化学发光测定仪教材课件.ppt
上海丰汇生物研究有限公司,化学发光介绍,发光免疫技术,发光免疫技术(luminescence immunoassay, LIA)是将发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。这种方法不仅具有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性,而且还具有分离简便,可以实现自动化分析特点,使之成为医学、生物学研究领域中一种新的重要的免疫学分析手段。,按化学反应类型,化学发光的分类,酶促化学发光： 辣根过氧化物酶系统：丰汇、强生 碱性磷酸酶系统：贝克曼 非酶促化学发光： 吖啶酯系统：雅培电化学发光：罗氏,闪光（Flash）:,按发光持续时间,发光时间在数十分钟以上，如： HRP-Luminol系统 AP-AMPPD系统无须原位进样、 以速率法测量。,发光时间在数秒内，如吖啶酯以原位进样(In Situ Injector) 和时间积分法测量,辉光（Glow）:,时间,发光信号,辉光坪区,速率法测量,原位进样,积分法测量,闪光尖峰,闪光与辉光及其测量方式的差别,发光与化学发光剂,一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射，称为发光 (luminescence)。根据形成激发态分子的激发能可将发光分为三种类型: 1.光照发光 2.生物发光 3.化学发光。,1. 光照发光,发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光 。,电子e,光子,基态,能级,2. 生物发光,典型例子为萤火虫发光。反应底物为萤火虫荧光素 (firefly luciferin)，在荧光素酶(luciferase)的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化萤火虫荧光素 (oxyluciferin)，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。,3.化学发光,化学发光是在常温下经化学反应所产生的发射光。化学发光是一个多步骤的过程，其机制为某些化合物(发光剂或发光底物)可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量(即发光)。,化学发光免疫技术中常用的化学发光剂或发光底物,酶促反应的发光底物 直接化学发光剂 电化学发光剂,1酶促反应的发光底物,酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物，目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），相应发光底物为： HRP的发光底物 ：价格低廉、国内技术成熟 ALP的发光底物 ：价格昂贵、国内无成熟技术,(1) HRP的发光底物,常用的底物为鲁米诺或其衍生物。鲁米诺或其衍生物 鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行。,（2）ALP的发光底物,常用的底物为3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物）。,AMPPD,AMPPD在碱性条件下，被ALP酶解生成相当稳定的AMP-D阴离子，其有2-30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度达到高峰，15 60min内光强度保持相对稳定。,2直接化学发光剂,这类发光剂不需酶的催化作用，只需改变溶液的pH等条件就能发光，如吖啶酯（acridinium, AE）在含过氧化氢的稀碱溶液中即能发光。,3.电化学发光剂,是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+（图19-1）和电子供体三丙胺（TPA）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的Ru(bpy)32+被氧化成三价，成为强氧化剂，TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+，它很不稳定，可自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA.，成为一种很强的还原剂，可将一个高能量的电子递给三价的Ru(bpy)33+使其形成激发态的Ru(bpy)32+.。,3.电化学发光剂,激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出一个波长为620nm的光子，回复到基态的三联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强 。,酶促化学发光免疫分析就是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，通过光强度的测定而直接进行定量。,酶促化学发光免疫分析（双抗体夹心法）,化学发光免疫技术是免疫测定技术继酶免技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光免疫技术（FIA）和时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后发展的一项新兴测定技术。,化学发光免疫技术是一种高度敏感的微量测定技术，凡具有抗原性的物质（包括半抗原）都可以用化学发光免疫技术测定。其起步于80年代初，快速发展于90年代，在国外化学发光免疫技术的应用处于蓬勃发展的阶段。,化学发光免疫技术具备以下特点 ：,高度敏感，极限达10-1710-19M/L，远高于RIA、EIA、TRFIA。特异性强，重复性好C.V.10。测定范围宽，可达7个数量级。试剂稳定性好，无污染有效期612月。操作简单，易于自动化。 在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。,化学发光原理,化学发光检测主要是借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答的物质。抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物质的球蛋白。,化学发光反应基本原理,双抗体夹心法（三明志法）原理,试剂1,酶标记抗体,待测物,超顺磁珠,夹心法的剂量-反应关系曲线,信号强度（Y）,线性范围,待测物浓度（X）,Hook(前滞)效应,分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）： S0+2SD在该曲线上所对应的浓度值。功能灵敏度： 测定误差（变异）20%的最低可检测浓度。线性范围： （分析）功能灵敏度-变异20%的最高检测浓度相关系数0.99的曲线范围,竞争法的原理,待测物,试剂1,酶标记抗原,超顺磁珠,竞争法的剂量-反应关系曲线,待测物浓度（ X ）,信号强度（ Y ）,线性范围,分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）： S0-2SD在该曲线上所对应的浓度值功能灵敏度： 测定误差（变异）20%的最低可检测浓度线性范围：（分析）功能灵敏度-变异20%的最高检测浓度相关系数0.99的曲线范围,发光免疫分析基本操作步骤（一步法）,待测样品,酶标记抗体或抗原,磁场中洗涤去除未结合的反应物,发光底物,仪器检测,反应管,反应10分钟,反应0-5分钟,超顺磁珠,标记生物素的抗体或抗原,发光免疫分析基本操作步骤（二步法）,待测样品,洗涤去除未结合的反应物,发光底物,仪器检测,反应管,反应10分钟,反应0-5分钟,酶标记抗体或抗原,洗涤去除未结合的反应物,反应10分钟,超顺磁珠,标记生物素的抗体或抗原,化学发光的应用,传染性疾病的检测：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、anti-HCV、HIV等甲状腺功能检测：TT3 、TT4 、T3 、T4 、TSH糖尿病检测：INS、C-P等肿瘤标志物检测：AFP、CEA、PSA、fPSA、NSE、CA50、CA12-5、CA15-9、CA19-9等性腺激素检测：E2、Testo、Prog、PRL、FSH、LH、HCG 等,各品牌对比,各品牌对比(续上表）,丰汇化学发光测定仪,磁 力 清 洗 站,十 二 步 清 洗 工 作 站,独 立 的 搅 拌 系 统,独创永 久 性 反 应 装 置,高精密度单光子计数系统,单光子计数器是目前高灵敏度发光检测仪的核心部件,光电倍增管,高压,高速放大器,高速比较器,高速分频器,发光样品产生光子,激发光阴极产生光电子,在阳极上形成较强信号,脉冲信号,相对发光单位数字脉冲(RLU),在各打拿极之间得到能量和数目的倍增,高精密度微量加样系统,精 准 的 加 样 手 系 统,丰汇全自动液相化学发光检测系统,具有完全自主知识产权；速度快：全球最快的全自动化学发光，最高恒速可达600test/小时，目前雅培i2000理论速度为200test/小时实际速度为165test/小时左右；罗氏的电化学发光理论速度为180test/小时，实际速度150test/小时左右；全球首创永久性反应杯：无一次性耗材（如一次性反应杯、TIP头等），大大节省用户成本。,独到、灵巧的暗室设计结构为快速、准确检测反应结果创造了有利条件；采用高灵敏度的PMT（光电倍增管）检测系统。可以达到快速检测，检测结果稳定，灵敏度高，设备运行无成本维护； 样品针采用特殊清洗方式，杜决交叉污染；,独立的磁珠试剂搅拌工作站，磁珠试剂分布更加均匀，杜绝交叉污染；维护成本低、无一次性耗材，采用永久反应杯，无需更换；操作简单方便，检测速度快，大大减小医护工作者的劳动强度；仪器成本适中，适合各级别医院使用，市场潜力巨大；,Thank you!,上海丰汇,
