天然药物化学第五章 黄酮类化合物ppt课件.ppt

第五章 黄酮类化合物,Flavonoids,学习要点：,掌握黄酮类化合物的基本定义和分类；掌握黄酮类化合物的理化性质，各种鉴别反应；掌握黄酮类化合物的结构鉴定方法；熟悉黄酮类化合物的结构类型，提取分离方法；了解黄酮类化合物的生物合成途径和生物活性,概 述,1,黄酮类化合物的理化性质与显色反应,2,3,黄酮类化合物的提取和分离,4,黄酮类化合物的鉴定与结构测定,5,本章内容,第一节 概述,黄酮类化合物是一类重要的含氧杂环天然有机化合物，在植物界和中草药中分布广泛。 多存在于高等植物及蕨类植物中； 苔藓类植物中所含黄酮类化合物较少； 藻类、微生物、海洋生物中很少发现黄酮类化合物。多数黄酮类化合物是羟基衍生物，有的带有甲氧基或其它取代基。此类化合物多与糖结合成苷，少部分以游离形式存在。,一、基本结构和分类,第一节 概述,1952年以前，黄酮类化合物(flavonoids)主要是指基本母核2-苯基色原酮(2-phenyl-chromone)类化合物。,色原酮,2-苯基色原酮,现在则是泛指两个苯环（A-环与B-环）通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。具有C6-C3-C6结构。,第一节 概述,一、基本结构和生物合成,黄酮的基本骨架是由三个丙二酰辅酶A和一个桂皮酰辅酶A生物合成而产生的。A环来自于三个丙二酰辅酶A，而B环则来自于桂皮酰辅酶A。,C6-C3-C6,二、黄酮类化合物结构和分类,分类标准：根据中央三碳链的差异 C环开环，称查耳酮(chalcone) 五元环，橙酮B环连在C3位，称为异黄酮(isoflavone)C2，C3饱和，加“二氢”，二氢黄酮(flavanone) C3-位有无-OH，有，黄酮醇(flavonol) 无，黄酮(flavonol),A,B,C,C=O还原，称为黄烷类,黄烷-3-醇R = H,黄烷-3,4-二醇R = OH,其他类型： 花色素类、 酮类、双黄酮类、高异黄酮类,A,B,C,二、黄酮类化合物的结构和分类,木犀草素，抗菌作用,黄芩苷，清热解毒,槲皮素：R = H芦 丁：R = 芸香糖最常见的黄酮醇类化合物,黄酮类 flavones,黄酮醇类 flavonols,黄酮黄酮醇,二、黄酮类化合物的结构和分类,二氢黄酮类 flavanones,二氢黄酮醇类flavanonols,橙皮苷 Vp样作用,甘草素 对溃疡有抑制作用,水飞蓟素 保肝作用,二氢黄酮二氢黄酮醇,二、黄酮类化合物的结构和分类,异黄酮类 isoflavones,二氢异黄酮类isoflavanones,大豆异黄酮,鱼藤酮 毒鱼 农业杀虫剂,异黄酮二氢异黄酮,大豆异黄酮,流行病学资料表明，长期食用大豆的东南亚人群中，癌症、动脉粥样硬化等心血管病症的发病率明显低于西方。在日本，乳腺癌的发病率是美国的1/4；妇女更年期综合症的发病率只有美国的1/3；这个现象已引起科学家的注意。大豆中含有一种结构与雌激素相似的物质叫异黄酮，它是大豆中的一种非营养份，具有生理活性，能产生类似雌激素的效应，而被称之为“植物雌激素”。对身体雌激素的双向调节作用。当人体内雌激素水平低时，大豆异黄酮占据雌激素受体，发挥弱雌激素效应，表现出提高雌激素水平的作用。当人体内雌激素水平高时，大豆异黄酮以“竞争”方式占据受体位置，同样发挥弱雌激素效应，但由于它的活性仅为体内雌激素的2%，因而从总体上表现出降低体内雌激素水平的作用，这就是著名的大豆异黄酮对雌激素的双向调节作用机制。,对身体雌激素的双向调节作用 抗癌作用 降低胆固醇，预防动脉硬化 改善骨质疏松 预防冠心病 美国的食品药物管理局（FDA）把大豆列为能够“真正降低心脏病危险的食品”之一,大豆异黄酮,二、黄酮类化合物的结构和分类,查耳酮类 chalcones,橙酮类 aurones,较少见黄花波斯菊花：硫黄菊素,查耳酮橙酮,红花的颜色变化,二、黄酮类化合物的结构和分类,花色素类anthocyanidins,黄烷醇类,矢车菊素：R1 = OH, R2 = H飞燕草素：R1 = R2 = OH天竺葵素：R1 = R2 = H锦葵花素：R1 = R2 = OCH3,黄烷-3-醇R = H,黄烷-3,4-二醇R = OH,儿茶素：抗癌活性,麻黄宁A/B：抗癌活性,花色素黄烷醇,黄烷-3-醇R = H,黄烷-3,4-二醇R = OH,二、黄酮类化合物的结构和分类,苯骈色原酮类xanthones,苯色原酮类,异芒果苷：止咳祛痰芒果叶和知母叶,呋喃色原酮类,凯林khellin,红 镰 枚 素： R1 = CH3, R2 = H去甲红镰枚素： R1 = R2 = H红镰枚素-6-龙胆双糖苷： R1 = CH3, R2 = 龙胆双糖基,其他黄酮类,黄酮苷元 取代基：OH，OMe，Me，异戊烯基等黄酮苷 O-苷和C-苷,存在形式,二、黄酮类化合物的结构和分类,二、黄酮类化合物的结构和分类,天然黄酮类化合物多以苷类形式存在。由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同，组成各种各样的黄酮苷。组成苷类的糖有：单糖：D-glc、D-gal、D-xyl、L-rha、L-ara、 D-glucuronic acid双糖：槐糖（glc 1- 2glc), 芸香糖（rha1-6glc)等。三糖：龙胆三糖（glc 1-6glc 1 2 fru) 槐三糖（glc 1-2 glc 1-2glc),黄酮苷,二、黄酮类化合物的结构和分类,氧苷,碳苷,黄酮,异黄酮,二、黄酮类化合物的结构和分类,黄芩苷,大豆苷,牡荆素,葛根素,黄酮苷,三、黄酮类化合物的生理活性,（一）对心血管系统的作用 1、降低血管脆性及异常的通透性 芦丁、橙皮苷 2、扩冠作用 如：槲皮素、葛根素 3、降低血脂及胆固醇的作用（二）有抗肝脏毒活性 如：水飞蓟素、儿茶素（三）抗炎作用 如：芦丁、羟乙基芦丁、 橙皮苷-甲基查尔酮（四）雌激素样作用 如：染料木素、大豆素等,三、黄酮类化合物的生理活性,（五）抗菌作用 如：木犀草素、黄芩素、黄芩苷（六）抗病毒作用 如：槲皮素、山柰酚等（七）泻下作用 如：营实苷A（八）解痉作用 如：异甘草素、大豆素等（九）其它作用 止咳、祛痰、平喘等作用,银杏黄酮,蜂胶中已发现的黄酮类化合物有70多种，比较重要的有20多种，其中重要的含量比较高的目前认为有8种：芸香苷（也称芦丁，含量0.6%1.0%）、槲黄素（也称槲皮素，含量0.5%1.8%）、高良姜素（含量1.1%1.9%）、杨梅素（也称杨梅酮，含量0.5%1.3%）、柯因（含量3.4%4.4%）、松属素（也称乔松素，含量1.7%2.8%）、山奈酚（也称茨菲醇，含量0.12%0.2%）、芹菜素（含量0.04%0.1%）。,蜂胶黄酮,蜂胶黄酮类化合物有多种医疗保健作用，主要有：抗氧化、抗癌作用、抗菌作用、抗病毒作用、降血脂作用、降血糖作用、免疫调节等作用，还有改善微循环、消炎、解痉、抗过敏、抗辐射等作用。,蜂胶黄酮,概 述,1,黄酮类化合物的理化性质与显色反应,2,3,黄酮类化合物的提取和分离,4,黄酮类化合物的鉴定与结构测定,5,本章内容,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,一、性状 黄酮类化合物多为晶状固体，少数（如黄酮苷类）为无定形粉末。 苷元中，二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇具有手性碳，具旋光性，其余黄酮类无旋光性。苷类结构中含糖的部分结构，故均有旋光性，且多为左旋。,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,二氢黄酮醇类(flavanonols),二氢黄酮类(flavanones),黄烷-3,4-二醇类 (flavan-3,4-diols),黄烷-3-醇类(flavan-3-ols),第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,黄酮类化合物是否有颜色 与分子中是否存在交叉共轭体系 助色团（-OH、-OCH3等）的数目 取代基的位置有关。 色原酮部分原本无色，但在2位引入苯环后，即形成交叉共轭体系，且通过电子的转移，重排，使共轭链延长，而表现出颜色。,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,黄酮、黄酮醇及苷类 灰黄-黄色 查耳酮 黄-橙黄色 二氢黄酮、二氢黄酮醇 无色 异黄酮 微黄色 其中，黄酮、黄酮醇及苷类、查耳酮等因分子中存在交叉共轭体系，在7, 4位引入-OH, OCH3等供电子基团则促进电子移位、重排，使化合物颜色加深。 花色素及其苷元的颜色随pH的不同而改变：呈现红（pH8.5）,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,二、溶解度,游离苷元难溶或不溶于水，易溶于MeOH, EtOH, EtOAc, Et2O等有机溶剂及稀碱液。 黄酮、黄酮醇及查耳酮是平面性分子，分子堆砌紧密，分子间引力较大，更难溶于水。 二氢黄酮、二氢黄酮醇是非平面性分子，分子排列不紧密，分子间引力降低，对水的溶解度较大。 花色苷元（花青素）类虽系平面型分子，但因以离子形式存在，具有盐的通性，故亲水性较强，水溶度较大。,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,二、溶解度,黄酮苷元引入羟基越多，水溶性越强，羟基甲基化后，则增加在有机溶剂中的溶解度。 黄酮类化合物的羟基苷化后，水溶性相应增大，而在有机溶剂中的溶解度相应减小。黄酮苷一般易溶于H2O, MeOH, EtOH等，难溶或不溶于苯，氯仿等。糖链越长，则水溶性越大。,三、酸碱性,（1）酸性 多具有酚羟基，故显酸性，酚羟基数目不同及位置不同，酸性强弱也不同。7,4-OH 7-或4-OH 一般酚OH 5-OH 3-OH,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,（2）碱性,吡喃环上的1-氧原子，因有未共用的电子对，故表现微弱的碱性。可与强酸成不稳定的烊盐。,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,黄酮类化合物溶于浓硫酸中生成的烊盐常表性特殊的颜色，可用于鉴别。,四、显色反应,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,颜色反应多与分子中的酚羟基及-吡喃酮环有关。,（一）还原试验1. 盐酸-镁粉（或锌粉）反应 为鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应。黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物显橙红紫红色，少数显紫蓝色。B环有-OH或-OCH3取代颜色加深。,花色素及部分查耳酮、橙酮等在浓盐酸酸性条件下也会发生色变，故须先做一对照。,四、显色反应,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,2. 四氢硼钠（钾）反应 NaBH4 选择性还原二氢黄酮类化合物。与二氢黄酮类化合物产生红紫色。与其他黄酮化合物不显色，可用于区别。,（一）还原试验,另外，二氢黄酮还可与磷钼酸试剂反应呈现棕褐色，也可作为二氢黄酮类化合物的特征鉴别反应。,四、显色反应,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,(二)金属盐类试剂的络合反应,黄酮类化合物分子结构中多有3-OH, 4=O; 5-OH, 4=O; 邻二酚羟基，常可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐等试剂生成有色络合物。,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,四、显色反应,(二)金属盐类试剂的络合反应,1. 铝盐 常用1%AlCl3或Al(NO2)3试剂，生成络合物为黄色(max=415nm)，并有荧光，可用于定性及定量分析。,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,四、显色反应,(二)金属盐类试剂的络合反应,2.铅盐 常用1%PbAc2或碱式醋酸铅水液。生成黄-红色沉淀。 醋酸铅可沉淀具有邻二酚羟基或兼有3-OH, 4-酮或5-OH, 4-酮结构的化合物。(鲜黄橙) 碱式醋酸铅可沉淀具有一般酚类化合物。,可用于鉴定，也可用于提取及分离工作。,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,四、显色反应,3. 锆盐 多用2%氯氧化锆甲醇溶液。,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,四、显色反应,5.氯化锶（SrCl2）,常用醋酸镁钾溶液为显色剂，二氢黄酮(醇)类可显天蓝色荧光，黄酮(醇)及异黄酮类等则显黄橙黄褐色。,4.镁盐,在氨性甲醇溶液中，可与分子中具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物生成绿色棕色乃至黑色沉淀。,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,四、显色反应,6. 三氯化铁(FeCl3)反应 检查酚羟基。多数黄酮类化合物具有酚羟基，可产生阳性反应，一般在含有氢键缔合的酚羟基时，呈现明显颜色。,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,四、显色反应,(三) 硼酸显色反应,条件：1 具有下列结构（5-羟基黄酮，2-羟基查耳酮），可生成亮黄色。 2 有无机酸或有机酸存在 在草酸存在下，显黄色并带绿色荧光；在枸橼酸丙酮存在条件下，只显黄色而无荧光。,（四）碱性试剂显色反应,日光及紫外光下，通过纸斑反应，观察样品用碱性试剂处理后的色变情况。 1. 二氢黄酮类易在碱液中开环，转变成相应异构体查耳酮类化合物，显橙-黄色。,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,四、显色反应,（四）碱性试剂显色反应,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,四、显色反应,2、黄酮醇类在碱性中先呈黄色，通入空气后变为棕色，据此可与其它黄酮类区别。,3、黄酮有邻二酚羟基或3，4-二羟基，易被氧化，由黄色深红色绿棕色沉淀。,五、Wessely-Moser重排,第二节 黄酮类化合物的理化性质及显色反应,主要指黄酮类6-C-糖苷和8-C-糖苷在常规酸水解条件下不能被水解，但可发生互变，生成6-C-糖苷和8-C-糖苷的混合物。所以在解析该类苷的结构时尽量避免用酸水解方法。,第三节 黄酮类化合物的提取于分离,一、提取 黄酮类化合物在花、叶、果等组织中，多以苷的形式存在； 在木部坚硬组织中，多以游离苷元形式存在； 根据化合物极性不同，溶解性不同，采用不同溶剂提取。,第三节 黄酮类化合物的提取于分离,一、提取 1. 苷元,多用CHCl3、Et2O、EtOAc等极性较小溶剂提取； 对于多OCH3化的成分，用苯、石油醚提取； 对于极性大的成分，如查耳酮、橙酮、双黄酮、羟基黄酮等，用EtOAc、EtOH、Me2CO、MeOH:H2O(1:1)等溶剂提取。,2. 苷类 水或热水提取，（多糖苷在热水中溶解度较大，在冷水中溶解度较小）； 也可用EtOH、MeOH、EtOAc提取。 3. 含羟基的苷或苷元，可用碱水提取。 4. 提取花青素类可加入少量酸，但一般黄酮类化合物则应避免。,第三节 黄酮类化合物的提取于分离,二、粗提物的精制处理,第三节 黄酮类化合物的提取于分离,1 溶剂萃取法 石油醚：除去叶绿素、胡罗卜素等脂溶性色素 水溶醇沉：除去蛋白质、多糖、大分子水溶性物质 逆流分配：水-乙酸乙酯，正丁醇-石油醚 在萃取除杂的同时，可使不同极性或极性相差较大者分离，如极性不同的苷和苷元，极性苷元和非极性苷元。,2碱提取酸沉淀法,黄酮苷类可溶于水，难溶于酸性水，易溶于碱性水，故可以用碱性水提取，再将碱水提取液酸化，黄酮苷类沉淀析出。适用于含酚羟基的化合物，如槐米中芦丁的提取。注意事项： 酸碱度不宜过大 邻二酚羟基的保护：碱性条件下，邻二酚羟基易被氧化，加硼砂保护 石灰乳的加入可除去果胶、粘液等水溶性酸性杂质,第三节 黄酮类化合物的提取于分离,适用于苷类的精制工作。植物的甲醇提取液加活性炭至吸附完全，过滤得吸附苷的活性炭粉末。依次用沸水、沸甲醇、7%酚/水、15%酚/醇洗脱，分步收集、检查、合并。大部分苷类可用7%酚/水洗下，经减压浓缩至小体积，乙醚除酚，余下水层经减压浓缩得较纯黄酮苷。,3 炭粉吸附法,第三节 黄酮类化合物的提取于分离,三、分离,第三节 黄酮类化合物的提取于分离,依据黄酮类化合物极性不同、酚羟基数目和位置不同以及分子量和酸碱性不同，可分别采用不同柱色谱和PH梯度萃取法。 （一）柱层析法 分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉等。此外，也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土等。,1. 硅胶柱层析：此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化（或乙酰化）的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。吸附规律：极性大吸附牢。如：A 苷元 B 单糖苷 C 二糖苷Rf :ABC,三、分离,第三节 黄酮类化合物的提取于分离,（一）柱层析法,2. 聚酰胺柱层析：其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。 聚酰胺柱层析可用于分离各种类型的黄酮类化合物，包括苷及苷元、查耳酮与二氢黄酮等。黄酮类化合物从聚酰胺柱上洗脱时大体有下列规律：（以下规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层上的行为。）,第三节 黄酮类化合物的提取于分离,三、分离,（一）柱层析法,黄酮类化合物从聚酰胺柱洗脱时有下列规律：,苷元相同，洗脱先后顺序一般为： 三糖苷双糖苷单糖苷苷元母核上增加羟基，洗脱速度相应减慢 羟基位置的影响：具有邻位羟基黄酮具有对位（或间位）羟基黄酮不同类型的黄酮类化合物，先后流出顺序一般是： 异黄酮二氢黄酮醇黄酮黄酮醇分子中芳香核、共轭双键多者吸附力强，故查耳酮往往较相应的二氢黄酮难于洗脱。,三、用聚酰胺柱色谱分离下述化合物, 以不同浓度的甲醇进行洗脱, 其出柱先后顺序为?,(C )(A )(D )( B ),三、分离,第三节 黄酮类化合物的提取于分离,（一）柱层析法,主要用两种型号的凝胶 Sephadex-G和Sephadex-LH20 分离游离黄酮主要是吸附作用，极性小大洗脱。 分离黄酮苷类，主要是分子筛作用，分子大小洗脱。 总的洗脱顺序：糖多的苷糖少的苷游离苷元（极性小大） 常用洗脱剂：碱性水溶液，含盐水溶液 醇及含水醇 含水丙酮，甲醇氯仿,3. 葡聚糖疑胶(Sephadex gel)柱层析：,第三节 黄酮类化合物的提取于分离,（二）梯度pH萃取法,适合于酸性强弱不同的黄酮苷元的分离。根据黄酮类苷元酚羟基数目及位置不同其酸性强弱也不同的性质，可以将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）后，依次用5%NaHCO3、5%Na2CO3、0.2%NaOH及4%NaOH水溶液萃取，来达到分离的目的。酸性：7，4-二OH 7-或4-OH 一般酚OH 5-OH黄酮溶于：5%NaHCO3液 5%Na2CO3液 0.2%NaOH液 4%NaOH液,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,目前主要采用的方法有：与标准品或与文献对照PC或TLC得到的Rf或hRf值（Rf100）分析对比样品在甲醇溶液中及加入酸、碱或金属盐类试剂后得到的UV光谱1H-NMR 13C-NMR MS,一、色谱法在黄酮类鉴定中的作用,1. 纸色谱(PPC) 苷类成分可采用双向展开，第一相展开采用醇性溶剂，如BAW系统（正丁醇： 醋酸：水4：1：5上层）；第二相展开用水性溶剂，如2%6%HOAc、3% NaCl等。 苷元则多采用醇性溶剂。 花色苷及其苷元，可用含盐酸或醋酸的溶剂。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,一、色谱法在黄酮类鉴定中的作用,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,纸色谱中Rf值与结构的关系：,1、水溶性溶剂展开时，平面型分子(黄酮、黄酮醇、查耳酮)几乎在原点不动，非平面型分子(二氢黄酮、二氢查耳酮)Rf值较大。2、醇性展开剂时，同一类型苷元，羟基越多， Rf值越小；羟基被甲氧基取代， Rf值增大；羟基糖苷化，极性增大， Rf值下降。,2. 硅胶薄层色谱,用于分离鉴定弱极性黄酮类化合物较好。 常用展开剂甲苯：甲酸甲酯：甲酸（5：4：1）；苯：甲醇(95: 5)或苯：甲醇：冰醋酸（35：5：5）等。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,3. 聚酰胺薄层色谱,适用范围广，可分离含游离酚羟基的黄酮及其苷类。 常用展开系统：乙醇：水（3：2）；丙酮：水（1：1）等。 显色剂：紫外光；2%三氯化铝甲醇液； 1%FeCl3 /1%K3Fe(CN)6(1:1)混合液。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,可用于确定黄酮母核类型及确定某些位置是否含有羟基。 一般程序： 测定样品在甲醇中的UV谱以了解母核类型； 在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂(甲醇钠、乙酸钠等)后测UV谱和可见光谱以了解3, 5, 7, 3, 4有无羟基及邻二酚羟基； 苷类可水解后（或先甲基化再水解），再用上法测苷元的UV谱以了解糖的连接位置。,二、紫外光谱在黄酮类鉴定中的应用,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,二、紫外光谱在黄酮类鉴定中的应用,（一）黄酮类化合物在甲醇溶液中的紫外光谱,多数黄酮类化合物由两个主要吸收带组成： 带I在300-400nm区间，由B环桂皮酰系统的电子跃迁所引起；,带II在220-280nm区间，由A环苯甲酰系统的电子跃迁所引起。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,不同类型黄酮类化合物的紫外光谱,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,（二）加入诊断试剂后引起的位移及结构测定,二、紫外光谱在黄酮类鉴定中的应用,以黄酮及黄酮醇为例进行说明：,B环上有邻二酚OH时，带在AlCl3中较AlCl3/HCl中红移约3040nm。当A环和B环上均有邻二酚OH时，在上述位移基础上再增加2025nm。,三、核磁共振氢谱在黄酮类结构解析中应用,常用溶剂：氘代氯仿（CDCl3），氘代二甲基亚砜（DMSO-d6），氘代吡啶（C5D5N）。也可将黄酮类化合物作成三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中进行测定。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,优点：无干扰信号，勿须昂贵的氘代试剂；供试后的样品用含水甲醇处理可回收；三甲基硅醚衍生物可很方便的转变成乙酰衍生物或甲醚衍生物。,（一）A环质子,15, 7-二OH黄酮类,三、核磁共振氢谱在黄酮类结构解析中应用,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,7-OH成苷后，H-6、H-8信号向低场位移,27-OH黄酮,H-5较H-6、H-8低场，是由于羰基的负屏蔽效应的影响。H-6、H-8较5, 7-二OH黄酮出现在低场，且相互位置可能颠倒。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,（二） B环质子 6.5-7.9,14-氧取代黄酮类化合物,H-3, 5 6.5-7.1, d, J=8.5HzH-2, 6 7.1-8.1, d, J=8.5Hz由于C环对H-2, 6的负屏蔽作用大于对H-3, 5, 且H-3, 5受4-OR的屏蔽作用，故前者较低场；C环氧化程度越高，H-2, 6处于越低场的位置。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,23, 4-二氧取代黄酮类化合物,H-2受C环负屏蔽和3-OR屏蔽作用，H-6 也受C环负屏蔽作用，而H-5则仅4-OR屏蔽作用。故由低场到高场的顺序为：H-6 H-2 H-5。但有时也会发生H-2和H-6重叠的现象。,（1）3, 4-二氧取代黄酮及黄酮醇H-5 6.7-7.1 d, J=8.5HzH-2 7.2 d, J=2.5HzH-6 7.9 dd, J=2.5, 8.5Hz,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,（2）3, 4-二氧取代异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇 H-2, 5, 6常作为一个复杂多重峰（通常为两组峰） 6.7-7.1,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,33, 4,5-三氧取代黄酮类化合物,若R1=R2=R3=H，则H-2, 6为单峰， 6.7-7.5若上述条件不成立，则H-2, 6分别为二重峰（J=2Hz）,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,（三） C环质子,1. 黄酮类,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,H-3常出现在6.3-6.8范围内，尖锐单峰。,2. 异黄酮类,H-2位于羰基位，且通过碳与氧相连，故较一般芳香质子低场, 7.6-7.8。若用DMSO-d6作溶剂，则8.5-8.7。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,3. 二氢黄酮和二氢黄酮醇,1) 二氢黄酮,两个H-3, 分别为dd峰，中心位于2.8 ，J = 17Hz(偕偶)，5Hz(顺偶)及J = 17Hz(偕偶)，11Hz(反偶),H-2, dd, 5.2, Jtrans = 11Hz(反偶), Jcis = 5Hz(顺偶),第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,（2）二氢黄酮醇,3-OH苷化，供电子能力下降，两个氢的值升高(向低场位移），可用于判断二氢黄酮醇苷中糖的位置。,H-2与H-3为反式双直键，J=11HzH-2 4.9H-3 4.3,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,4. 查耳酮,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,5.橙酮,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,（四）糖上的质子(自学),1. 单糖苷类 糖与苷元相连时，糖上C1-H与其它 H比较，一般位于较低磁场区。因-OR (R=苷元) 不表现供电子，仅表现吸电子的诱导作用，端基H受两个O的诱导，处于低场（4.0-6.0）,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,1）葡萄糖位于不同位置时端基H化学 位移的区别： C3-OR， C1-H的 值约为5.8； C-5, C-6, C-7, C-4-OR ， C1-H的 值约为4.8-5.2,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,2) 葡萄糖苷与鼠李糖苷的区别 黄酮醇3-O-葡萄糖苷端基H 5.8, d, J=7Hz （二直立键偶合系统） 黄酮醇3-O-鼠李糖苷端基H 5.0-5.1, d, J=2Hz （二平伏键偶合系统） 另外鼠李糖上的C-CH3: 0.8-1.2, d, J=6.5Hz,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,2. 双糖苷类 末端糖上的H-1因离黄酮母核较远，受到的负屏蔽作用较小，因而较H-1处于较高场的位置。（五） 其它质子 如6-及8-C-CH3，乙酰氧基质子，甲氧基质子。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,四、13C NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用,13C NMR信号归属的方法： 1）对比法：与简单的模型化合物如苯乙酮、桂皮酸及它们的衍生物光谱的比较； 2）计算法：用经验的简单芳香化合物的取代位移加和规律进行计算； 3）选用各种一维和二维NMR技术。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,（一）骨架类型的判断,根据中央三碳链的碳信号，即先根据羰基碳的值，再结合C2、C3的裂分和值判断。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,（二）黄酮类化合物取代图式的确定方法,黄酮类化合物中芳香碳原子的信号特征可以用来确定取代基的取代图式。以黄酮为例，其13C-NMR信号如下所示：,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,1取代基位移的影响,-OH及-OCH3的引入将使直接相连碳原子(-碳)信号大幅度地向低场位移，邻位碳原子(-碳)及对位碳则向高场位移。间位碳虽也向低场位移，但幅度很小。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,25，7-二羟基黄酮类中C-6及C-8信号的特征,对大多数5，7-二羟基黄酮类化合物来说，C-6(d)及C-8(d)信号在90.0100.0的范围内出现，且C-6信号总是比C-8信号出现在较低的磁场。在二氢黄酮中两者差别较小，约差0.9个化学位移单位，但在黄酮及黄酮醇中差别较大，约为4.8。C-6或C-8有无烷基或者芳香基取代可通过观察13C-NMR上C-6，C-8信号是否发生位移而加以认定。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,生松素(pinocembrin)及其6-C-甲基及8-C-甲基衍生物的C-6，C-8,(三)黄酮类化合物O-糖苷中糖的连接位置,1糖的苷化位移及端基碳的信号 酚性苷中，糖上端基碳的苷化位移约为+4.0+6.0。 黄酮苷类化合物当苷化位置在苷元的7或2、3、4时，糖的C-1信号将位于约100.0102.5范围内。 5-O-葡萄糖苷及7-O-鼠李糖苷相应的糖的C-1信号分别出现104.3及99.0处。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,2苷元的苷化位移,苷元糖苷化后与糖直接相连碳原子向高场位移，其邻位及对位碳原子则向低场位移，且对位碳原子的位移幅度大而且恒定。可用于判断黄酮类化合物O-糖苷中糖的连接位置。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,五、质谱在黄酮类结构测定中的应用,多数黄酮类化合物苷元在电子轰击质谱(El-MS)中因分子离子峰较强，往往成为基峰，故一般无须作成衍生物即可进行测定。 但是当测定极性强、难气化以及对热不稳定的黄酮苷类化合物时，则采用FD-MS和FAB-MS、ESI-MS等软电离质谱技术获得强的分子离子峰M+及具有偶数电子的准分子离子峰(quasi-molecularion peak) M+H +。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,(一)黄酮类化合物苷元的电子轰击质谱 (El-MS),黄酮类化合物苷元的El-MS: 分子离子峰M+ M-1+即(M-H)基峰 甲基化衍生物，则可以得到M-15+即(M-CH3)离子。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,黄酮类化合物主要有下列两种基本裂解途径：,途径-I（RDA裂解）：,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,途径-II,此外，还有分子离子M+.生成M-1+，M-28+.，(M-CO)；由A1生成A1-28+.，(A1-CO)及B2生成B2-28+，(B2-CO)等碎片离子。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,1黄酮类裂解基本规律：,5，7，4-三羟基黄酮（芹菜素）根据途径进行裂解得到A1+和B1+的离子片段分别为？,质谱裂解实例分析：,在质谱裂解中，A-环的取代图式可通过测定A1+.的m/z的值进行确定。同样，根据B-环碎片离子的m/z值，也可精确测定B环的取代情况。,A1+ 152,B1+ 118,黄酮在有四个以上氧取代基时，常常给出中等强度的A1及B1碎片，它具有重要的鉴定意义；黄酮醇则不然，当氧取代超过四个以上时，只能产生微弱的Al+.及Bl+.碎片离子。,2黄酮醇类质谱,多数黄酮醇苷元，分子离子峰是基峰，在裂解时主要按途径-进行，得到B2+离子，继续失去CO形成的B2-28+.离子。与途径相比，途径I通常不太主要。 其中，A+H+是来自A-环的主要离子，其上转移的H来自3-OR基团。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,黄酮醇全甲基化衍生物的质谱B2+离子: m/z105(B环无羟基取代)， 135(-OCH3，示B环有一个羟基)， 165(有两个-OCH3，示B环有两个羟基) 195(有三个-OCH3，示B环有三个羟基),(二)黄酮苷类化合物的FD-MS,黄酮苷类化合物在El-MS上既不显示分子离子峰，也不显示糖基的碎片，故不宜用 El-MS测定。 而FD-MS谱可给出强烈的M+及M+H+。还给出葡萄糖基的某些碎片，为化合物的结构鉴定提供了重要的信息。在FD-MS中，因为(M + 23Na)离子的强度随着溶剂极性及发射丝电流强度的改变而变化，可用以帮助区别分子离子峰(M)+及伪分子离子峰M+1+。,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,练习：,（1）流程中采用的提取方法与依据是什么？（2）提取液中加入0.4%硼砂水的目的？（3）以石灰乳调pH89的目的？如果pH12以上会造成什么结果？（4）酸化时加盐酸为什么控制pH在4-5？如果pH2以上会造成什么结果？（5）以热水或乙醇重结晶的依据？提取芸香苷还可以采用什么方法？,（1）流程中采用的提取方法是：碱提取酸沉淀法 依据：芸香苷显酸性可溶于碱水。（2）提取液中加入0.4%硼砂水的目的：硼砂可以与邻二羟基络合，保护邻二羟基不被氧化。（3）以石灰乳调pH89的目的：芸香苷含有7-OH，4-OH，酸性较强可以溶于pH89的碱水中。如果pH12以上，碱性太强，钙离子容易与羟基、羰基形成难溶于水的鳌合物，降低收率。（4）酸化时加盐酸为什么控制pH在4-5足以是芸香苷析出沉淀，如果pH2以上容易使芸香苷的醚键形成烊盐，不易析出沉淀。（5）以热水或乙醇重结晶的依据是：芸香苷在热水和热乙醇中溶解度较大，在冷水及冷乙醇中溶解度较小的原因。提取芸香苷还可以采用乙醇回流提取法。,