中药制剂中各类化学成分分析ppt课件.ppt

第四章中药制剂中各类化学成分分析,药物分析教研室,第一节 生物碱类成分分析,生物碱是生物界除生物体必须的含氮化合物（如氨基酸、蛋白质和B族维生素等）之外的所有含氮有机化合物，因其结构中氮原子上的未共享电子对而大多具有碱性。生物碱绝大多数具有显著的生物活性,因此中药制剂中有含有生物碱类成分的中药时，常选择该中药含有的生物碱成分作为定性定量的依据。,一、 生物碱类成分的主要性质及分析特征1、结构特征生物碱大多由C、H、N、O元素组成，极少数分子中尚含有其他元素；大多结构复杂，结构类型较多.结构中的氮原子有多种形式：脂氮、芳氮；季胺、叔胺、仲胺及伯胺；游离状态和与酸结合状态；还有以氮氧配位键形式存在的。此外，结构中除烷烃、羟基取代外还有羧基、酚羟基等酸性官能团及酯键的取代。,2、理化性质（1）物理性状 多数生物碱为结晶型固体，少数为无定型粉末，还有一些小分子生物碱为液体，例如槟榔碱、菸碱等；液体状的生物碱及个别小分子生物碱尚有挥发性甚至升华性，如麻黄碱具有挥发性、咖啡因具有升华性等。 一般生物碱为无色或白色，但结构中具有较长共轭体系，并有助色团的，可显不同颜色。 生物碱结构中如有手性碳原子或为手性分子的具有旋光性，并大多与生物碱的生理活性有关，通常左旋体比右旋体生理活性强。,（2） 溶解性 由于生物碱结构复杂，生物碱的溶解性也是多样化。大多数生物碱成分极性较小，游离状态下难溶于水， 易溶氯仿、乙醚、乙醇、丙酮及苯等有机溶剂，与酸结合生成生物碱盐后水溶性增加，但与生物碱结合的酸不同，生成的盐水溶性也有差异，一般含氧无机酸及小分子有机酸的生物碱盐水溶性较大。,季铵型生物碱、有氮氧配位键的生物碱易溶于水，液体生物碱及一些小分子固体生物碱则既溶于水也可溶于有机溶剂。含有酸性官能团或酯键的生物碱还可溶于一些碱液或热苛性碱液。,（3） 沉淀反应大多数生物碱在酸性水溶液中可以与某些试剂生成不溶于水的复盐或分子复合物，这些试剂称生物碱沉淀试剂。生物碱的沉淀试剂根据其组成有碘化物复盐、重金属盐和大分子酸三大类。生物碱的沉淀反应可以检查中药制剂中生物碱的存在，当某些沉淀试剂与生物碱生成的沉淀组成恒定时，还可以用于中药制剂中生物碱成分的含量测定。,（4）显色反应生物碱与一些浓无机酸为主的试剂反应产生不同的颜色，这些呈色反应多用于检识和区别纯品生物碱，而较少用于中药制剂中生物碱成分的分析。生物碱在一定pH条件下可与一些酸性染料（多为磺酸肽类）生成有色络合物，可被氯仿等有机溶剂定量提出.还有些结构中具有酯键的酯碱如乌头碱等可与异羟肟酸铁试剂反应产生紫红色，这些特点可用于中药制剂中生物碱成分的分析。,（5）碱性 大多数生物碱呈碱性反应，能使红色石蕊试纸变蓝。生物碱之所以能显碱性，是因为它们分子中氮原子上的孤电子对对质子有一定程度的亲和力，因而表现出碱性。（6）紫外光谱特征结构中具有共轭体系的生物碱均有紫外吸收，其中包括结构母核即为共轭体系的和只有部分结构为共轭系统的。 紫外光谱的吸收峰位置除与其他化合物一样与共轭系统中助色团的种类、位置、数量有关外，需要特别指出的是，结构中的氮原子与发色团直接连接或参与发色团的生物碱，其吸收峰位置还与测定时溶剂的pH有关。,二、生物碱类成分分析方法,1、单体生物碱分析（1）定性鉴别 沉淀反应是生物碱理化鉴别常用方法，主要利用生物碱能与一些试剂生成沉淀这一特性。此反应一般在酸性水溶液中进行。,（2）单体生物碱的含量测定 薄层色谱法 此法简便、快捷。选用的吸附剂、展开剂及显色方法与鉴别严格，但比鉴别严格。 高效液相色谱法 可用液-液分配色谱法、液-固吸附色谱法以及离子交换色谱法。 气相色谱法,2、中药中生物碱分析 （1）总碱分析定性鉴别 由于中药制剂中成分复杂，有些成分如蛋白质、多肽和鞣质等也可与试剂生成沉淀而造成假阳性结果，因此，制备样品供试液时必须净化处理，除去干扰成分，方能用沉淀反应进行中药制剂中生物碱类成分的鉴别. 总生物碱的含量测定 化学分析法 化学分析法包括重量分析法和容量分析法。目前主要使用酸碱滴定法。,强碱滴定生物碱盐时,在70%-90%的乙醇介质中终点比在水中明显,因此常将生物碱盐溶于90%乙醇,再用标准碱乙醇液滴定. 酸碱滴定法指示反应终点可用指示剂和各种电位法。分光光度法 目前多用单波长光度法，测定波长可选用待测生物碱成分本身的吸收波长，也可加入某些试剂如亚硝酸钠试剂、雷氏盐试剂及酸性染料等反应显色后用可见光波测定。 常用方法：直接测定、离子对萃取比色法,直接测定 不经过化学反应,利用生物碱物质自身的光吸收直接进行比色测定的方法; 一般用于药味较少、干扰不大的中药制剂中总生物碱的含量测定;离子对萃取比色法 酸性染料比色法 应用本法的关键在于介质的pH、酸性染料的种类和有机溶剂的选择; 常用的酸性染料有甲基橙、溴麝香草酚兰（BTB）和溴甲酚绿等； PH的选择要根据染料的性质及生物碱的碱性(pKa)大小来确定;,选择有机溶剂的原则是根据离子对与有机相能否形成氢键以及形成氢键能力的强弱而定. 氯仿、二氯甲烷与离子对形成氢键,有中等程度的提取率,且选择性也较好,故是常 用的提取溶剂. 高效液相色谱法 以反相高效液相色谱应用较多。在反相高效液相色谱中,由于硅胶表面残留硅醇基的影响,使生物碱分析易产生保留时间延长、峰形变宽、拖尾.可采取改进流动相、固定相等措施以克服游离硅醇基的影响,满足定量定量分析的要求. 中药制剂中生物碱成分时行高效液相色谱法测定时,使用较多的是紫外检测器.,气相色谱法 只适用于有挥发性的、遇热不分解的生物碱类; 生物碱盐在急速加热过程中产生的酸对色谱柱和检测器不利,应该注意; 制备供试品溶液时一般应采用冷提取,净化过程也要避免加热,以防成分流失,最后需用氯仿等低极性有机溶剂为溶媒制备成供试液.,（2）各生物碱组分分析 根据总生物碱中各生物碱的性质差异，如碱性差异、极性差异。通常采用色谱法对每种生物碱进行分离后分析,3、应用示例戊已丸中生物碱的含量测定处方组成：黄连、吴茱萸（制）、白芍（炒）。取本品粉末（过三号筛）0.7-0.9g，精密称定，置索氏提取器中，加盐酸-甲醇（1：100）适量，加热回流至提取液无色，提取液浓缩后移至25ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置氧化铝柱（内径约0.9cm，中性氧化铝5g，湿法装柱，用乙醇30ml预洗）上，用乙醇35ml洗脱。收集洗脱液，置50ml量瓶中，加乙醇稀释到刻度，摇匀，照分光光度法，在345nm处测定吸收度，按盐酸小糪碱的吸收系数728计算，即得。本品按干燥品计算，每1g含生物碱以盐酸小糪碱(C20H18ClNO4)计，不得少于30mg。,第二节 蒽醌类成分分析,一、概述 中药中醌类化合物主要有苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌四种类型。 其中以蒽醌类化合物最为多见，包括蒽醌及其不同还原程度的产物和二聚物，如蒽酚、氧化蒽酚、蒽酮、二蒽酮、二蒽醌等。 这些化合物在中药中可游离存在，也可与糖结合成苷，称为蒽苷。,二、结构特征及理化性质1、结构类型及特征苯醌类 苯醌类化合物从结构上可分为邻苯醌及对苯醌两大类。因前者不稳定，故天然存在的苯醌化合物多为对苯醌的衍生物，且在醌核上多有-OH、-OCH3、-CH3等基团或更长的烃类侧链。,对苯醌 邻苯醌,萘醌类 萘醌化合物从结构上考虑可以有(1,4)、(1,2)及amphi(2,6)三种类型。但迄今为止从自然界得到的几乎均为-萘醌类。,-（1，4）萘醌 -（1，2）萘醌 amphi-(2,6)萘醌菲醌类天然菲醌衍生物包括邻醌（A）及对醌（B）两种类型。,（A） （B）,蒽醌类 蒽醌类成分包括蒽醌衍生物及其不同还原程度的产物，如氧化蒽酚、蒽酚、蒽酮及蒽酮的二聚物等。,蒽醌 氧化蒽酚 蒽酮 蒽酚,2、理化性质（1）溶解性苯醌及萘醌多以游离状态存在；而蒽醌类则往往结合成苷存在于植物体中；游离的醌类多具有升华性；小分子的苯醌及萘醌类具有挥发性，能随水蒸气蒸馏，可据此进行提取、精制工作。游离醌类多溶于乙醇、乙醚、苯、氯仿等有机溶剂，微溶于或不溶于水。结合成苷后极性增大，易溶于甲醇、乙醇中，在热水中也可溶解，几乎不溶于乙醚、苯、氯仿等非极性溶剂中。,（2）酸碱性 蒽醌类化合物分子中多具有酚羟基，故具有一定酸性，在碱性水溶液中易溶，但加酸酸化时又可重新沉淀析出，所谓碱提取酸沉淀即是根据这个道理进行的。 根据以上性质，醌类化合物的提取可采用碱提取-酸沉淀法。,（3）显色反应 醌类的颜色反应主要取决于其氧化还原性质以及存在的酚羟基的性质。碱性条件下的呈色反应：羟基蒽醌类在碱性溶液中会引起颜色改变并加深。与金属离子的反应：在蒽醌类化合物结构中，如果有-酚羟基或具有邻位二酚羟基时，则可与Pb2+、Mg2+等金属离子形成络合物。与Pb2+形成的络合物在一定pH条件下能沉淀析出，故可用于该化合物的精制。与对亚硝基二甲基苯胺反应：9位或10位未取代的羟基蒽酮类化合物，尤其是1，8-二羟基衍生物，酮基对位的亚甲基上的氢很活泼，可与对亚硝基二甲基苯胺反应，缩合产生各种颜色。,三、定性鉴别1、显色反应 将中药制剂用适当方法提取分离，制成供试品液，利用碱性条件下的呈色反应或醋酸镁显色反应等可对羟基蒽醌类成分进行鉴别。2、升华法 游离的蒽醌及其他醌类衍生物多具有升华性。中药制剂中如含有这类成分量较大，可采用升华法得到升华物，可见光下观察或加碱性试液显色定性。如大黄流浸膏的鉴别。,3、薄层鉴别（1）吸附剂：多用硅胶（2）展开剂：A：乙酸乙酯-甲醇-水（100：16.5：13.5或相近的比例），适于他离蒽醌苷元和蒽醌苷。 B：正丙醇-乙酸乙酯-水（4：4：3）和异丙醇-乙酸乙酯-水（9：9：4），适于分离番泻苷和二蒽酮苷 C：不含水或甲醇的混合溶媒适合于他离蒽醌类的苷元。（3）显色方法：主要有喷碱性试剂或醋酸镁甲醇液、氨气熏及在紫外灯下观察荧光，亦可在可见光下直接观察色斑。,四、含量测定蒽醌类成分含量测定1、游离蒽醌的测定 中药中含有游离蒽醌的量一般不高，且为脂溶性的，故此部分另用弱极性溶剂如乙醚、氯仿等提取后加碱比色测定。 2、结合蒽醌的测定通常是取游离蒽醌测定项下的药渣将苷提出，水解成苷元后再测定；将药渣先行酸水解，然后用非极性溶剂提取苷元后测定；取待测样品先行酸水解，然后用非极性溶剂提取苷元后测定，其结果为总蒽醌含量，从中减去游离蒽醌含量，即得结合蒽醌的含量。,3、蒽醌类单体成分的测定中药制剂中蒽醌类单体成分的测定一般要将样品水解后再进行测定，测定方法主要有薄层扫描法和高效液相色谱法。 薄层扫描法为蒽醌类成分常用定量分析方法，经层析分离后，可在可见光、紫外光及荧光下扫描测定。 蒽醌类成分在紫外及可见光下均有强吸收，利用高效液相色谱-紫外可见光检测器测定蒽醌类单体成分，具有灵敏、准确、简便等特点。在含蒽醌类化合物的中药制剂分析中应用日趋增多。,第三节 黄酮类成分分析,一、概述黄酮类化合物（flavonoids）是广泛存在于自然界的一大类化合物。多具有颜色，在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。黄酮类化合物最集中的是被子植物，类型最全，结构最复杂，含量也高。由这些中药参与配伍的中药制剂也较多见。,二、结构特征及理化性质1、结构特征 黄酮类化合物是指基本母核为2-苯基色原酮类化合物，现在则是泛指两苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。 根据基本结构又可分为黄酮、黄酮醇、双黄酮、异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮、橙酮、花青素、黄烷等类型。 多数黄酮结构中存在有桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭体系，故在200-400nm波长区域内有强烈的吸收带，此是光谱法及色谱光谱法分析的基础。 大多黄酮及其苷类含有游离酚羟基，可与聚酰胺形成氢键，可用聚酰胺色谱法进行分析。,2、理化性质（1）物理性状 黄酮类化合物多为晶性固体，少数（如黄酮苷）为无定形粉末。 游离的苷元中，除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇有旋光性外，其余则无。苷类由于在结构中引入糖的分子，故均有旋光性，且多为左旋。,（2）溶解度 黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态（苷或苷元，单糖苷、双糖苷或三糖苷）不同而有很大差异。 游离苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。 黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶或不溶于苯、氯仿等。,（3）酸碱性 酸性：黄酮类化合物因分子中多有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。 碱性氧原子的性质 黄酮类化合物分子中-吡喃酮环上的1-位氧原子，因有未共用的电子对，故表现出微弱的碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成盐，常表现出特殊的颜色，可用于鉴别。 生成的盐极不稳定，加水后即可分解。,（4）显色反应 还原反应：与盐酸镁粉（或锌粉）反应， 金属盐类试剂的络合反应：黄酮类化合物分子中多有下列结构，故常可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐等试剂反应，生成有色络合物。,铝盐：常用试剂为1%三氯化铝或硝酸铝溶液。生成的络合物多为黄色（max=415nm）,并有荧光，可用于定性及定量分析。 铅盐：常用1%醋酸铅及碱式醋酸铅水溶液，可生成黄至红色沉淀。据此不仅可用于鉴定，也可用于提取及分离工作。 锆盐：多用2%二氯氧化锆甲醇溶液。黄酮类化合物分子中有游离的3-或5-OH存在时，均可反应生成黄色的锆络合物。但两种锆络合物对酸的稳定性不同，当反应液中接着加入枸橼酸后，5-羟基黄酮的黄色溶液显著褪色，而3-羟基黄酮溶液的呈鲜黄色（锆枸橼酸反应）。,（5）紫外光谱特征 黄酮类由于具有2-苯基色原酮的基本结构，具有特定的紫外吸收峰，常有两个较强的吸收带，I带在300400nm范围内，它是由于B环桂皮酰基引起的，带为240285nm范围内，它是由于A环上的苯甲酰基引起的。 黄酮类化合物当加入一些位移试剂如甲醇钠、醋酸钠、氯化铝等，可使最大吸收波长发生位移，选择性提高，还可消除杂质的干扰，有利于含量测定。,三、定性鉴别1、显色反应 黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及-吡喃酮环有关。 常用盐酸-镁粉（或锌粉）反应 与金属盐类试剂的配合反应 黄酮类化合物分子中有游离的3-OH、5-OH或邻二酚羟基时可与Al3+、Zr4+、Pb2+、Sr2+等形成络合物，这些络合物有的产生荧光或颜色加深（如Al3+、Zr4+），有的产生沉淀（如Pb2+、Sr2+）,2、色谱鉴别 吸附剂：硅胶、聚酰胺； 硅胶色谱分离弱极性化合物较好； 聚酰胺色谱他离含游离酚羟游离羟基的黄酮及其苷为佳； 纤维素薄层则适用于分离多糖苷混合物； 显色反应：采用在紫外光下观察荧光和喷显色剂相配合的方法。,四、黄酮类成分定量分析 中药制剂中如含有黄酮类成分，可根据要求测定制剂中的总黄酮含量、黄酮类单体成分的含量或二者同时测定。 直接测定: 黄酮类化合物具有特定的紫外吸收峰,含黄酮类化合物的原料药及部分制剂经一定的提取纯化后,可直接于最大吸收波长处测定其吸收度,以芦丁等为对照品计算其含量. 显色测定: 黄酮类化合物显色以后显色物与背景最大吸收波长差别较大,可消除背景(即阴性空白)的干扰,以提高本法的选择性及灵敏度.常用铝盐作显色试剂.,五、黄酮类单体成分的含量测定1、薄层色谱法 样品经有机溶剂或水提取后，可用硅胶、纤维素或聚酰胺进行层析，达到分离目的。 层析后可将含有待测组分的色斑刮下，再用适当的溶剂洗脱后，用紫外-可见分光光度法测定。 更常用的是薄层扫描仪（单波长或双波长法）直接在薄层板上扫描测定。,2、高效液相色谱法 由于黄酮类化合物在紫外区有较强的吸收，使用HPLC法检测灵敏度较高，故该法在黄酮类单体成分的定量分析中最常用。 黄酮类成分的HPLC条件他为正相和反相色谱两类，反相色谱应用较多。 反相色谱测定多有C18键合相固定液，流动相常用甲醇-水-乙酸（或磷酸缓冲液）及乙腈-水。检测器主要采用紫外检测器或荧光检测器。,应用示例,双黄连口服液中黄芩苷的含量测定处方组成：金银花、黄芩、连翘1、色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-冰醋酸（50：50：1）为流动相；检测波长274nm。理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于1500.2、对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品10mg，置100ml量瓶中，加50%甲醇适量，置水浴中振摇使溶解，放置至室温，稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含黄芩苷0.1mg）。,3、供试品溶液的制备：精密量取本品1ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理20min，放置至室温，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。4、测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5ul，注入液相色谱仪，测定，即得。 本品每支含黄芩以黄芩苷（C21H18O11）计，不得少于80mg。,第四节 皂苷类成分分析,一、概述 三萜是由30个碳原子组成的萜类化合物，大多数三萜化合物均可看作由6个异戊二烯单位联结而成。游离三萜类化合物通常多不溶于水，而与糖结合成苷后，则大多可溶于水，振摇后可生成胶体溶液，并有持久性似肥皂溶液的泡沫，故有三萜皂苷之称。,二、理化性质溶解度可溶于水，易溶于热水、含水稀醇、热甲醇和热乙醇中，几乎不溶于或难溶于乙醚、苯等极性小的有机溶剂。在含水丁醇或戊醇中溶解度较好，且又能与水分成二相，可利用此性质从水溶液中用正丁醇或戊醇提取皂苷，借以与亲水性的糖、蛋白质等分离。三萜皂苷元能溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿等有机溶剂，而不溶于水。,显色反应醋酐-浓硫酸反应（Liebermann-Burchard反应）；五氯化锑反应(Kahlenberg反应)；三氯醋酸反应(Rosen-Heimer反应)；冰醋酸-乙酰氯反应(Tschugaeff反应)；氯仿-浓硫酸反应(Salkowski反应)。,三、定性鉴别：理化鉴别泡沫反应：多用于检验含有皂苷的原料药；化学显色反应：仅在组成药物较少的中药制剂中使用。薄层色谱法由于皂苷类成分大多无明显的紫外吸收，故经薄层色谱分离，然后选用适当的显色剂显色观察，是皂苷定性鉴别中最常用的方法。三萜皂苷类成分进行薄层层析时通常采用硅胶为吸附剂，也有采用氧化铝、硅藻土等为吸附剂。薄层层析后，可选用三氯醋酸、氯磺酸-醋酸、50%及10%硫酸乙醇液、三氯化锑、磷钼酸、浓硫酸-醋酸酐、碘蒸气等显色剂进行显色，其中以不同浓度的硫酸乙醇液为最常用。,四、三萜皂苷类成分的定量分析 中药制剂中皂苷类成分的定量分析可分为总皂苷测定、皂苷元测定和单体皂苷测定。1、总皂苷的含量测定（1）提取分离总皂苷的含量测定一般需要用适当的溶剂提取。由于皂苷在极性溶剂中溶解度较大，因此提取溶剂可为各种浓度的甲醇（70%-95%）、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇。提取后经分离得到总皂苷成分，分离可用有机溶剂，如水饱和的正丁醇萃取，也可用大孔吸附树脂处理后溶剂洗脱。,（2）测定方法重量法该方法主要用于含皂苷的原料药质量控制。在中药制剂中，如处方中药味含皂苷类成分较多时，常用正丁醇作溶剂，测定正丁醇浸出物。比色法常用三萜皂苷显色剂有香草醛-硫酸、香草醛-高氯酸、醋酐-硫酸、高氯酸、浓硫酸以及亚甲蓝等。用比色法测定中药制剂中总皂苷或总苷元的含量时，可选用单体皂苷或皂苷元作对照品，但要注意测定单体皂苷或皂苷元与总皂苷的换算系数。,2、皂苷元的含量测定皂苷元的获得：得到总皂苷后，加酸（如硫酸、盐酸）加热水解，得到皂苷元；将样品先行水解，再用有机溶剂从水解后的溶液中提取皂苷元。测定方法：主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和比色法。,3、 三萜皂苷类单体成分含量测定（1）薄层色谱法样品经适当的提取、纯化后，用薄层色谱法分离，可排除其他组分的干扰，常用于测定中药制剂中的皂苷元或单体皂苷，定量方法可采用薄层洗脱比色法或薄层扫描法。（2）高效液相色谱法大多数三萜皂苷类成分，如人参皂苷、三七皂苷等可利用其在紫外区的末端吸收来检测，但灵敏度相对要低。若中药制剂中所含三萜皂苷类成分本身具有较强的紫外吸收，如甘草酸、远志皂苷等，可用HPLC分离并用紫外检测器检测。蒸发光散射检测器（ELSD）用于高效液相色谱法检测三萜皂苷类成分的应用日渐广泛。,第五节 挥发性成分分析,一、概述 挥发性成分是指中药中一类具有芳香气并易挥发的成分，其化学组成复杂，主要包括挥发油类成分和其他分子量较小、易挥发的化合物。挥发油为易流动的油状液体，具香味和挥发性，可随水蒸汽蒸馏。,二、结构特征及理化性质1、结构特征 挥发油中成分按化学结构分类，可分为萜类化合物、脂肪族化合物及芳香族化合物等。显色反应挥发油中若含有酚类成分，加入三氯化铁的乙醇溶液，可产生蓝色、蓝紫色或绿色反应；若含有羰基化合物，加入苯肼或苯肼衍生物、羟胺等试剂，可生成结晶性的衍生物；若含有醛类化合物，加入硝酸银氨试液，可发生银镜反应；若含有内酯类化合物，于样品的吡啶溶液中加入亚硝酰铁氰化钠及氢氧化钠溶液，出现红色并逐渐消失；若含有不饱和化合物，于样品中加入溴，红棕色褪去；若含有奥类衍生物，加入浓硫酸，可产生蓝色或紫色反应。,2、薄层色谱法 挥发油成分薄层色谱的条件主要是根据极性大小加以分离的。油中所含各类化合物的极性顺序为： 烃（萜）醚酯醛、酮醇、酚酸 因此可试用不同极性的展开剂进行分离 常用的吸附剂为硅胶、氧化铝等，其中以硅胶常用 常用展开剂为石油醚或正己烷，可使不含氧的烃类成分展开，而含氧化合物一般留在原点。,三、含量测定含量测定可分为总挥发油和单一成分的测定。总挥发油的测定，采用挥发油测定器，用蒸馏法测定，可分别测定相对密度在1.0以下和1.0以上的挥发油含量。 单一成分测定：主要采用气相色谱法和薄层色谱法。,第六节、多糖、有机酸类成分分析,一、多糖的鉴别与含量测定1、多糖的鉴别（1） 薄层色谱法多糖可采用酸水解法将其水解成较小片段，然后进行薄层色谱鉴别。硅胶色谱，纤维素色谱，硅藻土色谱及氧化铝色谱。由于糖是多羟基化合物，极性强容易吸附。,采用含有无机盐水溶液，如0.3mol/L磷酸二氢钠水溶液制备硅胶薄层板，使硅胶薄层吸附能力降低，斑点集中，对分离有所改善，样品承载量显著提高。 （2） 纸色谱法多糖可采用酸水解法将其水解成单糖，然后进行纸色谱；也可用某些系统直接将多糖展开。,2、多糖的含量测定（1）单体多糖的含量测定单体多糖多采用高效凝胶液相色谱法，以已知分子量的多糖对照品作对照，确定其分子量。再将其酸水解后进行高效液相色谱法测定，确定其组成（单糖的种类及比例），以单糖的量推算多糖的量。检测器多为示差折光检测器，通常用氨基键合硅胶柱分离，但其稳定性差，用硅胶柱动态改性，可避免这一问题。,（2）总多糖的含量测定3.5-二硝基水杨酸（DNS）比色法 在碱性溶液中，3.5-二硝基水杨酸与还原糖生成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测定样品中糖含量。苯酚-硫酸法 苯酚-硫酸试剂可与游离的或多糖中的已糖，糖醛酸起显色反应，已糖在490nm波长处，戊糖及糖醛酸在480nm波长处有最大吸收，吸收度与糖含量呈线性关系。 蒽酮-硫酸法 糖类与硫酸发生脱水反应，生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm波长处有最大吸收，吸收度与多糖含量呈线性关系。,第七节 其他类型成分分析,一、概述 概念：有机酸按结构可分为三类，即脂肪类、芳香族类和萜类。按羧基数目可分为单羧基酸、二羧基酸和三羧基酸。二、定性鉴别薄层色谱法 吸附剂：常用硅胶、聚酰胺等。 展开剂：常用极性较大的溶剂，为防有机酸展开过程中发生离解，常在展开剂中加入一定比例的甲酸或乙酸等以消除因解离而产生拖尾现象。 显色剂：常用pH指示剂，如溴甲酚绿、溴甲酚紫、溴酚蓝、磷钼酸试剂等。 具有荧光的物质如绿原酸、阿魏酸等，可不必显色，在荧光灯下观察荧光。,三、含量测定酸碱滴定法 本法适合于测定总有机酸类成分，由于中药中有机酸类成分酸性弱，在水溶液中滴定突跃不明显，可用非水溶液滴定法。滴定液颜色较深时，影响观察滴定终点，采用电位法指示终点。高效液相色谱法 芳香族酸类和其他具有紫外吸收的酸类，可用高效液相色谱法进行含量测定，如绿原酸、没食子酸、桂皮酸、丹参素、阿魏酸等。 分光光度法 可用单波长法、双波长法、导数分光光度法测定有机酸的含量。,四、环烯醚萜类成分分析1、概述 环烯醚萜：一类特殊的单萜，由二个异戊二烯构成，含有10个碳原子，其母核都为环状，具有烯键和醚键，常与糖结合成苷。 溶解性：大多易溶于水、甲醇，可溶于乙醇、丙酮、正丁醇。 对酸敏感：成苷后苷键易被水解断裂，苷元结构中C1的羟基和C2位的氧是一个半缩醛结构，化学性质活泼，易发生进一步氧气化聚合等反应，尤其在酸碱作用下更易变化。,2、定性鉴别 利用薄层色谱可对环烯醚萜苷类成分进行定性鉴别。薄层板：（1）硅胶G；（2）硅胶GF254；（3）聚酰胺薄膜。显色剂：（1）硫酸乙醇溶液；（2）茴香醛试液；（3）香草醛硫酸试液；（4）对二甲氨基苯甲醛-硫酸溶液。3、含量测定 高效液相色谱法：对于有紫外吸收的环烯醚萜苷类成分可用该项法进行分析。 薄层扫描法：可用硅胶GF254薄层，检测荧光熄灭斑点；也可用硅胶G薄层，用显色剂显色后测定。 分光光度法：利用环烯醚萜苷与某些试剂的呈色反应，于分光光度计上测定吸收度进行定量分析。,五、香豆素类成分分析1、概述 概念：香豆素是一类内酯衍生物，具有芳香气，分子中苯环或吡喃酮环上常有取代基存在，按其基本的环状结构形式，分为简单香豆类、呋喃香豆素类、吡喃香豆素类、其他香豆素类。2、理化性质显色反应（1）异羟肟酸铁反应内酯环在碱性条件下开环，与盐酸羟胺缩合成异羟肟酸，然后再在酸性条件下与三价铁离子配合成盐而显红色。,（2）与酚羟基反应 具有酚羟基取代的香豆素类在水溶液中可与FeCl3试剂产生颜色。 若香豆素化合物的C6位上（即酚羟基的对位）没有取代基，则能与Gibbs试剂反应显蓝色。 香豆素类成分在碱性溶液中加热，使内酯环开裂，若酚羟基对位无取代基，则可与重氮化试剂反应生成红色偶氮染料。,紫外光谱特征化合物的结构中羰基和芳环形成较强的共轭体系，因此在紫外光区具有很强的特征吸收，紫外吸收光谱一般在300nm左右（lg为4左右）有最大吸收，吸收峰的位置与取代基有很大关系。香豆素母核本身无荧光，而羟基香豆素在紫外光下大多数能显蓝色荧光，这是因为羟基能增强分子荧光的缘故。香豆素类荧光的有无或强弱与分子中取代基的种类和位置有关。香豆素的荧光性质在薄层色谱中可用于定性鉴别和定量分析。,3、定性鉴别荧光法 羟基香豆素大多能产生荧光，利用此性质可进行定性鉴别。可直接观察提取溶液的荧光，也可观察薄层斑点荧光。薄层色谱法具有荧光的香豆素类成分，可用薄层色谱荧光法进行鉴别不具荧光或荧光强度较弱的香豆素可用显色剂或喷洒碱溶液以增强荧光再进行观察。,4、含量测定（1）分光光度法利用香豆素类成分的颜色反应，生成有色物质，于可见光波长区域进行测定。香豆素类成分都具有紫外吸收，样品较纯净时，也可于紫外光区域直接测定。 （2）薄层扫描法 本法为香豆素类成分常用测定方法之一，样品经薄层分离后，于荧光灯下定位，利用香豆素类成分具有紫外吸收或能产生荧光的特性，不经显色，直接进行扫描测定。,（3）荧光光度法羟基香豆素类成分大多能产生较强烈荧光，用荧光光度法进行测定有较高的灵敏度。当干扰成分较多时，可先用薄层分离，刮取薄层洗脱被测成分后再用荧光光度法进行测定，但本法不及薄层扫描法简便，刮取薄层洗脱时易引起误差。,（4）高效液相色谱法香豆素类成分含有芳香环及其它共轭结构，用HPLC测定时，有较高的灵敏度，常用固定相为C18，流动相为不同比例的甲醇水（5）气相色谱法 某些分子量小、具有挥发性的香豆素类成分，可用气相色谱法测定，如蛇床子素、欧前胡素、香柑内酯、异虎耳草素、花椒毒素、花椒毒酚等成分可用GC测定，常用SE-30石英毛细管柱，FID检测器。,六、单萜及二萜类成分分析 1、含芍药苷中药制剂的分析（1）定性鉴别可用硅胶GF254薄层板分离后于紫外光灯（254nm）下直接观察，但斑点色泽较浅，也可用显色剂显色后进行鉴别。显色剂有：10%硫酸乙醇溶液；5%香草醛硫酸溶液；5%茴香醛-5%硫酸乙醇溶液；稀盐酸；碘蒸气。（2）含量测定具有紫外吸收，但不能产生荧光，在硅胶GF254薄板上可产生暗色斑点，所以芍药苷常用的定量方法为高效液相色谱法和薄层扫描法。,2、含穿心莲中药制剂的分析 结构中含有、不饱和内酯，其紫外吸收光谱为max223nm，可利用此结构特性进行鉴别和含量测定 。定性鉴别：多采用薄层色谱法进行鉴别具有紫外吸收，在硅胶CF254薄层板上呈现暗斑点，也可用硅胶G薄层，用显色剂显色后进行观察。常用的显色剂：A碘蒸气；B2%的3，5-二硝基苯甲酸乙醇溶液与7%氢氧化钾溶液的等量混合液。,穿心莲总内酯的测定 可根据内酯结构在pH=8以上水解开环的性质，用氢氧化钠水解，以酸回滴剩余碱间接测定总内酯含量；穿心莲单体内酯的测定 薄层分离后用紫外分光光度法、薄层扫描、高效液相色谱法测定,应用示例,桂枝茯苓丸中肉桂酸的含量测定处方组成：桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁1、色谱条件和系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1%磷酸溶液（30：70）为流动相；检测波长为285nm。理论塔板数按肉桂酸峰计算应不低于2000.2、对照品溶液的制备：精密称取肉桂酸对照品10mg，置100ml棕色量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀、精密量取5ml，置100ml棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得（每1ml含肉桂酸5ug）。,3、供试品溶液的制备：取本品10g，切碎，混匀，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。4、测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。 本品每丸含桂枝以肉桂酸（C9H8O2）计，不得少于0.072。,第六章 含动物药、矿物药的中药制剂分析,【目的要求】1掌握牛黄含牛黄制剂及含砷、汞药物等的定性鉴别、定量分析方法等。2熟悉熊胆等其他动物药的定性鉴别、定量分析方法。3了解含动物药、矿物药的中药制剂分析应用实例。,药物分析学科,1 含动物药的中药制剂分析,一、牛黄及其制剂分析天然牛黄人工牛黄：由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、胆红素、胆固醇、无机盐等配制而成人工培育牛黄,药物分析学科,1 含动物药的中药制剂分析,一、牛黄及其制剂分析（一）牛黄的化学成分胆色素：胆红素等胆汁酸类：胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸等脂类蛋白质、肽、氨基酸类无机元素,药物分析学科,1 含动物药的中药制剂分析,一、牛黄及其制剂分析（二）胆汁酸的性质和化学反应多以肽（甘氨胆酸、牛磺胆酸）的形式存在溶解性成盐易溶于水游离可溶于乙酸、丙酮、碱液，易溶于乙醇、乙醚,药物分析学科,1 含动物药的中药制剂分析,一、牛黄及其制剂分析（二）胆汁酸的性质和化学反应多以肽（甘氨胆酸、牛磺胆酸）的形式存在溶解性成盐易溶于水游离易溶于乙醇、乙醚， 可溶于乙酸、丙酮、碱液Pettenkofer反应（冰水冷却） -紫色,药物分析学科,胆酸（CA）,一、牛黄及其制剂分析（三）胆红素的性质及化学反应溶解性：溶于苯、氯仿、氯苯、二硫化碳、碱液，微溶于乙醇、乙醚，成盐后易溶于水不稳定性，易被氧化Van den Bergh反应： （重氮化反应）蓝紫色(强酸性)红色(pH2-5)绿色(pH5.5) 重氮化试剂：对氨基苯磺酸,药物分析学科,1 含动物药的中药制剂分析,一、牛黄及其制剂分析（四）定性鉴别,药物分析学科,1 含动物药的中药制剂分析,一、牛黄及其制剂分析（五）含量测定1、胆酸的测定分光光度法-去氧胆酸TLCS-胆酸2、胆红素的测定分光光度法（重氮化反应）HPLC,药物分析学科,1 含动物药的中药制剂分析,1 含动物药的中药制剂分析,二、麝香及其制剂分析（一）化学成分及性质大环化合物甾族化合物胆固醇、酯、蜡蛋白质、肽、氨基酸无机盐其他成分,药物分析学科,麝香酮,（三）定量分析GCHPLC,1 含动物药的中药制剂分析,二、麝香及其制剂分析（二）定性鉴别GC紫外光谱法乙醇提取液220nm,270nm乙醚提取液231nm,265nm正己烷提取液220nm,265nm薄层色谱法,药物分析学科,麝香保心丸中麝香的气相色谱鉴别取本品2g，研碎，加乙醚5ml，振摇，超声处理5分钟，离心，取上清夜，作为供试品溶液。另取麝香酮对照品，加乙醚制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照气相色谱法(附录VI E)试验，以聚乙二醇(PRG)-20M和甲基硅橡胶为混合固定相，涂布浓度分别为1.64%和1.32%，柱长为2m，柱温为180 。分别取对照品溶液与供试品溶液适量，注入气相色谱仪。供试品色谱中应呈现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰。,梅花点舌丸中麝香的薄层鉴别取本品3g，研细，加乙醚10ml，密塞，振摇10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取麝香酮对照品，加乙醇制成每1ml含5mg的溶液，作为对照品溶液。薄层条件： 硅胶G，石油醚-二氯甲烷(2:3)，二硝基苯肼试液,1 含动物药的中药制剂分析,三、蟾酥及其制剂分析（一）化学成分蟾蜍甾二烯游离型-蟾毒配基结合型蟾蜍毒素等强心甾烯蟾毒类吲哚碱类,药物分析学科,蟾毒配基,1 含动物药的中药制剂分析,三、蟾酥及其制剂分析（二）定性鉴别1、显色反应-只针对原料2、PC3、TLC 4、UV,药物分析学科,1 含动物药的中药制剂分析,三、蟾酥及其制剂分析（三）含量测定1、分光光度法（例题P172）差示分光光度法：不经分离直接测定百分吸收系数法：2、TLCS：应用较为广泛3、GC：经过适当的预处理，FID，内标或外标定量4、HPLC：UV检测，灵敏度高,药物分析学科,1 含动物药的中药制剂分析,四、斑蝥及其制剂分析（一）化学成分斑蝥素、脂肪、树脂、甲酸、色素、挥发油、甲壳质、无机元素（二）定性鉴别 （三）定量分析（例题P175）1、理化鉴别 1、TLCS2、PC 2、HPLC3、TLC,药物分析学科,斑蝥素,2 含矿物药的中药制剂分析,一、概述矿物药（天然矿物、生物化石、人类加工品、化学制品） 无机类药材（一）分类含砷的矿物药：雄黄、雌黄、信石、砒霜含汞的矿物药：朱砂、灵砂、轻粉、红粉、白降丹含铅的矿物药：红丹、密陀僧、铅粉、铅霜含铜、铁、钙、硅、硫、氯以及其他矿物药,药物分析学科,2 含矿物药的中药制剂分析,（二）矿物药的分析1、样品的分解和溶解溶解法（湿法）-水、稀酸、浓酸、混合酸等处理熔融法（干法）-碱性、酸性、氧化性熔剂、还原性熔剂2、分析方法容量分析法、重量分析法热分析法，可见分光光度法原子吸收光谱法（AAS）,药物分析学科,2 含矿物药的中药制剂分析,二、含砷矿物药及其制剂分析1、分解硝酸、硫酸等酸性溶剂分解过氧化钠、碳酸钠熔融分解硫酸过氧化氢、硫酸硝酸钾等 分解时，应防止砷化合物挥发而损失。,药物分析学科,雄黄As2S2,雌黄As2S3,2 含矿物药的中药制剂分析,二、含砷矿物药及其制剂分析2、定性鉴别,药物分析学科,硫的鉴别As2S2+2KClO3+3HNO3 2KAsO3+2H2SO4+Cl2+NO2H2SO4+BaCl2 BaSO4(白色沉淀)+2HCl砷的鉴别2As2S2+7O2 2As2O3+4SO2 As2S3+9O2 As2O3+6SO2As2O3+3H2O H3AsO3 H3AsO3+H2S As2S3(黄色絮状沉淀)+H2O,2 含矿物药的中药制剂分析,二、含砷矿物药及其制剂分析3、定量分析1）碘量法硫酸分解直接碘量法H3AsO3+I2 蓝色碱熔分解直接碘量法硫酸过氧化氢分解间接碘量法2）分光光度法（Ag-DDC法）,药物分析学科,H=8淀粉,2 含矿物药的中药制剂分析,三、含汞矿物药及其制剂分析1、含砷矿物药：水银、朱砂、升药、轻粉等等2、分解硝酸分解法王水或逆王水分解法硫酸硝酸钾法 分解时，应防止汞的挥发损失低温加热，加回流冷凝管,药物分析学科,2 含矿物药的中药制剂分析,三、含汞矿物药及其制剂分析3、定性鉴别亚汞盐NH4-/OH- 黑色KI黄绿色