发酵工程2(菌种选育)课件.ppt

第一章 微生物菌种选育,菌种选育：利用微生物的遗传变异的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传性状。自然选育：根据菌种自然变异的特点进行选育的过程。人工选育：人为方式改变微生物菌株遗传物质选育过程，包括诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程育种等高新技术。,第一节 菌种的来源,一、工业发酵常见微生物种类细菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌,最常用的工业微生物,酵母菌酿酒酵母假丝酵母属产朊假丝酵母解脂假丝酵母热带假丝酵母毕赤酵母属、汉逊酵母属,最常用的工业微生物,霉菌曲霉属米曲霉黑曲霉青霉属青霉菌：点青霉、产黄青霉桔青霉根霉属德氏根霉米根霉、小麦曲根霉红曲霉属紫红曲霉,最常用的工业微生物,放线菌链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌,担子菌菇类多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。藻类自养微生物人类的保健食品和饲料。,担子菌菇类多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。藻类自养微生物人类的保健食品和饲料。,担子菌菇类多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。藻类自养微生物人类的保健食品和饲料。,二、工业微生物的来源,根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 从一些发酵制品中分离目的菌，如从酱油中分离蛋白酶产生菌；从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶产生菌。,三、微生物菌种的选择性分离,菌株分离就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，进而得到所需微生物的过程。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需菌株；二是把分离的菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。菌株的分离和筛选：采样、富集、目的菌筛选等。,1.采样以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。纤维素酶产生菌选择枯枝落叶富含纤维素的森林土；淀粉酶产生菌选择面粉厂、酒厂、糕点厂等场所的土壤；蛋白酶和脂肪酶产生菌可选择肉类加工厂附近污泥等。,从自然界筛选,采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。,2.富集培养,富集培养可增加待分离菌的数量，增加分离的成功率。为了容易分离到所需的菌种，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖、淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。,为提高分离的效率, 常以投其所好和取其所抗的原则在培养基中添加特殊的养分或抗菌物质, 使所需菌种的数量相对增加, 这种方法称为增殖培养或富集培养, 其实质是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌, 便于将它们从样品中分离。 例如分离放线菌时，在土壤样品悬液中加入数滴10的酚，可抑制霉菌和细菌的生长。,富集的主要方案：,定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。控制营养和培养条件增加目的微生物数量，也可高温高压、加入抗生素等减少非目的微生物的数量。,目的微生物富集的一些基本方法,富集的目的：,让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,定向培养的富集方法,1.底物,2.pH条件,3.培养时间,4.培养温度,等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批、连续）后使目的微生物在种群中占优势。,菌落的选出,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基,利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素,从形态的角度,菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选,采样（造纸 厂）,80、30min处理,文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌,0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5、培养34天，选择有凹陷圈的菌落,从285个土样中获得62株,26株为组成型,36株为诱导型,3.培养分离,尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化，在固体培养基平板上获得单菌落。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。,分离的效率取决于培养基养分、pH、温度和加入的选择性抑制剂。嗜中性放线菌分离培养基pH常在6.77.5，嗜酸性放线菌pH降至4.55.0。放线菌筛选时，可加入真菌抗生素，对放线菌无作用。分离放线菌分离平板通常在2530培养。嗜热菌4555 ，嗜冷菌410 。,4.筛 选,平板上单菌落，通过菌落形态观察，进行菌落鉴定，符合要求，转移到试管斜面进行纯培养。采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。,5.毒性试验,自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。,第二节 菌种的选育,一、菌种选育意义：发酵产品的种类、产量和质量有较大的改善二、菌种选育的定义： 根据微生物遗传物质极易发生变异特性，用人工方法造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。三、常用菌种的选育方法： 1）自然选育； 2）诱变育种； 3）杂交育种； 4）分子育种,四、自然选育,1.自然选育 在生产过程中，不经人工处理，利用菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。但突变的频率较低。2.自然突变的两种可能 菌种衰退，生产能力下降； 代谢更加旺盛，生产性能提高。3.自然选育的方法单菌落纯种分离,五、诱变育种（Mutation breeding）,1.诱变育种的含义 应用微生物遗传和变异理论，用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群, 促进其突变率大幅度提高, 然后采用简便、快速和高效的筛选方法, 从中挑选少数符合育种目的的突变株, 以供生产实践或科学研究用。,诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等特点，仍是目前被广泛使用的主要育种手段。 当前发酵工业中使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外, 还可达到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。,2.诱变育种的一般步骤,1）出发菌株的选择2）单细胞（或单孢子）悬液制备3）诱变剂和使用剂量的选择4）变异株的初筛5）变异株的复筛6）变异株稳定性试验7）菌种特性考察8）中试验证9）大型投产试验,1）出发菌株的选择,用来育种处理的起始菌株称为出发菌株。 出发菌株的来源主要有以下三方面： 自然界直接分离到的野生型菌株 这些菌株的特点是它们的酶系统完整, 染色体或DNA未损伤，但它们的生产性能通常很差(这正是它们能在大自然中生存的原因), 通过诱变育种, 它们正突变(即产量或质量性状向好的方向改变)的可能性大。,经历过生产条件考验的菌株 这些菌株已有一定的生产性状, 对生产环境有较好的适应性, 正突变的可能性也很大。 经历多次育种处理的菌株 这些菌株的染色体已有较大的损伤,某些生理功能或酶系统有缺损, 产量性状已经达到了一定水平，它们负突变(即产量或质量性状向差的方向改变)的可能性很大，可以正突变的位点已经被利用了，继续诱变处理很可能导致产量下降甚至死亡。,因此，在实际生产中，一般可选择或类菌株, 尤以第类最佳, 因为它可以向好的方向发展。 在抗生素生产菌育种中，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有所提高的菌株作出发菌株，在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，最好考虑至少能积累少量产品或其前体的菌株。,2）单细胞（或单孢子）悬液制备,诱变处理的菌株应考虑微生物的生理状态、菌株的均一性和环境条件。 适合用于诱变育种的微生物生理状态： 一般要求细菌和酵母菌体处于对数生长期, 并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。 对产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢，因此，霉菌和放线菌应处于单细胞状态，即形成孢子的时期，对孢子进行诱变。,为什么霉菌和放线菌用孢子进行诱变处理？,1.能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂；2.它尽可能地避免出现表型延迟现象 表型延迟(Phenotypic lag)是指某一突变在 DNA复制和细胞分裂后, 才在细胞表型上显示出来, 造成不纯的菌落的现象。出现这种现象的原因是诱变对象处于多核时期造成的。,霉菌和放线菌对数期细胞往往是多核的, 很可能一个核发生突变, 而另一个核未突变, 若突变性状是隐性的, 在当代并不表现出来, 在筛选时就会被淘汰; 若突变性状是显性的, 那么, 在当代就表现出来, 但在进一步传代后, 就会出现分离现象, 造成生产性状衰退, 因此，应尽可能选择孢子或单倍体的细胞作为诱变对象。 即使如此, 有时也会出现表型延迟现象, 这是因为诱变剂往往只作用于DNA分子的一条单链，DNA 进一步复制后, 同样会出现不纯的菌落。这类表型延迟称为分离性延迟现象。,菌株的均一性 菌悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞 机会均等并充分地接触，避免细胞团中变异菌 株与非变异菌株混杂，出现不纯的菌落，给后 续的筛选工作造成困难。 为避免细胞团出现, 可用玻璃珠振荡打散 细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤, 得到分散 的菌体。,菌悬液的细胞浓度一般控制为: 真菌孢子或酵母细胞 106107 个/ml； 放线菌或细菌 108个/ml。 菌悬液一般用生理盐水(0.85% NaCl)稀释。 有时用化学诱变剂处理时，需要0.1mol/L 磷酸缓冲液稀释, 因为有些化学诱变剂处理时, 常常会改变反应液的pH值。,3）菌种诱变剂和使用剂量的选择,诱变剂的含义： 凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素， 统称为诱变因素或诱变剂。 分类： 物理诱变，如紫外线、-射线、X-射线、 快中子、激光、等离子体、高压等 化学诱变，如硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝酸、碱基类、吖啶类物质等,诱变剂量的选择： 一般来说，诱变率随诱变剂量的增高而提高，因此，通常诱变剂量采用致死率90%99%的剂量，但是，对于经过一再诱变的高产菌，诱变剂量要低得多（致死率在90%99%）。 诱变处理的方法： 单一处理：一次用一种的诱变剂处理方法处理菌种 复合处理：两种以上的诱变处理方法处理菌种，这种处理方法通常较单一处理的效果好。,诱变剂复合处理及协同效应,单独处理 复合处理菌种 诱变剂 突变率 诱变剂 突变率土曲霉 紫外线 21.7 紫外线 + X射线 42.8 X射线 19.7黑曲霉 氮芥0.1 不明显 氮芥 + 紫外线 11.0 紫外线 4.7链霉菌 二乙烯三胺 6.06 二乙烯三胺 + 紫外线 26.6 硫酸二乙酯 1.78 硫酸二乙酯 + 紫外线 35.86 紫外线 12.5,某些化学诱变剂常用浓度及处理时间,诱变剂 浓度 处理时间(min) 中止方法二乙酯 0.11% 1824 硫代硫酸钠或稀释亚硝基胍 0.13/ml 60120 大量稀释,4）突变株的筛选,菌体细胞经诱变剂处理后, 要从大量的变异菌株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来, 这需要有明确的筛选目标和筛选方法, 需要进行认真细致的筛选工作。 育种工作中常采用随机筛选和理性化筛选这两种筛选方法。,随机筛选：,菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，在随机挑选单菌落中筛选出高产菌株。该方法工作量极大。为了提高筛选效率, 可采用下列方法增大筛选量。 （1）摇瓶筛选法； （2）琼脂块筛选法； （3）筛选自动化； （4）筛选工具微型化。,（1）摇瓶筛选法,这是生产上一直使用的传统方法。 将挑出的单菌落传种到斜面后, 由斜面接入模拟发酵工艺的摇瓶中培养, 然后测定其发酵生产能力。 选育高产菌株的目的是要在生产发酵罐中推广应用，因此摇瓶的培养条件要尽可能和发酵生产的培养条件相近。 摇瓶筛选的优点是培养条件与生产培养条件相接近 , 但工作量大、时间长、操作复杂。,（2）琼脂块筛选法,这是一种简便、迅速的初筛方法。将单菌落连同其生长培养基(琼脂块)用打孔器取出, 培养一段时间后, 置于鉴定平板以测定其发酵产量。 琼脂块筛选法的优点是操作简便、速度快，但是固体培养条件和液体培养条件之间是有差异的，利用此法所取得的初筛结果必须经摇瓶复筛加以验证。,（3）筛选自动化和筛选工具微型化,近年来, 在研究筛选自动化方面有很大进展, 筛选实验实现了自动化和半自动化, 省去了繁琐的劳动, 大大提高了筛选效率。 特别是筛选工具的微型化很有意义。 例如将一些小瓶子取代现有的发酵摇瓶，在固定框架中振荡培养，可使操作简便，又可加大筛选量。,随机筛选的方法的局限性,传统的菌种选育采用随机筛选的方法。 由于正变株出现的几率小, 产量提高的范围往往在生物学波动的范围内, 因而选出一株高产菌株需要耗费大量的人力、物力。而且, 随着发酵产量不断提高, 用随机筛选方法获得高产菌株的几率越来越小。 近年来, 随着遗传学、生物化学知识的积累, 人们对于代谢途径、代谢调控机制了解得更多了解, 因而筛选方法逐渐从随机筛选方法转向理性化筛选方法。,理性化筛选,理性化筛选是指运用遗传学、生物化学的原理, 根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法, 以打破微生物原有的代谢调控机制, 获得能大量形成产物的高产突变株的筛选方法。 根据微生物的代谢产物不同，理性化筛选的方法也有所不同，它包括： （1）初级代谢产物高产菌株的筛选 （2）次级代谢产物高产菌株的筛选,（1）初级代谢产物高产菌株的筛选,根据代谢调控的机理, 氨基酸、核苷酸、有机酸、维生素等小分子初级代谢产物的合成途径中普遍存在着反馈阻遏或反馈抑制。 育种工作的目的就是要打破微生物原有的这种反馈调节系统。 可从以下两个方面着手可达到目的： 降低终产物浓度； 筛选抗反馈突变株。,（2）次级代谢产物高产菌株的筛选,次级代谢产物是微生物为了避免在次级代谢过程中某些中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢产物。 因此，可筛选某些营养缺陷型或初级代谢产物结构类似物抗性突变株以消除初级代谢产物对那些初级代谢和次级代谢所需的共同中间产物的反馈调节，使其大量积累，有利于次级代谢产物的合成。,营养缺陷型突变株：由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节被解除。只要在培养基中限量加入所要求末端产物，克服生长障碍，就能使中间产物积累。结构类似物抗性突变株：对末端代谢物及其结构类似物的反馈抑制不明显，或对其反馈阻遏有抗性，或两者兼而有之的菌株。这种菌株由于末端代谢物反馈调节的功能丧失，故而能大量积累末端代谢产物。,从以下几方面着手可达到目的：,筛选营养缺陷型突变株筛选负变株的回复突变株筛选去磷酸盐调节突变株筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株筛选二价金属离子抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选自身所产抗生素抗性突变株,3.诱变育种的基本步骤和原则,诱变处理,出发菌株,菌株性能考察,摇瓶筛选,中间试验,工业性试验,重复数轮,基本步骤,诱变育种的基本步骤总结：,1）选择出发菌： 分离纯化获得活化菌株1-2株（先平板分离，然后斜面培养：一般细菌培养12天，真菌形成大量的孢子）,2）第一轮诱变处理和突变株的筛选,细胞或孢子悬液进行活菌计数；进行单一或复合处理诱变剂处理；对处理后的菌悬液进行平板分离，活菌计数确定诱变处理致死剂量；挑选单菌株接种到斜面（200株）。摇瓶初筛，以出发菌株为对照，选出正突变株50株） 摇瓶复筛（最终确定稳定的突变株5株，作为第二轮诱变育种的出发菌株）,第二轮诱变（第一轮的五株菌株）：,方法和步骤与第一轮相同，将初筛出的5株菌株全部进行诱变处理。 每一菌株第二轮诱变后，平板分离，挑取40个单菌落，共挑取菌落405个； 摇瓶初筛选出50株； 摇瓶复筛选出5株； 若产率不高，还必须进行第三轮诱变育种。,3)菌种特性考察,菌株稳定性试验:传代10代以上。考察变异株产率是否发生较大的变化。菌种其他特性考察4）中试验证 5）大型投产试验 经过上述实验，获得的高产菌株，方才可用于工业上大规模生产。,菌种育种举例,从土壤中分离、诱变及随机筛选柠檬酸高产菌种选育过程。,一、从土壤中筛选产柠檬酸的黑曲霉菌株1.确定筛选产柠檬酸的菌种种类，采集样品： 取霉腐土层，筛选黑曲霉菌株。2.选择合适的培养和纯种分离的方法： 固体稀释平皿倾注法分离土壤中的黑曲霉，在平板培养基中添加碳酸钙，待培养长出菌落后，挑取透明圈大的菌落于斜面。3.挑选产酸的单菌落斜面菌种，进行生产性能的测定：即确定所筛选的黑曲霉菌株产的是柠檬酸。,二、菌种的诱变育种,1.将黑曲霉接种于斜面活化；2.制备出发菌孢子悬液并进行活菌计数； 3.诱变剂处理： 可先单一，后复合处理： 1）物理因子：紫外线诱变和射线诱变处理；2）化学因子：硫酸二乙酯、亚硝基胍处理；,3.用加碳酸钙的平板分离诱变处理后的孢子，待菌落长出后，挑取平板上透明圈较大的单菌落200个于斜面培养基，300C培养长出孢子后，进行摇瓶初筛。4.摇瓶初筛：5.摇瓶复筛： 若产率不高，还必须进行第二轮诱变育种。,三、变异株稳定性试验： 转接10代，考察传代后，各代菌株柠檬酸生产率是否有较大的变化；四、菌种特性考察，菌落特征、菌丝形态及产生孢子的情况进行考察；五、中试验证菌种是否适合工业化生产； 六、大型投产试验，进行工业化生产 。,六、杂交育种（Hybridization breeding）,1.杂交育种 指两个不同基因型的生物通过结合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选到具有新形状的菌株。 人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖或原核微生物的接合、 F因子转导、转导和转化等过程, 使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组, 以获得性能优良的生产菌株。这也是一类重要的微生物育种手段, 比起诱变育种, 它具有更强的方向性和目的性。,细菌杂交育种,在细菌中实现杂交的种类主要是大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。 大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-。 F因子存在于细胞中形式：游离状态(F+细胞)；整合状态，即F因子插入胞核质的一定位置上(Hfr细胞)。 F因子有明显感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。,酵母杂交,运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。 酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法。 就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。,2.原生质体融合育种,用脱壁酶（细菌和放线菌用溶菌酶，酵母和霉菌用蜗牛酶和纤维素酶）去除微生物的细胞壁，制成原生质体，用聚乙二醇促进原生质体融合，从而获得异核体的这一技术叫原生质体融合。 原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。 原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。,原生质体融合育种的特点, 杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。 受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。 遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。 有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 提高菌株产量的潜力较大。 有助于建立工业微生物转化体系。,原生质体融合步骤：,标记菌株的筛选:营养缺陷型和抗药性标记原生质体的制备：脱壁酶脱壁原生质体的融合：聚乙二醇促进融合原生质体的再生：再生培养基培养再生壁融合子的选择：选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。生产性能筛选。,标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。,原生质体的制备,在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。 在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。,影响原生质体制备的因素,1)菌体的前处理： 为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。 2)菌体的培养时间： 为了使细胞易于原生质体化，一般选择对数增殖期的菌体。,3)酶浓度： 对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。 另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。,4)酶处理温度5)破壁时的pH值6)渗透压稳定剂： 等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。,原生质体融合聚乙二醇（PEG）能有效促进融合。由于细胞强烈脱水而使原生质体粘在一起，并形成聚合体。接触面积增大。细胞膜结构发生紊乱，加大细胞膜的流动性，原生质体相互融合。PEG的使用浓度范围3050%。物理融合剂：电场、激光等。,融合体再生融合体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。细菌再生率310%，真菌再生率2080%，链霉菌再生率50%。若要获得较高再生率，应避免强力动作使之破裂。原生质体悬液浓度不宜过高，因如有残存菌体存在，将首先长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。菌龄、温度、溶菌酶用量和溶壁时间都会影响再生。,筛选优良性状融合重组子来自两亲代的遗传物质经过重组而形成的子代称为融合重组子。重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别，如两亲株为营养缺陷型A+B-和A+B-，融合重组子应是A+B+或A-B-。直接法：将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子高渗再生培养基平板上，直接筛出原养型重组子。,间接法：把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生多种多样的基因组合，可得到多种类型的重组子。还需进行生理生化测定及生产能力测定，以确定重组子是否缝合育种要求。,第三节 基因工程育种,一、基因工程育种的含义 基因工程育种是分子水平上的育种方法。根据需要，用人工的方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转移到受体细胞使其复制、转录和翻译，表达出供体基因原有的遗传形状。,二、基因工程育种的一般步骤,1.分离和纯化目的DNA片段2.制备载体DNA片段：质粒、噬菌体3.连接目的和载体DNA片段4.转化连接有目的DNA片段的载体到受体菌；受体菌通常为大肠杆菌、酵母菌5.工程菌的筛选,基因工程,1.基因分离提取目的基因密度梯度超速离心等方法分别提取所需要的DNA（目的基因）和作为载体的松弛型细菌质粒。处理目的基因加入专一性很强的限制性核酸内切酶进行处理，从而获得带有特定基因并暴露出黏性末端的DNA单链部分。,2.体外重组 目的基因 56 DNA连接酶 环状重组体 细菌质粒 混合“退火” （复制能力） 3.载体传递 通过载体把供体的遗传基因导入到受体细胞内。载体需具有自我复制的能力。,4.复制和表达 通过自我复制得到扩增，并使受体细胞表达出供体细胞所固有的遗传特性，成为“工程菌” 5.筛选和繁殖 目前分离纯净的基因功能单位还很困难，所以要设法筛选出所需要性状的个体，然后才加以繁殖和利用。,三、基因工程菌生产的产品人胰岛素、人生长激素、干扰素、疫苗、单克隆抗体及诊断试剂等；氨基酸类、工业酶、头孢菌素C、抗生素等。,第四节 菌种的保藏与复壮,一、菌种保藏的意义菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。,二、菌种保藏的原理,菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。,A .斜面低温保藏法（酵母） 斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月。B.石蜡油封存法（酵母） 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。,三、菌种保藏的方法,C.沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌 ） 这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢的微生物。它的制备方法是： 首先，将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为l2l混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左右，121C间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用80目过筛，土用30100目过筛。 其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。 一般保存期为1年左右。,D.真空冷冻干燥保藏法（细菌，防线菌 ）,目前常用的较理想的一种方法。 基本原理是在较低的温度下（-15），快速她将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。 因此，菌种可以保存很长时间，一般5年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地应用。,基本操作过程是先将微生物制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，并低温保藏。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。,E.液氮超低温保藏法（细菌，真菌） 液氮超低温保臧法是近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法。其保存期最长。a.原理 用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达一196，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（一130），所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。,b.操作方法及步骤 （1）安瓿管要求 由于液氮保存于超低温状态，所使用的安瓿管需能承受大的温差而不致于破裂，一般用特质玻璃管，安瓿管选好后印上标记，加棉塞后灭菌，烘干后备用。 （2）菌种准备及分装 因为液氮法菌种要经受超低温的冷冻过程。所以也需要保护剂，常用的保护剂为10甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓶管中，一般安瓿管的装量为0.21mL。,（3）冻结 液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。 美国ATCC采用先将菌液降温到0，再以每分钟降低1的速度，一直降低到38，然后才把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升，冰晶状态发生变化，从而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮的残存量，定期补加。,（4）重新培养 当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或3540水浴中迅速解冻，当升温至0时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。 国内目前已有部分单位采用液氮法保存菌种。,二、菌种的衰退与复壮,1.菌种衰退 菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些生理性状和形态特征变弱或消失的现象。 生理上常指菌种发酵能力的降低，或抗噬菌体能力下降；形态上表现为分生孢子的减少或菌落颜色的改变；高产变异株表现出恢复野生型性状。,2.菌种退化的原因 基因突变：经常处于旺盛生长状态的细胞比休眠细胞发生突变的概率大。发酵生产常用营养缺陷型菌株，发生回复突变就会使产量下降。某些菌株合成抗生素，菌体发生质粒脱落而出现大量光秃型菌落，则生产能力下降。,变异菌株性状分离：诱变的单菌落是由一个以上孢子或细胞形成，但只有一个孢子或细胞高产，传代时高产菌株数量减少，产量也就下降。菌落由一个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞，诱变中核的变化不一样，传代和核的分离也会使形状表现多样化，产量也随之变化。即使单核孢子发生突变时，双链DNA上仅一条链上某个位点发生变化，经移种后性状也分离。,连续传代：经过多次传代，退化细胞在数量上占优势，退化性状表现逐步明朗化，最终成为一株退化菌株。每移种一代，退化细胞的优势更为显著，从而导致退化。,其它因素：菌种保藏（温度、湿度），基因突变率随温度减低而减少；生长条件不满足（培养基组成、培养条件），如产腺苷的黄嘌呤缺陷型菌株，在培养基中加入黄嘌呤、鸟嘌呤和苏氨酸可降低回复突变率。,3.防止菌种退化的措施：合理的育种（单核，诱变剂，分离纯化）选择合适的培养条件（限制容易利用的葡萄糖）创造良好的培养条件（原种生长条件，低温、干燥、缺氧）控制传代次数（降低传代次数，减少自发突变）利用不同类型的细胞进行移种传代（放线菌和霉菌，采用孢子接种）选择合适的保藏方法（斜面保藏同时采用沙土、冻干和液氮等长期保藏手段）菌种稳定性检查 分离复壮,4.菌种复壮使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性。狭义菌种复壮：通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的个体中找出尚未衰退的个体，从而达到恢复该菌原有典型性状的母的。（消极）广义菌种复壮：在菌种的生产性能尚未衰退前，就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，从而逐步提高菌种的生产特性。（积极）,复壮措施：对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化淘汰衰退的个体选择合适的培养基,纯种分离：（自然分离法）把衰退菌种的细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，通过扩大培养可以恢复菌种的原有性状。淘汰衰退的个体：芽孢产生菌经高温（80）处理，则不产芽孢的个体被淘汰。,选择合适的培养条件：添加剂加入形成综合培养基。 1.一定培养条件进行单细胞分离纯化； 2.用高剂量UV（紫外线）和低剂量NTG（亚硝苯甲醛脲）联合对退化菌株进行处理，可得较多纯菌落； 3.寄生型微生物的退化菌株可接种到相应壮寄主体内以提高菌株的活力。,思考题,1、名词解释多因素低剂量的诱变效应、互变异构效应、染色体畸变、基因突变、表型延迟、营养缺陷型、杂交育种、原生质体融合、原生质体再生、菌种的扩培、接种量、菌种退化、菌种复壮2、采集土壤微生物样品时应该注意哪些问题？3、什么是增殖培养？为什么要进行增殖培养？4、土壤中分离纯化微生物的方法有哪些？请简述之。5、什么是微生物的初筛？请例举两种初筛方法，并简述之。6、菌种保藏的原理是什么？常见的军种保藏方法有哪些？7、菌种退化的原因有哪些？简述防止菌种退化的措施。8、常见的菌种复壮措施有哪些？,