商品苗，激发学生学习兴趣，提出学习任务：1.菊花的生物学习性有哪些特点？2.菊花组织培养中的外植体如何选取？3.菊花组织培养中的外植体在灭菌和接种操作中应注意哪些要领？4.菊花组织培养常用的培养基有哪些，它的培养条件是什么?5.如何进行菊花外植体的诱导和试管苗的继代培养？6.菊花试管苗在生根和移栽阶段应注意哪些条件？二、任务分析由于菊花的病毒病种类比较多，而且危害也较为严重。所以在菊花组织培养过程中，外植体的灭菌与脱毒是组培成功的关键技术。任何一个微小疏忽都会对菊花的组织培养造成重大损失，所以要求学生在实际操作过程中务必遵守操作规程，把握好细节。采用菊花不同部位组织进行培养时，营养和条件都要不同要求，才能生长和增殖；相同外植体在培养过程中，不同阶段对营养需求是不同的，我们在菊花的组织培养过程中，就要针对不同阶段要选用适合的培养基，并提供给适宜的条件。所以也要求学生在学习过程中要保持严谨的科学态度。三、相关知识菊花（Dendranthema morifolium），多年生宿根菊科（Asteraceae）菊属草本植物，是经长期人工选择培育出的名贵观赏花卉，也称艺菊。原产我国的多年生宿根草本花卉，已有三千多年的栽培历史，现广泛分布于世界是我国的传统名花和世界四大切花之一，深受人们的喜爱，成为世界栽培面积较大的一种重要花卉。长期以来菊花采用分株、扦插等无性繁殖方法进行繁殖，但是传统的繁殖方法易受环境影响，繁殖周期长，随着市场需求的急剧增加,已经不能满足市场日益发展的需要。植物组织培养具有增殖效率高、繁殖速度快的特点,可以用较短的时间和较少的空间生产出大量的试管苗。 （一）形态特征与生物学习性菊花系多年生植物，株高60180 cm ，茎直立粗壮，多分枝，青绿色或带紫褐色，上被灰色柔毛，具纵条沟，呈棱状，半木质化，节间长短不一。叶形大，互生，叶片有深缺刻，基部楔形，表面粗糙，叶背有绒毛。花单生或数朵聚生，边缘为舌状花，中部为筒状花，也有全为舌状或筒状花的，花序形状各异，有球形、莲座形、卷散形等。花色分为黄、白、红、紫、粉几个色系。种子为细小的瘦果，中间膨大，两端突出。    菊花适宜的生育温度为152，512 是开花持久的适温，较能耐寒。其喜阳光充足，通风良好，在光照条件下生长健壮。光照的强弱对花期及花色有一定影响。（二）菊花的组织培养菊花组织培养流程如图10-1-1所示。茎尖、侧芽、花蕾壮苗培养诱导培养移入大田驯化移栽生根培养丛生芽无根嫩茎直接插植图10-1-1菊花组培工艺流程1.无菌体系的建立仅仅应用茎尖进行组织培养，要完全去除病毒是不可能。只有先对所要培养的植物品种进行热处理，以抑制病毒的活化，再用其茎尖进行培养，才能达到脱毒培养的目的。其方法是：将植株在35 38 高温条件下，栽培60 d，其中有相当一部分植株死亡，采用成活下来的植株茎尖，进行培养。（1）外植体的选取、灭菌和接种菊花用于快繁的外植体很多，如茎段、侧芽、叶、花序梗、花序轴等，但最好采用茎尖或侧芽，其次是花序轴。下面以茎尖、茎段和花序轴为外植体说明。选取无病虫害、生在健壮的茎尖和茎段，要求叶密茎粗，以利于将来分化迅速，无性系后代质量好。如以花序轴为材料，应选取具该品种典型特征的、饱满充实的蕾，最好要开放而未开放的花蕾，这时花瓣外有一层薄膜包围，里面洁净无菌，采后便于表面灭菌。过于幼嫩的花蕾，不易灭菌和剥离。茎尖嫩叶不要去掉太多，以免伤口面过多，造成灭菌时过多伤害，过多的叶可在灭菌后、接种之前除去。茎段除去叶，留一段叶柄，流水洗去表面灰尘，在超净工作台用75 %酒精处理2030 s，再用无菌水冲洗35 次，转入0.1 %升汞溶液浸泡710 min，再用无菌水冲洗46 次，用滤纸吸干水分。要除去菊花体内的病毒，需在解剖镜下剥离0.5 mm以下，带2个叶原基的茎尖，接种到诱导培养基上，接种时按材料生长极性的上下端，正放培养基上，尤其是茎尖不可倒置或侧植。菊花也可采用热处理方法来进行脱毒，在3536 条件下栽培2个月，可以除去菊花矮缩类病毒和番茄不孕病毒，但不能除去菊花轻斑驳病毒和褪色斑驳病毒，这两种病毒只有通过茎尖培养途径除去。（2）培养基及培养条件适用于菊花的培养基种类很多，如MS、B5、N6、White等等。但大多采用MS培养基，添加BA 23 mgL，NAA 0.020.2 mgL。菊花对激素的要求并不是很严格的，适用的范围很广。菊花培养的温度范围较宽，2228 都可以，以2426 最好。培养室光照时每天1216 h为宜，光强10004000 Lx较好。    2初代培养图10-1-2 由茎尖诱导的小菊花植株在无菌条件下，用剪刀将外植体茎段切成0.51 cm 长小段，水平放置接种；叶片切成5 mm×5 mm小块，下表皮朝下水平放置接入初代培养基中，接种完成后即转入培养室，培养温度2228 ，光强10004000 Lx。外植体经培养后，一般经46周，茎尖直接分化出新芽（如图10-1-2所示），或经愈伤组织分化出新芽；茎段、花序轴侧芽萌发，可产生一至数个芽。3初代培养最初分化率及分化数量都较少，但随继代次数增加。增殖方式除诱导丛生芽增殖外，也可用茎切段作微型扦插繁殖。丛芽增殖时，将芽丛切或小块，转到分化培养基中即可。微型扦插则以嫩茎梢作材料，将嫩梢剪成1节带1叶的茎段。然后将切段基部插入 MS或MS+NAA 0.11 mgL的培养基中培养，45周后，腋芽即生长成小植株，再照上述方法切剪茎段，重复培养。4生根培养菊花无根苗生根一般较容易，通常在增殖培养上久不转瓶，即可生根，但这种根的根毛较少或无，不利将来移栽和生长，所以常用下列方法处理：一是无根苗的试管生根，切取3 cm左右无根嫩茎，转插到 12MS+NAA(或IBA)0.1 mgL的培养基中，经两周即可生根。然后移栽驯化。移栽初期保持高湿度条件，营养钵基质浇透水，取出生根的试管苗，洗掉附着在根部的培养基，用竹签在基质上打一小孔，将幼苗插入基质中。然后加设小拱棚以保湿，随着幼苗的生长，逐渐降低空气湿度和基质含水量，转为正常苗的管理阶段。 二是无根嫩茎直接插植到基质中生根。利用菊花嫩茎易于生根的特点，可免去试管生根一道之序。剪取23 cm无根苗，插植到珍珠岩或蛭石的基质中，基质事先用生根激素溶液浸透，l0 d后生根率可达95100。菊花用组织培养加快速繁殖，一般46周为一个周期，增殖倍率均在510倍以上。若以5倍计算，平均以40 d为一个周期，一年可获得100900万株苗，比常规繁殖快数千倍。4.试管苗驯化与移栽（1）试管苗驯化。（2）试管苗的移栽苗床准备。试管苗出瓶。（3）试管苗的管理知识链接菊花茎尖组织培养操作步骤如图10-1-3所示：取材粗调整水洗无菌处理消毒无菌清洗调整摘取组织置入培养植物个体形成生长上盆驯化常规栽培扦插繁殖图10-1-3 茎尖脱毒培养图示操作过程（引自菊花组织培养操作图示简述.重庆风景园林网.1011）四、组织实施1.通过对植物组织培养的基本知识、基本原理和、基本技能的学习，根据菊花的生物学特性，熟悉菊花组织培养程序。2.明确菊花组织培养的培养条件，组织讨论做选用的培养基，进行小组分工，明确工作任务和任务要求。3.在教师指导下各小组对用正确的方法对外植体进行选择，采用科学的方法灭菌和接种。4.各小组对灭菌和脱毒的过程中出现的情况及时总结，小组间先和检查灭菌和脱毒效果。5.各小组对试管苗的诱导、继代培养及对生根情况进行相互检查，并认真总结。6.教师结合各小组的任务完成情况，对设计方案及实施过程的进行客观评价，并提出合理化的建议。7.将组培苗移栽的育苗室，并加强对各组的栽培苗驯化锻炼的指导。五、评价与考核项目内 容要 求赋分计划制定1.查阅菊花组培资料，准备好培养基。2.各小组分工情况熟悉菊花组织培养的基本过程,了解影响菊花组织培养的各种因素；小组分工明确，责任到位10物品准备无菌室、洁净工作台或接种箱,配置菊花组培用具根据菊花组织培养要求物品准备到位，确保设备能正常使用10培养材料采集采取菊花组培需要的材料，最常用的培养材料是茎尖。培养材料准备到位。10培养材料灭菌准备好灭菌设备，药品。要求灭菌药剂浓度准确，灭菌时间适当，实验材料清洗干净。10制备外植体将已消毒的材料在无菌条件下制备外植体。在操作中严禁用手触动材料。10接种和培养1.接种：将切好的外植体立即接在培养基上。在无菌坏境下，每瓶接种410个102.封口：接种后，瓶、管、培养皿及时封口。操作方法正确。53.增殖：做好诱导和继代培养注意时机把握，做好观察记录154.根的诱导：采用试管生根或无根嫩茎直接插植到基质中生根法。做好培养基和培养基质的处理。10炼苗移栽做好炼苗和移栽工作。注意水分管理和空气湿度5现场整理清洁操作台、还原药品及用具，整理工作环境。要求整理到位，培养良好的工作习惯和职业情操。5知识拓展一菊花花瓣的培养菊花茎尖培养是在适宜的条件下，大多经培养直接诱导产生植株。而花瓣培养则要去分化，先形成愈伤组织，从愈伤组织再分化产生完整的植株，有的则可产生胚状体而长成完整植株。由于在培养中需经过愈伤组织途径，有去分化和再分化的过程，因而由花瓣培养产生的植株往往有变异产生，表现在植株、叶形、花色、花形等多方面变异，如小苗叶片的叶形、厚薄、缺刻深浅变化，光周期从短日性变为中日性，株型、花色、花型、瓣型等变化，所以花瓣培养可用来进行菊花新品种的繁育。与杂交育种和辐射育种相比，有节省设备和人力、简便易行、机遇高等优点。此外花瓣植株是通过愈伤组织途径产生的，不带病毒，所以对没有产生变异类型的菊花来讲，也可起到复壮提高种性的作用，故花瓣植株表现也生长健壮，花大而艳丽。 1.菊花花瓣培养的方法在菊花开花前23 d将已露白的花蕾，整个剪下，在自来水下冲洗十几分钟，然后在无菌条件下，用75 的酒精浸泡1015 min进行表面灭菌，后用无菌水冲洗两次，再用10 的漂白粉澄清液浸泡20 min，再用无菌水冲洗34次。然后用无菌滤纸吸干水分，剪取舌状花，再用解剖刀切取舌状花约5 mm见方大小，接种到MS基本培养基上，添加BA l3 mg/L，NAA0.52 mgL。接种后置于温度25 左右，光照强度2000 Lx，每天照光12 h的条件下培养。花瓣培养10 d左右，开始产生愈伤组织，呈圆块状，色淡黄至嫩绿，培养2030 d后，从愈伤组织分化产生根系，以后又分化出芽点，但不成轴状结构。有些品种在愈伤组织生长30 d左右，表面可出现大量绿色圆粒状物，用放大镜可观察到似鱼卵群集，即分化形成了胚状体，这是花瓣体细胞产生的，故为无性胚，数量大、成苗多。生长到4050 d后则可见到大量的芽生长产生。有些愈伤组织还需转移到分化培养基中，才能诱导分化得到花瓣苗。分化培养基降低生长素浓度或提高细胞分裂素的浓度。将愈伤组织切成5 mm大小接人，约2030 d培养，可分化出植株。最后需转移到生根培养基，当芽高具34片叶时，移人NAA0.3 mgL的MS培养基中，约经2周培养，产生数条根系，即可得到完整的试管花瓣植株。2.菊花无病毒苗的培养菊花为多年生宿根无性繁殖作物，常年靠分离母体的一部分进行繁殖，因此病毒代代相传，在母体中逐代积累，浓度越来越高，影响植株的生长趋势、花形、花色、花的大小和产花量，过去一直没有较有效的方法克服，现已证明用组织培养的方法可根除或减缓病毒的影响。危害菊花的病毒有：菊花斑纹病毒，造成叶上有轻斑纹，叶脉透明，花瓣上也有斑纹；菊花矮缩类病毒，受害株比正常株矮1223，叶有黄色斑点或成带状，花小，开花早；菊花轻斑驳病毒，叶有轻微斑纹，花褪色，也有斑；番茄不孕病毒，叶片大多无病症，表现花形小，花瓣生长不整齐，有萎蔫现象。此外还有畸花病毒、绿花病毒、褪绿斑驳病毒、花叶病毒等。(1)茎尖培养脱毒首先切取顶芽或腋芽35 cm，并去掉展卉的叶，只留护芽的嫩芽，然后用自来水冲洗，用0.1升汞或饱和漂白粉上清液对材料进行表面灭菌，再用无菌水涮洗数次。在双筒解剖镜下剥离生长点，分离到0.5 mm以下，一般带2个叶原基。分离出的茎尖，生长点朝上，迅速接种或放置灭菌水表面，以防茎尖脱水。菊花病毒可用指示植物鉴定法、抗血清鉴定法、电镜检查法等检测。如果检测时仍有病毒存在，就应淘汰该植株。如果已证明脱除了主要危害的病毒，只要取得一株无毒苗即可繁殖大量的无毒种苗。这样经严格鉴定的去毒苗，称为原原种，原原种种源应保存在试管里和有隔离条件和消毒制度的保护区域里栽培，以防止再度遭到病毒的侵袭。由原原种繁殖产生的植株称为原种。在有试管繁殖的条件下，可以年年栽培原种种苗，保证无病毒的影响。 (2)热处理脱毒 菊花也可采用热处理方法来进行脱毒，在3536 的条件下栽培2个月，可以达到脱毒的效果。但是热处理只能除去菊花矮缩类病毒和番茄不孕病毒，而不能除去菊花轻斑驳病毒和褪色斑驳病毒，后者只有通过茎尖培养途径脱毒来达到目的。知识拓展二菊花无病毒苗的培养菊花为多年生宿根无性繁殖作物，常年靠分离母体的一部分进行繁殖，因此病毒代代相传，在母体中逐代积累，浓度越来越高，影响植株的生长趋势、花形、花色、花的大小和产花量，过去一直没有较有效的方法克服，现已证明用组织培养的方法可根除或减缓病毒的影响。危害菊花的病毒有：菊花斑纹病毒，造成叶上有轻斑纹，叶脉透明，花瓣上也有斑纹；菊花矮缩类病毒，受害株比正常株矮1223，叶有黄色斑点或成带状，花小，开花早；菊花轻斑驳病毒，叶有轻微斑纹，花褪色，也有斑；番茄不孕病毒，叶片大多无病症，表现花形小，花瓣生长不整齐，有萎蔫现象。此外还有畸花病毒、绿花病毒、褪绿斑驳病毒、花叶病毒等。茎尖培养脱毒。首先切取顶芽或腋芽35 cm，并去掉展开的叶，只留护芽的嫩芽，然后用自来水冲洗，用0.1 升汞或饱和漂白粉上清液对材料进行表面灭菌，再用无菌水涮洗数次。在双筒解剖镜下剥离生长点，分离到0.5 mm以下，一般带2个叶原基。分离出的茎尖，生长点朝上，迅速接种或放置灭菌水表面，以防茎尖脱水。菊花病毒可用指示植物鉴定法、抗血清鉴定法、电镜检查法等检测。如果检测时仍有病毒存在，就应淘汰该植株。如果已证明脱除了主要危害的病毒，只要取得一株无毒苗即可繁殖大量的无毒种苗。这样经严格鉴定的去毒苗，称为原原种，原原种种源应保存在试管里和有隔离条件和消毒制度的保护区域里栽培，以防止再度遭到病毒的侵袭，由原原种繁殖产生的植株称为原种。在有试管繁殖的条件下可以年年栽培原种种苗，保证无病毒的影响。10.2任务二 香石竹在组织培养技术学习目标1.掌握香石竹组织培养的基本知识。 2.熟悉香石竹的组织培养流程。3.了解香石竹脱毒苗的鉴定方法。任务要求1.能独立完成香石竹组培培养基的配置2.能熟练香石竹组织培养的基本操作。3.具备香石竹工厂化育苗的基本技术。 一、任务提出 教师通过向学生展示香石竹不同生长与分化阶段的试管苗和商品苗，激发学生学习兴趣，提出学习任务：1.香石竹的生物学习性有哪些特点？2.香石竹组织培养中的外植体如何选取？3.香石竹组织培养中的茎尖剥离和接种操作中应注意哪些要领？4.香石竹组织培养常用的培养基有哪些，它的培养条件是什么?5.如何克服香石竹继代增殖培养阶段再生芽的玻璃化苗现象？6.香石竹试管苗在生根和移栽阶段应注意哪些要领？二、任务分析香石竹是世界五大切花之一，被誉为“母亲节”之花，在花卉市场中占有重要地位。我国香石竹的大规模切花生产是从20世纪80年代中期以后开始的。目前我国香石竹育种工作远远落后于生产的要求。而且面临着耐储藏运输能力差、病虫害严重和原有品种退化的问题。近年来，遗传转化成为观赏植物研究的活跃领域之一，首先应用于遗传转化研究的观赏植物有矮牵牛、香石竹、菊花和月季等。近年来香石竹的遗传转化已取得了长足的进展，在某种程度上已成为花卉遗传转化的模式植物。建立一个良好的转化受体系统是植物遗传转化的前提和基础。香石竹的组织培养历史较早，组织培养体系比较成熟。香石竹再生可以通过以下三种途径：一是器官直接再生不定芽；二是通过愈伤组织再生不定芽；三是体细胞胚途径再生不定芽。1器官直接再生不定芽利用植株外植体不经愈伤组织直接分化不定芽途径，优点是减少组培环节，缩短再生间，减少不定芽变异等，缺点是用于遗传转化有可能出现嵌合体。香石竹器官直接再生不定芽的报道较多，所用外植体包括叶片、茎段、腋芽、茎尖、花瓣和花丝等，其中以叶片和茎节再生不定芽途径最为成熟，不定芽诱导率也较高。2通过愈伤组织再生不定芽通过愈伤组织途径，往往扩繁量大，用于基因转化可获得较多的转化植株。香石竹通过愈伤组织再生不定芽比较困难，有关报道亦较少。3体细胞胚途径再生不定芽该途径的胚性细胞具有很强的接受外源DNA的能力，且胚状体多为单细胞起源，是理想的基因转化感受态细胞。目前有关香石竹体细胞胚报道非常少。1998年，Yantcheva等利用叶片作外植体通过直接体细胞胚途径获得香石竹再生芽，经过胚诱导、胚发育、胚成熟和胚生根4个阶段获得再生植株。三、相关知识香石竹（Dianthus caryophyllus L.），别名康乃馨，又名狮头石竹、麝香石竹、大花石竹、荷兰石竹，石竹科石竹属多年生宿根草本花卉。花色鲜艳，花期长，产量高，市场需求量很大。长期的大田扦插繁殖造成病毒侵染与积累，严重影响切花的商品价值。通过组织培养方法繁育香石竹，有快速、复壮、脱毒的效果，可使香石竹的切花产量和质量有较大幅度的提高。（一）形态特征和生物学习性香石竹是常绿亚灌木，作多年生宿根花卉栽培。因花瓣具繸缘及香郁气味，而广受栽培（现代香石竹已少有香气）。一般分为花坛康乃馨与花店康乃馨两类；茎丛生，质坚硬，灰绿色，节膨大，高度约50。叶厚线形，对生。茎叶与中国石竹相似而较粗壮，被有白粉。花大，具芳香，单生、23朵簇生或成聚伞花序；萼下有菱状卵形小苞片四枚，先端短尖，长约萼筒四分之一；萼筒绿色，五裂；花瓣不规则，边缘有齿，单瓣或重瓣，有红色、粉色、黄色、白色等色。花期4月至9月，保护地栽培四季开花。喜阴凉干燥，阳光充足与通风良好的生态环境。耐寒性好，耐热性较差，最适生长温度1421，温度超过27或低于14时，植株生长缓慢。宜栽植于富含腐殖质，排水良好的石灰质土壤。喜肥。 喜凉爽和阳光充足环境，不耐炎热、干燥和低温。宜栽植在富含腐殖质，排水良好的石灰质土壤里，花期4月至9月，保护地栽培四季开花。 康乃馨是优异的切花品种，花色娇艳，有芳香，花期长，适用于各种插花需求，常与唐菖蒲、天门冬、蕨类组成优美的花束。 喜好强光是康乃馨的重要特性。无论室内越科、盆栽越夏还是温室促成栽培，都需要充足的光照，都应该放在直射光照射的向阳位置上。(二)香石竹的组织培养香石竹组织培养流程如图10-2-1所示。热处理病毒检测微茎尖培养继代增殖移入大田驯化移栽生根培养丛生芽壮苗培养图10-2-1香石竹组培工艺流程1取材与消毒 选取生长健壮的植株栽在花盆中，待成活生长旺盛后，放人恒温光照培养箱内，在3638的温度下热处理一个月，切取带顶芽的茎段约2cm左右，在实验室内用自来水流水冲洗约30 min，用纱布吸干水分，然后在超净工作台上，去其大的叶片，只留未展开的小叶，用70酒精消毒3060s，迅速倒去酒精，用无菌水冲洗1次后，加入0.1HgCl2消毒8 min，再用无菌水冲洗56次，备用。2茎尖剥离与接种在超净工作台上，将灭菌的茎段在双筒解剖显微镜(2025倍)下进行茎尖剥离。具体做法是：将事先灭菌的培养皿置于解剖镜下，将解剖刀及解剖针在酒精灯火焰上灼烧至红，无菌水冷却后，在培养皿内剥离茎尖，使生长锥露出，切取0.30.4 mm带13个叶原基的茎尖，迅速接种到培养基上。注意，每个茎尖用一个培养皿，每切一个茎尖应灼烧解剖工具，并避免损伤茎尖。3培养基及培养条件 将上述茎尖接种在MS+0.2mgLNAA+2.0 mgL6-BA的培养基上，培养温度25左右，光照强度10001500Lx，每天光照1214h，经一周后茎尖开始生长，一个月后长出芽。待芽长大后，将这些无根试管苗不断转接，每月可增殖一代4再生芽的玻璃化苗现象及其克服措施 在香石竹快速繁殖特别是在继代增殖培养阶段，由于培养基中6-BA浓度较高(13 mgL)时，苗生长迅速，此时，若培养室内温度较高，光照不足，很容易使所增殖的苗形成水渍状半透明的玻璃化苗，这些苗难以诱导生根，移栽不能成活。可用以下措施克服玻璃化苗的形成：适当降低培养温度，改为22下培养。增加光照强度(2500Lx以上)和延长光照时间(1618hd)，甚至采用连续光照。适当降低6-BA浓度，使增殖率控制在56倍左右。增加培养基中碳源浓度(蔗糖34)。以上措施的综合处理，虽不能完全消除香石竹幼芽快速繁殖过程中的玻璃化苗现象，但可以降低其频率，较大幅度减少玻璃化苗的形成。如图10-2-2、10-2-3所示.图10-2-2外观异常玻璃苗 10-2-3外观基本正常玻璃苗5壮苗与生根培养在香石竹的快速增殖培养中，由于增殖速度快，所获得的再生苗纤细柔软，需经过壮苗培养，获得健壮的再生苗才能诱导生根和移栽。把苗培育在12MS+0.1mgL6-BA+0.05mgLNAA培养基上，再生苗生长缓慢，但茎明显增粗，叶片变厚，叶色变成深绿色。用这类再生苗进行生根，移栽的成活率高。上切下，转入12MS不加激素的固体培养基上就可以顺利诱导生根。另外，在培养基中加入少量的活性炭对生根有利。6炼苗与移栽当试管苗达到35cm高时，连培养瓶搬到温室内炼苗23d，然后揭开瓶盖继续炼苗23d。移栽时，将苗从瓶中取出，细心洗去附于根上的培养基，栽植于透气性良好的蛭石粉或河沙中，温室温度控制在2428，相对湿度90左右，光线太强时需要遮阴，2周左右即可成活。成活率在90以上。四、组织实施1.了解香石竹的生物学特性，熟悉香石竹组织培养程序。2.准备好组培物品。进行小组分工，明确工作任务和任务要求。3.在教师指导下各小组对用正确的方法对外植体进行选择，在接种和封口时要求操作规范、速度快、质量好。4.各小组对诱导芽分化诱导过程中出现的情况及时总结，尽可能消除香石竹幼芽快速繁殖过程中的玻璃化苗现象。5.各小组注意观察香石竹试管苗的生根与诱导情况，并相互检查，认真总结。6.教师结合各小组的任务完成情况，对设计方案及实施过程的进行客观评价，并提出合理化的建议。7.将组培苗移栽的育苗室，并加强对各组的栽培苗驯化锻炼的指导。五、评价与考核项目内 容要 求赋分计划制定1.查阅香石竹组培资料。准备培养基。2.各小组分工情况熟悉香石竹组织培养的基本过程,了解影响香石竹组织培养的各种因素；培养基配制操作规范、准确，小组分工明确，责任到位10物品准备常用药剂、三角瓶、封口膜、线绳、香石竹组培苗和超净工作台等。根据香石竹组织培养要求物品准备到位。10培养材料采集采取香石竹组培需要的材料。培养材料准备到位。10培养材料灭菌准备带顶芽的茎段。要求灭菌药剂浓度准确，灭菌时间适当，操作规范，灭菌彻底。10制备外植体将已消毒的材料在无菌条件下制备外植体。外植体选择恰当，消毒彻底；微茎尖剥离准确，操作规范细致；接种操作规范、速度快、质量好，独立完成。10接种和培养1.接种：将切好的外植体立即接在培养基上。接种操作规范、速度快、质量好，独立完成。102.封口：接种后，瓶、管、培养皿及时封口。操作方法正确。53.增殖：做好诱导和继代培养控制好环境条件，能独立完成。154.根的诱导：采用试管生根或无根嫩茎直接插植到基质中生根法。做好培养基和培养基质的处理。10炼苗移栽做好炼苗和移栽工作。注意水分管理和空气湿度。注意幼苗较嫩，防止弄伤。5现场整理清洁操作台、还原药品及用具，整理工作环境。要求整理到位，培养良好的工作习惯和职业情操。5知识拓展一脱毒苗的鉴定(1)病毒症状观察法：对于非潜隐性病毒，通过直观检测法就能观察有无病毒病症状。细致的从试管苗开始，直到生长中期、开花期的整个生长发育过程不断观察记录，凡出现花叶、坏死、退绿、明脉、萎缩、花朵褪色及碎色等症状，都作为带毒苗论处，并在此基础上作进一步的鉴定。 (2)指示植物鉴定法：是指利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的标准，又称为枯斑法。这些对病毒敏感并能产生专一性枯斑症状的植物称为指示植物，又称为鉴别寄主。一般用苋色藜、茴藜、石竹和高雪轮等植物作为香石竹病毒的鉴定指示植物。接种方法是从待鉴的香石竹上取下未老化叶片13g置于研钵中，加入10ml水和等量的0.1molL的磷酸缓冲液(pH7.0)，研碎后用双层纱布滤去残渣，再加入少量500600目金刚砂作为摩擦剂，制成汁液，用纱布或棉球蘸取汁液在指示植物叶片上轻轻涂抹23次，以汁液进入叶表皮细胞又不损伤叶片为度，或用喷枪喷射进行接种。5min后用清水清洗叶面多余汁液及金刚砂。接种后将指示植株置于室内或防虫网室内，在半遮阴、温度2025的条件下培养，一周后可视其病症的有无，来判断被鉴定植物是否脱毒。如指示植物出现枯斑或花叶等症状说明香石竹带病毒。利用指示植物法鉴定时，一般以早春为宜，因为早春刚萌发嫩叶或花瓣，接种成功率较高，5月份以后接种较难成功，从而影响检测结果的正确性。(3)病理解剖鉴定法：将香石竹的叶片作临时切片，切下的薄片立即放在盛水的培养皿中。然后挑选出较理想的切片作为临时水封片，放在显微镜下观察。结果是，香石竹的健康叶，叶肉组织的分化状况基本上是等面的，背腹两面都有明显的栅栏组织，细胞比较长，同时维管束不发达。在病叶的切片中可以看到栅栏组织不明显，叶肉均分化为短小的细胞，维管束中细胞变得非常大。有的病叶还有局部坏死现象，叶表皮内陷，叶肉细胞萎缩死亡。病叶维管束间韧皮部的筛管和薄壁细胞也有坏死现象，并表现有丹宁等胶质物积累。 (4)酶联免疫吸附测定法(ELISA法)：将酶与抗体(或抗原)结合，制成酶标抗体(或抗原)，将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。此法灵敏度高，特异性强，是抗血清鉴定法中发展最迅速、应用最广泛的方法。但也存在缺点：抗体制备所需时间长，费时费力。一次只能检测一种病毒，检测多种病毒时灵敏度低。经常存在假阳性反应，给脱毒苗检测带来困难。 (5)开花鉴定：此法是测定花的产量和质量，观察花朵与原种比较是否发生了退化、变异等现象。主要观察花朵大小、花色、茎高、裂苞等情况。10.3任务三 非洲菊组织培养技术学习目标1.掌握非洲菊组织培养的基本知识。 2.熟悉非洲菊的组织培养流程。3.了解非洲菊脱毒苗的鉴定方法。任务要求1.能独立完成非洲菊组培培养基的配置。2.能熟练非洲菊组织培养的基本操作。3.具备非洲菊工厂化育苗的基本技术。 一、任务提出 教师通过向学生展示非洲菊不同生长与分化阶段的试管苗和商品苗，激发学生学习兴趣，提出学习任务：1.非洲菊的生物学习性有哪些特点？2.非洲菊组织培养中的外植体如何选取？3.非洲菊组织培养中的花蕾灭菌中应注意哪些技术？4.非洲菊组织培养常用的初代培养应注意什么?5.如何克服非洲菊继代培养阶段玻璃化试管苗现象？6.要提高非洲菊试管苗驯化移栽成活率，在生根和移栽阶段应注意哪些技术措施？二、任务分析目前研究者已经从花萼、花托、花梗、试管苗叶片、茎尖等多种外植体上获得了再生植株。根据多年的生产实践，非洲菊组织培养的瓶颈依然是外植体的生长与分化，因为非洲菊无论用哪种外植体进行诱导其难度都比较大，如果直接用茎尖培养，其茎尖绒毛很多，消毒困难，很难获得无菌培养体系；另一方面采用花萼、花托、花梗为外植体，诱导不定芽产生，必须先经过愈伤组织诱导途径，然后再进行不定芽再生，这一过程时间长、难度大，再生比例低，根据不同品种一般需要16个月，而且在转接继代的过程中，极易引起外植体的死亡。学者研究表明在各种不同的外植体中，以幼花托为外植体是最为成功和有效的。三、相关知识非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）是菊科（Asteraceae）大丁草属（Gerbera- Cass）多年生宿根草本花卉，别名扶郎花，灯盏花、秋英、波斯花、千日菊，与唐菖蒲、康乃馨、月季、菊花同称世界五大切花。原产非洲南部，我国于20世纪80年代开始引种，但栽培品种完全由国外引进，极大地制约了非洲菊作为第五大切花在我国的发展。非洲菊传统的繁殖方法是种子繁殖和分株繁殖。种子繁殖过程中由于雌雄蕊成熟期不一致，且雌蕊雄蕊生长高度不同等因素造成白花不孕，必须辅以人工授粉，种子寿命很短，发芽率低，且大丁草属的资源在国外，传统的杂交育种方法受到限制。分株繁殖受季节限制，繁殖系数低，难以满足工厂化生产，且长期的无性繁殖会造成病毒积累，病虫害交叉感染，导致种性退化，花的商品质量下降。我国非洲菊早在20年代就有栽培。1987年我国科研人员解决了非洲菊的组织培养的快繁技术，使我国的非洲菊生产得到发展。（一）形态特征和生物学习性非洲菊一般株高5060cm。全株具细毛叶片基生，竖直向上或斜生，其形状随植株的生长而发生变化，从小到大由椭圆形变为长椭圆形，叶片长1525cm，宽58cm，羽状浅裂或深裂，叶背具细绒毛。花由舌状花和管状花组成单生头状花序，花序顶生。舌状花较大，着生于花序的边缘，排列成一轮或数轮，从而形成单瓣或重瓣花型。非洲菊性喜冬季温和，夏季凉爽的气候条件。最适生长温度为2025，最低12，最高不超过30。四季有花，以45月和810月为盛花期，低于10则进入体眠期。喜阳光充足的环境，每天日照时数不低于12h，能提高植株的切花率，使花朵色彩更鲜艳。土壤要求有机质丰富、排水良好、pH值为66.5的微酸性壤土，在盐碱化严重的土壤中难以生长良好。(二)非洲菊的组织培养非洲菊组培工艺流程如图10-3-1所示。花托、茎尖分化花芽诱导愈伤组织继代增殖移入大田驯化移栽生根培养图10-3-1非洲菊组培工艺流程1.外植体选择与消毒首先要选择花大、花色艳丽、市场受欢迎的品种，然后再选择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良单株进行取材。一旦选出优良单株后，应进行挂牌标记，并一直在其上采取花蕾。作为外植体的花蕾要选直径在0.51.0cm，而且未露心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果。将小花蕾在自来水下冲洗干净，然后到超净工作台上用70酒精浸泡20 s，再用0.1升汞附加0.5吐温-20处理1015min，并不断摇动瓶子，以使消毒剂与幼花托充分接触，最后用无菌水冲洗4次。在无菌条件下，将幼花托的萼片及表面小花全部剥除，并切割成0.20.3cm见方的块状，也可放人稀释的Vc溶液中浸泡12min，减少褐变造成的死亡，再接种于诱导培养基中。2.初代培养初代培养基为MS+BA2.0mgL+NAA0.2mgL若在最初的23d的时间里选择暗培养，然后在正常的培养条件下进行培养，将减少外植体的褐变死亡。接种710d后开始膨大，并在外植体表面产生黄白色愈伤组织。15 d后，多数愈伤组织逐渐转为绿色，将绿色的愈伤组织块分切成小块，接种到MS或12MS+Ba l.05.0mgL+NAA0.20.5mgL诱导不定芽的培养基中。根据品种的不同，部分品种可在1个月后分化出不定芽，多数品种要经过不断转接35个月后才会出芽，有少数品种甚至经过半年的不断转接和培养，仍然没有不定芽分化的迹象。由于整个诱导过程长而复杂，在培养过程中会因培养基和环境条件稍有不适，而出现花芽和愈伤组织褐变死亡和污染，最终导致组培失败。3.继代培养由于从花托上分化出不定芽的几率比较小，一旦有芽从花托上产生，就要及时从花托上分割下来转移到MS+BA0.21.0mgL+NAA0.050.1mgL继代培养基中进行快速扩繁。最初的几代中，由于基数较少，可使