XXXXCB911000-G-蛋白质的生成、修饰与质量控制.docx

项目名称：蛋白质的生成、修饰与质量控制首席科学家：Sarah Perrett 中国科学院生物物理研究所起止年限：2012.1至2016.8依托部门：中国科学院一、关键科学问题及研究内容关键科学问题： 本项目的关键科学问题是：细胞如何实现对蛋白质合成、折叠、修复、降解及修饰不同环节的质量控制；在应激条件下蛋白质质量控制体系如何调控；蛋白质异常修饰对质量控制体系的影响及其相关疾病发生发展的机制等关键科学问题。重点研究蛋白质合成的精确控制机制；蛋白质折叠尤其是内质网和线粒体氧化折叠系统中关键蛋白的结构与功能及相互作用网络；分子伴侣在错误折叠蛋白的修复与降解中的作用；应激条件下质量控制体系中蛋白质的氧化还原修饰调控；蛋白质异常修饰在细胞及动物水平产生的影响。通过系统研究蛋白质质量控制体系不同环节关键蛋白的功能和相互关系，获得蛋白质质量控制分子机制的全景网络。 主要研究内容：本项目深入系统研究蛋白质生物合成的质量控制、蛋白质的氧化折叠与氧化还原修饰、蛋白质错误折叠及分子伴侣的作用、蛋白质的异常修饰与疾病的关系。系统开展蛋白质质量控制关键蛋白和相互作用网络研究，分析关键蛋白质或调控因子在蛋白质质量控制过程中的功能及在生理与病理状态下的动态变化，筛选对氧化折叠和质量控制具有调控功能的小分子化合物。探索环境因素诱导的蛋白质异常修饰与认知障碍之间的关系，开发试用于老年性痴呆症临床诊断的生物标记物。 1 蛋白质翻译的精确控制机制 研究亮氨酰-tRNA合成酶（LeuRS）对特异氨基酸及其对应的特异tRNA之间相互识别匹配的机制；鉴定依赖和非依赖tRNA的转移前编校发生的位点；tRNA的氨基酸接受臂（amino acid acceptor arm）在氨基酰化活性中心和编校活性中心之间的动态转位过程； tRNA关键核苷酸在氨基酰化反应、编校反应各步和蛋白质翻译起始阶段的具体作用机理；探索LeuRS中某些特定结构域的功能；肽酰-tRNA移位相关的两个因子EF-G和LepA调控下的氨基酰-tRNA正向移位与反向移位的识别条件、作用位点、信号传递途径；研究在高等生物中反向移位的生理意义。 2 内质网和线粒体中蛋白质氧化折叠的分子机制 研究内质网氧化折叠相关蛋白质（Ero1、Ero1、PDI和Prx4等）的相互作用网络。采取分子生物学、生物化学、细胞生物学和结构生物学等多种学交叉技术手段，研究Ero1活力的调节、Ero1与PDI相互作用、内质网过氧化氢的有效清除机制和阐述新的蛋白质氧化折叠分子QSOX1的功能等，获得内质网蛋白质氧化折叠调控的网络关系（Ero1-PDI，H2O2-Prx4/Gpx7/Gpx8-PDI, QSOX1）。解析线粒体Mia40-Erv1和Mia40-底物蛋白复合体的结构，解析线粒体膜间隙中血红素/铜转运蛋白和其他具有重要生物学功能的蛋白的结构，阐明线粒体的氧化折叠电子传递机制。 3 蛋白质巯基的氧化还原修饰对蛋白质质量控制体系的影响 发展新的巯基氧化还原修饰检测的定量蛋白质组学方法；研究内质网氧化折叠相关蛋白质（Ero1和Prx4等）的亚硝基化及谷胱甘肽化修饰的生理意义。巯基氧化还原修饰对蛋白质质量控制体系（分子伴侣、泛素-蛋白酶体系统及自噬系统）关键蛋白（Hsp70、Hsp40、泛素化E1连接酶UBA1、UBA6、E2连接酶UBA3、去泛素化酶USP5、USP10、ATG）功能的影响。筛选对氧化折叠和质量控制具有调控功能的小分子化合物。 4 蛋白质错误折叠聚集的机制 以几个与神经退行性疾病相关的淀粉样蛋白质（Prion、Tau、-Synuclein、TDP-43、PolyQ蛋白）为模型和对象，综合应用生物化学、分子生物学、结构生物学和细胞生物学的先进技术方法，研究蛋白质的错误折叠、淀粉样聚集和包涵体形成的分子机制和生物效应；蛋白质翻译后修饰及大分子拥挤对蛋白质聚集的调控；蛋白质错误折叠和疾病发生的内在联系以及筛选和设计对蛋白质聚集和包涵体具有调控功能的小分子化合物。系统研究分子伴侣（Hsp70、Hsp90、Hsp104、GroEL、TriC、ERp57）和辅伴侣（CHIP、HSJ1、USP19、BAG6）在蛋白质错误折叠的发生和清除中的调节作用。5 蛋白质异常修饰与认知功能障碍 建立蛋白质过度磷酸化的细胞和动物模型，即采用醛类（甲醛、核糖等）诱导细胞和动物脑内Tau、-Synuclein等蛋白过度磷酸化；研究过度磷酸化对Tau、-Synuclein等蛋白结构与功能的影响；探索在“醛应激”状态下的蛋白质过度磷酸化及其相关作用网络规律，如醛类与细胞的相互作用通讯网络，蛋白质质量控制体系的作用、激酶与磷酸化系统的调节、突触间联络的损伤及神经细胞死亡的机制。阐明异常修饰（过度磷酸化、非酶促糖基化等）与蛋白质错误折叠之间的关系，醛应激导致的蛋白质异常修饰与认知障碍之间的关系；在此基础上，研究内源性甲醛作为生物标记物用于老年性痴呆症临床诊断的可能性。二、预期目标总体目标： 本项目围绕蛋白质的生成、修饰与质量控制这一关键科学问题，主要研究蛋白质生物合成的质量控制、蛋白质的氧化折叠与氧化还原修饰、蛋白质错误折叠及分子伴侣的作用、蛋白质的异常修饰与疾病的关系，探讨质量控制失衡与蛋白质错误折叠相关疾病发生发展的关系。通过优势集成团队的通力合作，确保项目研究高质量实施，着重建立较完善的蛋白质质量控制研究体系、取得相关前沿研究突破、揭示关键蛋白质的动态规律与功能机制、阐析蛋白质质量控制体系的作用机制和调控机制、筛选影响蛋白质质量控制的小分子化合物、获得具有国际领先和拥有自主知识产权的研究成果，促进阐明重要生命活动的基本规律和向生物医学的转化应用，为蛋白质科学领域的研究理论增添新内容，为神经退行性疾病等蛋白质错误折叠相关疾病的预防、诊治、药物开发等研究提供理论基础，同时显著提升我国蛋白质质量控制研究的水平和影响力，使我国在该领域的研究跻身于国际前列。 五年预期目标： 1系统建立完善的蛋白质合成、折叠、修复、降解和修饰的蛋白质质量控制体系的体内研究平台和体外研究平台; 建立和发展研究蛋白质质量控制和修饰调控的新技术新方法，为蛋白质质量控制机制研究的长期可持续发展和立足国际前沿奠定重要基础，促进蛋白质基地建设。 2在蛋白质合成的精确控制机制、氧化折叠关键蛋白的结构与功能研究及氧化折叠的网络调控、蛋白质错误折叠与聚集的机理、蛋白质质量控制的氧化还原调控机制方面取得系统研究成果和突破进展。 3阐明“醛应激”的分子细胞机制，以及内源性甲醛与老年性痴呆症认知功能障碍之间的相关性，提供临床基础研究实验数据。由此建立临床检验老年性痴呆症的生物化学方法，为将来发展成为用于临床诊断和药物使用的评价指标的新方法打下基础。 4发表论文 50-80 篇，其中在国际一流期刊（IF>10）发表论文5-10 篇、在国际有影响力期刊发表论文20-30篇。申请专利3-5项 5培养该领域战略领军人才2-3 名、副教授/研究员及高级技术型人才4-6名、博士后 10-15 名、硕博生30-50 人，建设一支具有国际竞争力的蛋白质质量控制研究队伍。 三、研究方案学术思路 本项目聚焦蛋白质质量控制研究领域前沿，结合最新发现和国际发展趋势，紧扣蛋白质合成、折叠、修复、降解及修饰等关键环节的质量控制，系统研究蛋白质的“生老病死”。以蛋白质质量控制的关键蛋白质的功能研究为切入点，从单一功能研究拓展到多种功能研究，从单蛋白功能研究拓展到相互关联蛋白的网络研究，并将功能研究与结构研究紧密结合，正常和应激条件下功能研究紧密结合，阐析关键蛋白质的结构、功能和修饰调控机制。应用生物化学、细胞生物学、生物物理学和系统生物学等分析蛋白质质量控制相互作用的分子网络，揭示其与蛋白质错误折叠相关疾病发生发展的内在关系，获得蛋白质质量控制分子机制的全景网络。 技术途径 本项目依据已有工作基础，设臵四个紧密关联的蛋白质质量控制研究课题，包括 1）蛋白质生物合成的质量控制、2）蛋白质氧化折叠与氧化还原修饰、3）蛋白质错误折叠及分子伴侣的作用、4）蛋白质异常修饰与疾病的关系，针对拟解决的关键科学问题联合攻关，获得蛋白质质量控制和修饰调控的创新研究方法和平台，以及质量控制分子机制的全景网络；在应用成果方面获得能够试用于老年性痴呆症临床诊断的生物标记物；筛选调节蛋白质质量控制的小分子化合物。项目研究技术途径示意图如下：项目总体研究技术途径示意图课题1 蛋白质生物合成的质量控制 首先以亮氨酰-tRNA合成酶（LeuRS）为代表，研究不同来源的LeuRS之合成和编校功能的特点，阐明在蛋白质生物合成起始阶段质量控制的机理。同时在原核和真核生物中，开展对肽酰-tRNA移位相关的两个因子EF-G和LepA的研究，阐明在蛋白质生物合成过程中的质量控制机理和生理学意义。最后利用分子生物学和生物化学的方法研究：蛋白质跨膜前的新因子LepA/Guf1与其他因子的相互作用；LepA/Guf1翻译阻滞与蛋白质合成的关系；LepA/Guf1与SRP的系统效应。课题1 研究技术途径示意图课题2 蛋白质氧化折叠与氧化还原修饰 首先建立蛋白质巯基氧化还原修饰的评价体系，筛选出氧化还原敏感的蛋白质靶点，建立体外及体内研究蛋白质氧化折叠与蛋白质质量控制的关键蛋白的研究模型。之后，具体研究各个关键蛋白质靶点的巯基氧化还原修饰对于蛋白质氧化折叠与质量控制的调控机制。最后，利用建立好的蛋白质氧化折叠与质量控制体系的体外与体内评价体系，来筛选具有调控作用的小分子化合物，为进一步的药物设计奠定基础。课题2 研究技术途径示意图课题3 蛋白质错误折叠及分子伴侣的作用 首先选定与神经退行性疾病相关的几个淀粉样蛋白质作为研究模型。所选蛋白质都有较好的遗传学背景和临床病理现象，所取得的研究成果将能够为探索病理机制和防治方法提供依据。关注分子伴侣在蛋白质错误折叠的发生和清除中的作用。采用多学科、多技术的综合研究方法，集中精力解决蛋白质错误折叠和聚集的机制这一中心问题。主要包括体外聚集研究，揭示体外聚集和纤维化的物理化学规律；细胞内包涵体研究，揭示细胞内包涵体形成的动态过程；分子伴侣的作用，借助体外和细胞模型研究分子伴侣和辅伴侣对蛋白质聚集和包涵体的作用，深入研究分子伴侣相互作用及纤维的形态和形成规律的结构基础。 课题3 研究技术途径示意图课题4 蛋白质异常修饰与与疾病的关系从蛋白质的异常修饰、细胞内蛋白质的修饰及其相关作用网络、动物模型的建立，再到认知功能损伤的学术研究途径。蛋白质的化学修饰，即非酶促氨基修饰（甲醛、核糖等），研究修饰后蛋白质的结构与功能；建立“醛应激”细胞模型，包括甲醛、核糖（多羟基醛）等，建立神经Tau、-Synuclein过度磷酸化的细胞模型，研究过度磷酸化及其相关激酶、磷酸化酶，蛋白质质量控制体系的作用等；建立“甲醛应激”动物模型，研究甲醛诱导脑内神经Tau的过度磷酸化，细胞功能变化、突触损伤，在此基础上阐明蛋白质异常修饰与认知功能损伤的关系；同时采用老年性痴呆症转基因鼠加以验证；内源性甲醛等与认知功能障碍之间的关系；开展临床老年性痴呆症病人内源性甲醛的测定与认知功能损伤的测评等，研究内源性甲醛与老年性痴呆症认知功能障碍之间关系。课题4 研究技术途径示意图创新与特色 整个项目学科交叉，将单个蛋白质与相互作用网络的研究紧密结合，将体外生化性质与体内生理功能研究紧密结合，将生理过程的平衡状态与疾病过程的失衡状态研究紧密结合，全面揭示蛋白质质量控制体系的作用机制和调控机制。具体创新点与特色表现在：1. 思路创新，注重系统和网络研究，1+1>2从关注蛋白质质量控制单个关键蛋白质的功能研究转为注重功能相关蛋白质相互作用网络研究，如：在氧化折叠系统作用的研究中，将（Ero1-PDI，H2O2-Prx4/Gpx7/Gpx8-PDI, QSOX1）作为一个整体研究，不仅回答单一氧化折叠酶的作用机制，还将阐述氧化折叠过程中内质网氧化还原平衡调控的机制；在分子伴侣（Hsp70、Hsp90、Hsp104、GroEL、TriC）和辅伴侣（CHIP、HSJ1、USP19、BAG6）作用的系统研究中，除了鉴定单个分子伴侣的作用，还将阐述这些分子伴侣之间的关系，从而获得更接近生理条件下的作用机制。2. 学科交叉，优势互补本项目研究队伍的特色是多数负责人和学术骨干都在蛋白质质量控制研究方面有很好的积累。本项目在此基础上注重学科交叉，吸纳新的研究力量，加强了活细胞内蛋白质质量控制的研究、应激条件下蛋白质质量控制的调控机制研究以及关键蛋白质功能与结构关系的研究，全方位多角度揭示蛋白质质量控制机制和动态变化，保证了研究成果的可靠性和先进性。 3. 紧扣前沿，探索蛋白质质量控制的氧化还原修饰新机制 巯基氧化还原修饰的功能和方法研究是当前国际上快速发展的领域。由于蛋白质质量控制关键蛋白活性位点或调控中心多为氧化还原敏感的半胱氨酸巯基， 氧化还原修饰在质量控制体系中的作用日益引起关注。本项目紧扣本领域前沿，在原有工作基础上创建巯基氧化还原修饰的定量高通量检测方法，系统研究氧化还原修饰对质量控制体系不同环节关键蛋白的体内外功能调控，揭示蛋白质质量控制的新机制，有望取得创新和特色成果。 4. 注重基础与临床及技术应用相结合 本项目将蛋白质质量控制失衡的触发因素与蛋白质异常修饰和错误折叠及认知功能损伤紧密结合，开发试用于老年性痴呆症临床诊断的生物标记物，具有重要实际意义。本项目还注重质量控制研究平台和新技术新方法的建设，为蛋白质质量控制机制研究的长期可持续发展和立足国际前沿奠定重要基础。 可行性分析 1. 本项目的研究方案切实可行 从学术思路方面，本项目提出的主要科学问题和研究目标不仅都具有理论和实际依据，而且都是该领域前沿性和关键性的问题。项目中各课题研究内容和方案清晰明确切实可行。从技术途径方面，各课题均有成熟的蛋白质质量控制相关研究模型和方法，应用生物化学、生物物理学、结构生物学、细胞生物学及其它现代生物学等技术保证项目预期目标的完成。 2. 本课题凝聚了相关专业的优秀研究团队 本项目的研究队伍集中了我国在蛋白质质量控制研究领域的优势力量，包括教授及研究员11名，其中中国科学院院士2名、发展中国家科学院（TWAS）院士2名、 国家重大科学研究计划首席科学家3名、“国家杰出青年基金”获得者 1 名、中科院“百人计划”入选者 1 名、长江学者特聘教授1名、985工程特聘教授1名，既有国际著名的多年在蛋白质合成和折叠方面具有坚实研究基础的前辈带头人，也有在蛋白质聚集机制和修饰调控方面的后起之秀。研究团队成员已经开展许多与本项目相关的研究，其中包括科技部“973”项目、国家自然科学基金重大、重点项目和中国科学院创新项目，特别是具有相关国家级重大/重点项目实施的丰富经验，完全能确保本项目顺利实施并达到预期目标。 3. 前期工作基础扎实 本项目研究团队在蛋白质合成、折叠、修复、降解及氧化还原修饰研究等方面，已有着非常扎实的研究基础，本项目团队成员发表的与本项目相关的通讯作者/第一作者研究论文中，在 Cell、Nature、Science 及子刊上3篇，影响因子大10的有5篇，影响因子10-5之间的有43篇。这些扎实的研究工作基础为本项目的顺利实施与取得预期成果奠定了坚实的基础。 本项目也有很多前期工作基础。本课题成员建立了多种有效的“亮氨酰-tRNA合成酶与底物氨基酸和tRNA相互作用”研究系统；深入研究了EF-G和LepA参与的核糖体移位过程；在蛋白质巯基亚硝基化修饰的功能和方法研究方面有坚实的基础；对PDI和其同源蛋白的结构与功能关系有二十多年系统的研究基础；对参与酿酒酵母氧化应激的蛋白质的结构、功能及相互作用关系进行了系统的研究，初步阐明了氧化应激过程中电子传递的结构生物学基础；系统研究了酵母Prion蛋白Ure2的折叠、聚集以及其GPx、GST、GRX酶活性；在-Synuclein和TDP-43的聚集和包涵体形成机制方面取得了重要的研究成果，在双功能辅伴侣对淀粉样聚集蛋白的调控方面也有很好的进展；在大分子拥挤与蛋白质聚集关系研究方面具有特色；在甲醛作为Tau蛋白异常磷酸化的触发因素研究方面以及核糖诱导蛋白质糖基化错误折叠等方面有系统的研究，提出了“甲醛应激”的新观点。 4. 良好的工作条件和环境保障项目的顺利实施 本项目依托、承担和参加研究单位（中国科学院生物物理研究所、中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所、中国科技大学、北京大学和武汉大学）都属于国内一流的科研院校，有很强的综合科研实力，尤其是大部分科研骨干都依托于国家级、省部级重点实验室，包括生物大分子国家重点实验室、脑与认知国家重点实验室、分子生物学国家重点实验室、合肥微尺度物质科学国家实验室（筹）、病毒学国家重点实验室等，为本项目的开展提供了非常好的工作环境和研究条件，满足本项目在仪器设备和技术方法的需求。课题设置 课题1 ： 蛋白质生物合成的质量控制 预期目标： 通过研究LeuRS对特异氨基酸及其对应的特异tRNA之间相互识别匹配的机制、鉴定依赖和非依赖tRNA的转移前编校发生的位点，tRNA的氨基酸接受臂在氨基酰化活性中心和编校活性中心之间的动态转位过程；tRNA关键核苷酸在氨基酰化反应、编校反应各步和蛋白质翻译起始阶段的具体作用机理，揭示蛋白合成前质量控制的调节机制。通过对翻译因子（EF-G，LepA）和核糖体之间的识别以及调控的研究，阐明蛋白翻译过程中质量控制的调节机制。 主要研究内容： 1. 蛋白质合成原料的质量控制 对蛋白质新生肽链生成前的质量控制进行全面了解。以亮氨酰-tRNA合成酶（LeuRS）为代表，研究不同来源的LeuRS之合成和编校功能的特点，阐明在蛋白质生物合成起始阶段质量控制的机理。主要技术途径包括：通过基因克隆构建各种突变酶以及结构域的突变体；用生物化学和分子生物学的方法，比较突变体与天然酶功能差异；用核磁共振、射线晶体衍射手段在原子水平上研究酶与底物精确识别的结构基础；用化学生物学方法得到非天然氨基酸做为探针去研究体内新生肽链生成过程的质量控制。 2. 蛋白质翻译过程中的质量控制 在原核和真核生物中，开展对肽酰-tRNA移位相关的两个因子EF-G和LepA的研究，阐明它们在蛋白质生物合成过程中的质量控制机理和生理学意义。主要技术途径包括基因克隆、基因打靶、SiRNA、构建各种突变体和截短体，以及结构域的突变体；用核磁共振、射线晶体衍射手段在原子水平研究EF-G/LepA与错配和正常底物精确识别的结构基础；用化学生物学方法得到非天然氨基酸做为探针去研究体内蛋白质合成过程的质量控制；用生理学和组织细胞学的方法，比较突变个体（细胞）与野生型个体（细胞）之间的表型差异。 3. 蛋白质跨膜前的新因子LepA/Guf1 使用体内定点光交联、化学交联、免疫印迹、免疫共沉淀、串联亲和标签技术结合质谱等手段考察LepA/Guf1和其他因子的相互作用；采用分子生物学和生物化学的方法研究LepA/Guf1翻译阻滞与蛋白质合成的关系；利用基因突变，条件敲除等实验手段研究LepA/Guf1与SRP的系统效应。 经费比例： 18% 承担单位： 中国科学院上海生命科学研究院、中国科学院生物物理研究所 课题负责人： 王恩多 学术骨干： 秦燕、周小龙、朱萍 课题2 ： 蛋白质氧化折叠与氧化还原修饰 预期目标： 在目前已建立的蛋白质亚硝基化修饰蛋白质组学检测方法的基础上，发展新的巯基氧化还原修饰的蛋白质组学检测方法，用于筛选蛋白质折叠体系中的氧化还原修饰敏感的关键蛋白。基于已经建立的体内外巯基修饰方法以及相关检测方法，结合结构解析和体外功能重建，获得内质网氧化折叠体系、线粒体氧化折叠体系及蛋白质质量控制体系的蛋白质巯基氧化还原修饰的生理意义及调控机制，帮助揭示蛋白质巯基氧化还原修饰与蛋白质折叠及相关疾病的复杂关系，筛选具有调控巯基修饰功能的小分子化合物药物先导物。研究巯基修饰酶的活性机制，获得巯基氧化还原修饰调控的分子机制，探索新发现的巯基修饰酶的生理功能。 主要研究内容： 1. 发展新的巯基氧化还原修饰检测的蛋白质组学方法 在已经建立的IBP方法的基础上发展基于SILAC （stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture）的定量方法来定量发生巯基修饰的蛋白质，筛选出蛋白质折叠体系中氧化还原修饰敏感的关键蛋白靶点，研究氧化应激/氮应激对蛋白质氧化折叠及蛋白质质量控制体系的调控机制。为系统研究蛋白质氧化折叠体系及质量控制体系提供方法上的创新。 2. 内质网的氧化折叠与巯基修饰对酶活性的调控 研究内质网氧化折叠相关蛋白质（Ero1、Ero1、PDI和Prx4等）的相互作用网络，以及这些蛋白质的亚硝基化及谷胱甘肽化修饰的生理意义。采取分子生物学、生物化学、细胞生物学和结构生物学等多学科交叉技术手段，研究Ero1活力的调节、Ero1与PDI相互作用、内质网过氧化氢的有效清除和新的蛋白质氧化折叠通路等问题。鉴定Ero1、Ero1与Prx4的亚硝基化修饰及谷胱甘肽化修饰位点，体内外研究巯基修饰对酶活性的影响，在细胞水平检测巯基修饰对细胞内蛋白质氧化折叠过程的影响。利用蛋白质组学技术研究内质网氧化折叠相关蛋白质的巯基修饰的生理意义。 3. 线粒体的氧化折叠 联合利用生物化学和结构生物学手段，在原子分辨率水平上阐明线粒体膜间隙蛋白质氧化折叠时的电子传递机理，完善线粒体膜间隙蛋白成熟过程中的氧化折叠体系。我们选用最经典的真核生物研究模型酿酒酵母，解析Mia40-Erv1和Mia40-底物蛋白复合体的结构，解析粒体膜间隙中血红素/铜转运蛋白和其他具有重要生物学功能的蛋白的结构，测量线粒体膜间隙中已知的血红素/铜转运蛋白的活性，分析血红素/铜转运蛋白与底物蛋白的复合物的之间相互作用的界面，总结共同特征，在原子分辨率水平上揭示Mia40-Erv1依赖的氧化折叠体系和血红素/铜离子转运体系的工作原理。 4. 蛋白质质量控制体系相关蛋白质的巯基氧化还原修饰研究 鉴定分子伴侣、泛素化降解途径关键蛋白和自噬过程相关蛋白的巯基修饰位点。体外研究分子伴侣被修饰后生化性质及活性的改变，体内研究巯基修饰对其功能的影响。研究泛素化降解途径受氧化应激/氮应激的调控机制以及泛素化途径失常导致的错误折叠蛋白质聚集与细胞效应。研究关键蛋白发生巯基修饰后对自噬的调控机制，以及在氧化应激/氮应激条件下，自噬过程对蛋白质错误折叠蛋白的清除机制。以CFTR、-Synuclein以及酵母Prion蛋白Ure2等蛋白为模型蛋白，在体内外研究蛋白质质量控制体系相关蛋白的巯基修饰对的淀粉样纤维化的影响。研究小分子化合物对蛋白质质量控制过程中关键蛋白巯基修饰的调控作用，筛选具有调控功能的小分子化合物药物先导物。 5. 巯基修饰酶的作用机制及生理功能研究： 研究具有GRX活性的酵母Prion蛋白Ure2新颖的酶促反应机制，Ure2的GRX活性在体内的生理意义。研究Ure2的 GRX活性的催化反应步骤；分析Ure2与反应中间体之间的相互作用，确定相互作用残基及电子转移机制，从而阐明Ure2的GRX活性的催化机制。在正常和应激条件下，通过已建立的蛋白质组学检测方法，比较Ure2存在、缺失以及处于Prion状态时，酵母细胞内蛋白质的亚硝基化和谷胱甘肽化修饰情况，而阐释Ure2的GRX活性可能的生理功能。 经费比例： 37% 承担单位： 中国科学院生物物理研究所、中国科学技术大学 课题负责人： Sarah Perrett 学术骨干： 王志珍、周丛照、陈畅、黄丽华、陈立君课题3 ： 蛋白质错误折叠及分子伴侣的作用 预期目标： 蛋白质错误折叠、淀粉样聚集和包涵体的形成与神经退行性疾病的发生紧密相关。研究蛋白质错误折叠发生的内在和外部原因，错误折叠蛋白质的复性和降解的平衡调控，大分子拥挤和蛋白质包涵体的形成及对细胞的效应，分子伴侣对蛋白质错误折叠和包涵体形成的影响及其质量控制。通过理解细胞内外蛋白质错误折叠发生的规律机制和分子伴侣的作用，为相关疾病（如神经退行性疾病）的发生和病理机制以及可能的预防和治疗提供重要依据。 主要研究内容： 综合应用生物化学、分子生物学、结构生物学和细胞生物学的先进技术方法，研究神经退行性疾病相关蛋白质的错误折叠和包涵体的形成，分子伴侣以及辅伴侣在蛋白质错误折叠的发生和清除中的调节作用。 1. 蛋白质错误折叠，淀粉样聚集和包涵体形成 (1) 蛋白质淀粉样聚集和纤维化的分子机制 通过检测蛋白质的内源荧光和应用停流与平衡结合的技术，详细测定一些使体内Prion传播特点发生改变的Ure2突变体的热力学和动力学折叠特征，将其与我们已经得到的野生型蛋白质的参数进行比较。还将尝试这些突变体的结晶结构解析，以期获得详细的结构变化信息。采用包含polyQ序列和小的完好折叠的Huntingtin （Htt）蛋白的HEAT-repeat结构域的嵌合体蛋白，研究邻近的HEAT-repeat蛋白结构域的存在对polyQ序列聚集性质的调节，以及邻近的polyQ序列对HEAT-repeat结构域结构和折叠性质的影响。 (2) 翻译后修饰及大分子拥挤对蛋白质聚集的调控 以人Prion 和Ataxin-3 （Atx3） 等蛋白质为对象，结合体内和体外研究方法，研究糖基化、磷酸化修饰，泛素化修饰和GPI 定位修饰以及大分子拥挤对模型蛋白质聚集的调控机制。比较在生理拥挤环境和稀溶液中，翻译后修饰的蛋白质与无修饰的蛋白质的分子效应和功能差异，检测这些特异性修饰以及大分子拥挤对于这些模型蛋白质的结构稳定性、聚集和纤维化程度的影响，以及对Prion蛋白的蛋白酶抗性和感染性的影响。阐述翻译后修饰及大分子拥挤对于蛋白质病理性聚集的细胞效应及Prion蛋白传播中的作用。 (3) 蛋白质聚集和细胞内包涵体形成 我们的前期研究表明-Synuclein/Synphilin-1 （-Syn/Sph1） 间的相互作用对细胞内包涵体（Inclusion Bodies）形成有显著的影响。将用NMR、荧光及其它生化方法体外筛选和设计能够阻止-Syn/Sph1两者相互作用以及-Syn聚集和包涵体形成的小分子化合物；并在细胞模型中验证这些化合物对-Syn聚集和包涵体形成以及细胞毒性的影响。TDP-43 蛋白（TAR DNA Binding Protein of 43 kDa）的沉积与肌萎缩侧索硬化症的发生相关。我们将研究TDP-43蛋白聚集的内在序列因素，细胞内形成包涵体的原因和对细胞的效应和功能丧失。主要探索一些因素包括遗传突变、错误的细胞定位、生化修饰、降解片段和RNA结合等对TDP-43功能丧失和细胞毒性的影响。 2. 分子伴侣和辅伴侣对蛋白质质量控制的作用 (1) 分子伴侣对Prion蛋白、Tau蛋白错误折叠和聚集的作用 以人Prion蛋白及其病理突变体，过磷酸化修饰的Tau蛋白及其病理突变体为研究对象，用各种生化和细胞技术研究分子伴侣Hsp70A1A（Hsp70家族成员）和ERp57（PDI家族成员）对这两个蛋白质病理性错误折叠的调控机制。阐释分子伴侣在疾病发生机制中的作用，进而运用分子生物学方法设计出能够抑制病理性错误折叠的分子伴侣。 (2) 分子伴侣对Prion传播及polyQ蛋白聚集的调控 结合体内和体外方法，探测Hsp70突变体影响Prion传播的生物化学基础，以及Hsp70的辅分子伴侣在这种影响中的贡献。在体外检测影响Prion传播的Hsp70突变体的ATPase活性和肽结合能力，与Hsp104和/或Hsp40协同作用的能力，以及与Ure2相互作用和抑制淀粉样纤维化的能力。将在体外和体内研究Hsp70的结构域缺失突变体，了解它的三个结构域在Prion治愈中各自的作用。检测分子伴侣对Prion传播发生改变的Ure2突变体的折叠和聚集的影响，进而在体内检验。包括Hsp70/Hsp40、Hsp104 、GroEL 和TriC在内的分子伴侣已被发现能在动物、细胞和体外模型抑制Huntingtin （Htt）的N-端片段的聚集。我们将检测Htt及相关嵌合体的折叠和聚集性质如何受分子伴侣调控。 (3) 双功能辅伴侣蛋白对蛋白质质量控制的作用 有一类辅伴侣分子，它们既包括与分子伴侣相互作用的结构域，又有参与泛素蛋白质酶体作用的结构域。我们的前期工作已发现辅伴侣蛋白HSJ1a可以双向调节Atx3的蛋白质水平，其N端J结构域与Hsp70作用，可以减少细胞内Atx3蛋白的量，而C端的双UIM结构域参与泛素结合相关的作用，上调细胞内Atx3蛋白的水平。我们将以Atx3或-Syn蛋白为模型，研究双功能辅伴侣蛋白如CHIP、HSJ1、USP19、BAG6 （BAT3）等通过分子伴侣和泛素-蛋白酶体两大系统对细胞中蛋白质的质和量的调控。 经费比例： 18% 承担单位： 中国科学院上海生命科学研究院、武汉大学 课题负责人： 胡红雨 学术骨干： 梁毅、宋爱新、杜芬课题4 ： 蛋白质异常修饰与相关疾病的关系预期目标： 通过多种方法手段研究神经系统重要功能蛋白质的异常修饰（过度磷酸化、糖基化等）的诱导因素、分子细胞机制；蛋白质错误折叠、分子聚集、神经细胞死亡与认知功能损伤之间的关系。建立能够试用于临床检验老年性痴呆症的生物化学方法，为老年性痴呆症的早期诊断、药物设计等提供新的方案。主要研究内容：1. 异常磷酸化、非酶促糖基化的细胞与动物模型建立建立醛诱导的过度磷酸化、糖基化等细胞模型、小鼠以及大鼠模型，测定导致细胞发生“醛应激”的醛及其衍生物之间的关系与时间动力过程；并对所建立的细胞、动物模型代谢状况进行评估，使得所建立的细胞及动物模型具有可重复性；在必要情况下建立非人灵长类模型。2. 神经系统重要蛋白质的异常磷酸化、非酶促糖基化机制通过申请者所建立的异常磷酸化、糖基化细胞和动物模型，研究甲醛、核糖等诱导的神经Tau、-Synuclein、A等蛋白磷酸化位点及程度；参与神经系统蛋白过度磷酸化的激酶及其调控机制，包括磷酸化酶系统的调控状态等，即“醛应激”的细胞调控通讯网络；在“甲醛应激”情况下神经系统蛋白质磷酸化位点及发生机制。3. 异常磷酸化、非酶促糖基化及其相互作用网络过度磷酸化对神经Tau、A、-Synuclein、SNAREs等蛋白结构与功能的影响；神经Tau蛋白等过度磷酸化的生物学意义，包括在细胞核内保护DNA功能的改变等；在建立“醛应激”细胞和动物模型的基础上，检测甲醛诱导神经元中GSK3磷酸化位点及程度；GSK3对线粒体动态平衡和转运的影响，及在老年性痴呆症模型所致神经元凋亡和认知功能损伤中的作用；BDNF的调控并改善神经元在应激状态的功能；利用甲醛慢性认知功能损伤的细胞模型、鼠模型以及非人灵长类模型，研究蛋白质异常修饰、相互作用的网络与神经细胞变性之间关系。4. 异常磷酸化、糖基化与认知功能损伤研究神经系统蛋白质异常修饰与认知功能的损伤。从分子、细胞及整体水平研究醛类对SNAREs（soluble NSF-attachment protein receptors）及-Synuclein等蛋白质异常修饰对突触小泡上v-SNARE蛋白，VAMP2/Syntaptobrevin2，与膜上t-SNARE蛋白，syntaxin1和SNAP25蛋白的组分变化及异常聚集，影响神经递质外排功能、损伤突触间联络，在探索蛋白质异常修饰的机制及其相关网络的相互作用的基础上，阐明蛋白质异常修饰与认知损伤之间的关系。 5. 内源性甲醛作为生物标记物用于临床诊断的基础研究 研究出能够试用于临床诊断老年性痴呆症的生物标记物。内源性甲醛与老年性痴呆症认知功能障碍之间的相关性；由此建立临床检验老年性痴呆症的生物化学方法，为将来发展成为用于临床诊断和药物使用的评价指标的新方法打下基础。 经费比例： 27% 承担单位： 中国科学院生物物理研究所、北京大学、山东大学 课题负责人： 赫荣乔 学术骨干： 崔德华、陈哲宇、苏擘、张晖、魏艳课题间关系，以及与项目总体目标和五年目标的关系本项目拟从蛋白质生成、修饰与质量控制这一关键科学问题出发，着眼于蛋白质质量控制关键蛋白质的结构、功能、调控，系统研究蛋白质质量控制关键蛋白质的作用机制及其对蛋白质错误折叠和聚集的调节作用，揭示其与蛋白质错误折叠相关疾病发生发展的内在关系，为相关疾病的预防、诊治、药物研究提供直接基础和理论依据。因此，本项目围绕蛋白质质量控制前沿性研究拟设臵紧密关联的四个课题：课题一，蛋白质生物合成的质量控制；课题二，蛋白质氧化折叠与氧化还原修饰；课题三，蛋白质错误折叠及分子伴侣的作用；课题四，蛋白质异常修饰与疾病的关系。这四个课题紧紧围绕蛋白质质量控制的关键环节，系统研究蛋白质的“生老病死”。蛋白质合成、折叠、修复、降解及修饰调控任何一个环节的质量控制出现问题，均可引起蛋白质错误折叠相关疾病的发生发展。因此，本项目设臵的这四个课题，相互独立又紧密关联，从体外到体内，从单蛋白到相互作用网络，从生理状态到病理状态，系统揭示质量控制的分子机制，通过整体协作实现总体目标。四、年度计划研究内容预期目标第一年1. 构建各种突变株、相关克隆和模型：构建酿酒酵母各种tRNALeu基因敲除株。构建酿酒酵母和人线粒体tRNALeu体外转录的克隆。在低等模式生物中构建LepA的基因敲除株。建立醛诱导的过度磷酸化、糖基化细胞模型、鼠模型。建立和进一步完善脑衰老及神经退行疾病易感因素对异常修饰错误折叠A、-Synuclein等蛋白质的细胞和动物模型研究体系。2. 表达纯化相关蛋白质：EcLeuRS野生型及各突变体，野生型hmLeuRS、ScLeuRS和EctRNALeu，与肽酰-tRNA移位相关的两个因子EF-G和LepA的各种突变体，人源巯基过氧化氢酶Gpx7、Gpx8、Prx4和人源巯基氧化酶QSOX1及其突变体的重组蛋白。3建立体外巯基修饰及分子伴侣研究相关方法。4. 关键蛋白的体外生化研究：鉴定人源巯基过氧化氢酶Gpx7、Gpx8和Prx4、人源巯基氧化酶QSOX1等内质网氧化折叠通路关键蛋白基本的生物化学和生物物理性质。研究巯基特异性的过氧化物酶Ahp1的结构和功能关系。研究Ure2的GRX活性的催化机制。5研究酵母Prion蛋白Ure2突变体的热力学和动力学折叠特征。争取解析突变体的晶体结构。研究邻近的HEAT-repeat结构域的存在对polyQ序列聚集的调节，以及邻近的polyQ序列对HEAT-repeat结构域结构和折叠的影响。6. 体内研究糖基化、磷酸化修饰、泛素化修饰和GPI定位修饰等翻译后修饰及生理拥挤环境对于人Prion蛋白病理性聚集的细胞效应。7体外筛选和设计能够阻止a-Syn/Sph1两者相互作用以及-Syn聚集和包涵体形成的小分子化合物。8研究导致细胞发生“醛应激”的醛及其衍生物之间的关系与时间动力过程。 比较BDNF处理不同时间点神经细胞内蛋白质磷酸化等修饰的变化情况；寻找BDNF通过激活胞内的哪些信号途径来拮抗甲醛应激。1建立各种突变株、相关克隆和模型，获得纯化蛋白质，建立相关方法,为后续研究做好各种铺垫工作。2认识巯基修饰酶的催化