工程合成生物构建技术2014课件.ppt
现代制药工艺学-生物制药工艺研究,赵广荣2014-10-22,现代制药工艺学-生物制药部分的基本要求,(1) 了解前沿进展(2) 掌握基本原理和技术(3) 能设计相关工艺实验研究的技术方案(4)重点掌握授课内容(5)下载相关文献,掌握其中核心知识和技术,主要内容,第一讲 工程生物的构建原理与技术第二讲 青蒿素前体的合成生物技术第三讲 重组人干扰素产品创新与工艺研究,工程生物 engineered organisms,通过基因工程、转基因、合成生物学等工程技术创造的生物重组微生物，合成微生物转基因植物转基因动物,工程生物,1998-2002年，欧盟第五框架计划实施细胞工厂(cell factory)项目，其目的是全面了解应用微生物。美国：生物学角度，最小基因组(minimized genome)是由一套生物生存必需的最小基因组成。日本：2001年，从工业应用角度，具有最小基因组的工业微生物就是最小基因组工厂（minimized genome factory）。最小基因组工厂是具有工业生产必需基因，而非必需基因和有害基因已经被删除的微生物。它不仅简单，而且是又容易工业过程控制。2002年创办国际刊物Microbial Cell Factories，报道微生物细胞作为重组蛋白、天然产物的生产者，或生物转化的催化剂等方面的研究进展和论文。中国：2010年以后，人工细胞工厂，人工生物体系，人工生物系统,最小基因组工厂,继人类基因组研究之后，生物领域一热门学科，是整体系统论生物学思潮在工程学领域的再现。,合成生物学（synthetic biology）的概念,合成生物学,按照人类的目的设计并创造新的生命元件器件，功能模块乃至自然界不存在的生命系统; 对现有的生命体进行有意义的工程改造，赋予其新的功能。合成生物学的核心思想是，认为生命的所有元件都能由化学方法来合成制造，并进而通过工程化方式组装成实用的生物体。,1911：柳叶刀，出现“合成生物学”2000年以后，迅速发展，注意力转向该领域2004年（MIT）TechnologyReview，合成生物学评为“将改变世界的十大新技术”之一2004年开始，全球iGEM比赛（大学生遗传机器作品）2004年6月：MIT，第1届合成生物学国际会议(SB 1.0)2005年5月：UC伯克利,SB 2.0；2007年6月，瑞士，SB 3.02008年10月：香港，SB 4.0；2011年6月: Stanford U,SB 5.02013年7月，英国伦敦，SB 6.02012年，ACS Synthetic Biology,合成生物学的学术交流,合成生物学,概述,2002年Cello 等合成脊髓灰质炎病毒的cDNA（Science, 2002，297：1016-1018），2005年Endy等合成噬菌体T7基因组（Mol Systems Biology，2005，1：1-10）2007年Craig J.Venter研究所（CJVI）实现了基因组的物种间人工移植（Science，2007，317:632-638）2008年该所人工全合成了生殖衣原体细菌基因组（Science, 2008，319：1215-1220）2009年利用酵母对克隆的基因组进行工程化组装（Science, 2009，325:1693-1696），2010年CJVI合成活细菌2011年合成酵母染色体臂2014年，合成酵母III号染色体,基因组合成的技术发展,从头合成DNA的里程碑事件,1955, 二聚体 dTdT (2 nt)1968, 酵母丙氨酸转移RNA (77 nt) 1981, 人干扰素a (514 bp)2002, 脊髓灰质炎病毒 (7501 bp)2004, 6脱氧红霉素内酯B合成酶基因簇DEBS (31656 bp)2008, 支原体基因组(582 970 bp)2010, 支原体细菌2014，酵母染色体,基因组工程,基因组合成,基因合成,合成生物学,合成生物的单元合成生物的设计与优化,生物元器件,生物元器件,合成生物学与计算机工程的层阶比较,合成生物学,1、基因元件基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的DNA，是设计和合成生物的基本单位。特性：信号接受和输入功能，信号发送和产物输出功能，调节信息流、代谢和生物合成的功能，和其他元件相互作用，具有特定的工作环境。功能元件：编码1个/组生化反应酶功能基因/基因簇；编码组成细胞组分蛋白质的基因界面调控元件:包括功能基因转录、蛋白质翻译与修饰、功能酶反应等的调控基因。,合成生物的单元,合成生物学,生物元器件,基因元件的图形编码-制图,复制子,启动子,阻遏子,诱导子,终止子,RBS,功能基因,MCS,抗性,合成生物学,生物元器件,基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的DNA，是设计和合成生物的基本单位。,生物部件：由一个或多个基因元件组成最简单的能行使催化功能的生物部件是完整的编码酶基因表达盒。,启动区,功能基因,终止区,合成生物学,生物元器件,生物模块是一组细胞内区域化的生物部件，由内在功能联系在一起，执行特定的复杂功能。如代谢途径、信号转导途径、调控途径等。模块：通过某种（逻辑/功能）关系把生物元件连接而成与电子科学中的电路类似，在合成生物学，不同功能的生物砖联接后，能像电路一样运行，形象地称为基因线路（genetic circuit）。按功能分为:代谢线路,调控线路,信号线路等,生物模块与基因电路,合成生物学,生物元器件,Endy D提出了合成生物学设计的工程策略：标准化、解耦联和抽提。标准化：确立基本生物元件的方法、对生物功能的定义和特征描述。解耦联：复杂系统解分成具有独立功能的简单组分。抽提：建立元件和模块的层阶。,合成生物的设计与优化,合成生物学,生物元器件,抽提：一个反应对应一个酶，一个酶对应一个基因。功能模式：基因表达调控的操纵子模型。优化：功能基因密码子、启动子、核糖体结合位点。适合于不同宿主表达的生物元件。,1、生物元件的设计与优化,合成生物学,生物元器件,生物砖构建基因电路的困难是，把相同功能的不同生物来源的生物砖集成基因电路后，不一定具有功能。优化方法可以是基于数学模拟的理性设计，也可以是生物元件的直接进化。,2.基因电路的设计与优化,合成生物学,生物元器件,iGEM（International Genetically Engineered Machine）竞赛，在美国麻省工学院（MIT）收集每年参赛者贡献的生物元器件，建立了标准生物元件库（Registry of Standard Biological Parts）(http:/parts.igem.org)。经过10年的收集，该文库的元器件以BBa为字头，容量已达到约2万个。,生物元件库,合成与装配,数据库RegulonDB中，大肠杆菌天然操纵基因中有1000余个启动子，及其他功能元件序列。数据库BIOFAB（International Open Facility Advancing Biotechnology，http:/biofab.org/data）有数千个人工合成并表征的启动子、核糖体结合位点等元件。天津大学生物信息学中心建有必需基因数据库（http:/,生物元件库,合成与装配,合成生物学的研究与应用,自然细胞,基因组（庞大）,人工细胞,细胞网络（松散）,细胞网络（紧凑）,合成,简化,解耦,ATCG,合成生物学的研究思路,底盘细胞,能源/药物,底盘构建,重构,自然细胞新功能/用途人工合成新生物系统,模块设计,抽提,工程生物构建的基本过程,基因元件设计,基因线路合成,制药工程生物,功能底盘细胞,遗传转化,底盘细胞设计,基因组编辑,基因元件合成,适配性筛选,氨基酸，维生素，抗生素，抗癌药物，聚酮，萜类等,第一讲 工程生物的构建原理与技术,DNA体外重组技术/基因工程生物元件的组装技术/元件工程基因组的编辑技术/基因组工程,体外重组是把不同来源的DNA分子用特异性酶切割，然后将两者连接成杂合分子。体外重组的两大工具:核酸限制性内切酶和连接酶，如同剪刀和胶水。,DNA 片段1DNA 片段2,酶切,可连接的片段,载体,重组DNA分子,连接酶,DNA元件的体外重组,基因的体外重组,基因重组示意图,载体/质粒酶：限制性内切酶，连接酶，聚合酶,DNA体外重组工具,基因元件载体,载体/质粒Vector：基因的携带者,复制起始点选择标记多克隆位点,质粒载体,基因元件的载体,1.结构,自主复制性:复制起始点以及控制复制频率的调控基因。不相容性:具有相同或相似复制子结构及特征的的质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。转移性：从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞。选择标记：抗生素抗性基因等。表达功能:能转录、翻译合成外源基因的产物。,基因元件的载体,2.质粒的特性,克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。测序质粒：用于基因测序。整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。表达质粒：能表达基因产物。,基因元件的载体,3.质粒的类型,噬菌粒载体：由丝状噬菌体DNA复制起始位点序列与质粒组成的杂合分子。M13噬菌体间隔区克隆到质粒上，形成噬菌粒。特点：象质粒一样，自主复制而稳定遗传。象噬菌体一样，包装成颗粒，分泌胞外。基因在M13载体和质粒载体之间的转移。激活过程：辅助丝状噬菌体感染带有噬菌粒的受体细胞，反式激活噬菌粒上的间隔区位点，启动噬菌粒以丝状噬菌体DNA的复制模式进行复制。分别包装成颗粒并分泌到受体细胞外。,基因元件的载体,噬菌粒载体,含有噬菌体f1间隔区的载体：pBS ，pGEM 11Zf，pBluescript。,基因元件的载体,由 DNA的cos区与质粒DNA重组而成，主要用于基因文库的构建。,DNA cos位点及其附近区域的DNA片段为1.7 kb质粒DNA为3.3 kb构成的黏粒总共5 kb最大装载量达45 kb,基因元件的载体,黏粒载体，考斯质粒,大肠杆菌-哺乳动物细胞 穿梭载体,UC复制子，C31 整合酶，位点特异性整合在链霉菌基因组的 att位点 oriT 大肠杆菌与链霉菌接合转移aac3(IV) 安普抗性基因，大肠杆菌和链霉菌中筛选标记BamHI 克隆位点：天然产物生物合成基因簇,大肠杆菌-链霉菌穿梭载体,RS313,大肠杆菌-酵母穿梭载体,酵母复制子,大肠杆菌筛选标记,大肠杆菌复制子,酵母筛选标记,多克隆位点,大肠杆菌-链霉菌-酵母穿梭载体,大肠杆菌-棒杆菌穿梭载体,KanR，可移动,整合表达载体,游离表达载体,概念：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。种类：I类限制性内切酶：识别位点和切点不同，切断部位不定。II类限制性内切酶：严格识别, 特异性切割。III类限制性内切酶：特异性切割，识别部位和切点不同。,1. 概念与种类,限制性核酸内切酶,基本名称：生物拉丁文名称属名的第一个大写字母和种名的前两各小写字母缩写构成（斜体）。如果酶存在于一种菌株中，加株名的一个大写字母。如果酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，用一个大写字母表示这些非染色体的遗传物质。酶名称的最后部分为罗马数字，表示该生物体中发现此酶的先后次序。举例：Hind ，Haemophilus influenzae d 株中发现第三个酶。,2. 类限制性核酸内切酶的命名规则,基因的体外重组,4、5或6个碱基对，而且具有180旋转对称的回文结构。Eco RI的识别序列为：5 GAATTC 33 CTTAAG 5 有些酶切割后产生平末端,大部分酶切割后产生黏末端，5或3突出末端。,3.内切酶的识别序列,基因的体外重组,EcoR酶切后形成5 突出端,EcoR酶切后形成平末端,Pst酶切后形成3 突出端,基因的体外重组,活性单位（1U）定义：为50 l反应体系中，特定温度下经过1小时反应，完全分解1 g DNA所需酶量。甲基化：从带有DNA甲基化酶基因的宿主中分离制备DNA，其碱基一部分被甲基化，影响酶识别和切割能力，甚至不能切割。星号活性：限制性酶对底物的特异性降低，导致切割非特异识别位点，电泳弥散（smear）。尽可能降低甘油浓度，在中性pH和高盐离子浓度下进行酶切反应。,4.影响酶切的因素,基因的体外重组,缓冲液与温度：每种酶都有最适反应缓冲液，应在最佳工作温度下和反应缓冲液中进行。酶量与反应时间：增加酶量，相应缩短时间。质粒纯度不很高，酶切反应通常在数倍过量酶的条件下进行。,基因的体外重组,4.影响酶切的因素,DNA连接酶催化的基本反应:DNA 双链上相邻的 3羟基和 5磷酸基因共价结合形成 35磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。T4噬菌体的DNA连接酶:以ATP作为辅助因子，它在与酶形成复合物的同时释放出焦磷酸基团。大肠杆菌DNA连接酶:以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）作为辅助因子。活化后的酶复合物结合在DNA的缺口处，修复磷酸二酯键，并释放AMP。T4-DNA 连接酶比大肠杆菌连接酶具有更广泛底物适应性。,连接反应与连接酶,基因的体外重组,基因的体外重组,DNA连接酶的各种特性,DNA/RNA聚合酶：催化合成DNA/RNA分子的酶。体外进行聚合反应与体内相似，一般需要模板，合成产物为模板的互补序列。根据聚合酶依赖的模板，可分为：依赖于DNA的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段、T4和T7 DNA聚合酶及热稳定性DNA聚合酶；用于DNA复制和扩增依赖于DNA的RNA聚合酶：转录酶，基因的转录依赖于RNA的DNA聚合酶：反转录酶，病毒的复制不依赖于模板的聚合酶：把核苷酸加到DNA分子的末端，即末端转移酶。,四、DNA聚合反应与聚合酶,基因的体外重组,各种聚合酶特性,基因的体外重组,5 3 聚合活性,3 5 外切活性,5 3 外切活性,基因的体外重组,聚合酶活性,大肠杆菌DNA 聚合酶I的大片段Klenow 酶用途： 1）3凹端补平，使之成为平末端；2）对DNA片段进行标记，合成探针；3）用于催化cDNA第二链的合成；4）用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。T4-DNA 聚合酶：修平非平头的cDNA分子以及由某些限制性核酸内切酶水解产生的3突出末端。,基因的体外重组,聚合酶的用途Klenow酶,末端转移酶：转移活性比其他聚合酶高，用于RT和PCR反应物、载体末端加同聚物和3末端标记反应。多核苷酸聚合酶：用于RNA 3标记和加poly(A)。RNA聚合酶：可用于合成RNA探针、体外翻译，可用T7转录系统在大肠杆菌、酵母中表达外源基因。,基因的体外重组,聚合酶的用途末端转移酶,碱性磷酸酶来源于大肠杆菌和牛小肠。细菌碱性磷酸单酯酶和牛小肠碱性磷酸单酯酶（CIAP）均能催化DNA、RNA核苷酸的5端单酯水解，除去磷酸，需要辅基Zn2，但不能催化磷酸二酯和三酯的水解。在DNA重组实验中，该酶用于载体DNA的5末端除磷操作，以提高重组效率。外源DNA片段的5端除磷磷酸基，则可有效防止外源DNA片段之间的连接，提高重组效率。在核酸5末端标记前，用碱性磷酸酶除去磷酸，可得到较高的标记效率。,基因的体外重组,聚合酶的用途碱性磷酸酶,基因的体外重组,聚合酶的用途其他酶,PCR (Polymerase chain reaction, PCR)：聚合酶链式反应，是由DNA聚合酶催化下，对特定的DNA 序列进行的复制反应。本质：根据生物体的DNA复制原理在体外合成基因。发明者：Mullis，1983年，生物技术革命性象征。,PCR及其衍生技术-目标基因组装,一、PCR技术,目标基因组装,(2)退火（55）,(4)完成一个循环,(3)延伸（72）,目标基因扩增,(1)变性（94）,1.PCR单反应原理与过程,产物计算：YnY0（1X）n其中Yn为n循环后的拷贝数，Y0为起始拷贝数， X为扩增效率，n为循环数。,2.PCR循环,目标基因扩增,模板 DNA：目标序列,10010 000bp,pg引物：两条寡核苷酸。脱氧核苷酸：4种dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTPDNA聚合酶: Taq聚合酶，耐高温缓冲溶液：50 mM KCl、10 mM TrisHCl,1.5 mM MgCl2,3.PCR扩增的反应体系组成,目标基因组装,长度：2030 bp， 与模板配对长度1825 bp。GC含量:4060，4种碱基分布均匀。Tm值计算:1520 bp，Tm2（AT）4（CG）。 1440 bp：Tm81.516.6(lgK+)0.41(G+C%)引物Tm之差不能大于5，产物Tm值与引物Tm值之差不能低于10。一般在5065之间，温度越高特异性越强。,4.PCR操作指南引物设计,目标基因扩增,4.PCR操作指南酶切位点设计,目标基因扩增,4.PCR操作指南DNA聚合酶的选择,目标基因扩增,Mg离子浓度：1.55.0 mM。退火温度：根据产物基因的Tm值和长度计算。退火时间：一般30秒至2分钟，根据长度计算。延伸时间：一般13分钟。循环次数：2540次，根据模板含量。PCR反应应该包括正、负对照，无模板、无引物、无聚合酶等对照，以便检测PCR的进行和结果分析。整个过程在PCR仪内，编程后自动完成。,4.PCR操作指南循环参数设计,目标基因扩增,常规操作：冷启动，在冰上把反应物混合后，设计最佳程序，直接进行。热启动操作：先把引物和模板混合并加热到高于非特异性结合温度，加入聚合酶，启动PCR。降序操作： PCR过程优化的最佳选择。前两个扩增循环的复性温度比富含GC引物与模板完全配对的熔链温度高3。随后的循环中，复性温度逐渐降低1。总有一个温度点是特异性扩增的温度。用于兼并引物、模板DNA序列复杂和进行多重PCR。降低非特异性扩增。,5.PCR操作方式,目标基因扩增,反转录PCR（Reverse Transcription PCR, RTPCR）:以mRNA为起始材料，通过反转录酶合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成DNA片段。应用：克隆基因的末端序列、表达的功能区段 检测基因表达和诊断遗传病和感染的病毒等,二、反转录PCR技术,目标基因扩增,第一步:反转录反应,第二步:PCR扩增反应,1.RTPCR原理与过程,目标基因扩增,2. RT反应体系的组成,目标基因扩增,3. 反转录酶特性与选择,目标基因扩增,（1）样品变性。75变性RNA 5分钟，冰上冷却。（2）反转录。加入其他成分，混合。在42或37下，合成cDNA第一链，一般1小时。（3）终止反应。95加热5分钟，使反转录酶失活。设置相关的正负对照，便于监测反应过程和分析反应结果。反转录之后，对产物稀释至一定倍数，然后作为模板，建立PCR反应体系，进行PCR扩增。,4.RT反应操作,目标基因扩增,溶菌酶和SDS处理:破裂细胞后，释放出内容物。碱变性:蛋白质、细菌染色体和质粒都发生变性。蛋白质、细胞壁碎片和染色体DNA相互缠绕形成大型复合物，被SDS包裹。酸中和：加入乙酸钾，使碱性溶液至中性，染色体分子巨大，无法复性，质粒很快复性,进入上清液SDS包裹蛋白质、染色体及细胞碎片被沉淀下来。离心:除去蛋白质、染色体DNA及细胞碎片等沉淀，质粒保留在上清，最后用乙醇或异丙醇沉淀。,质粒载体的分离与纯化原理,1. SDS碱裂解制备提取质粒的原理,基因的体外重组,去污剂：Triton X100煮沸加热：使细胞壁裂解，同时使蛋白质、核酸等变性沉淀。降低温度：冰浴迅速降温，质粒得以复性，其他生物大分子不能有效复性.离心:除去杂质，收集质粒。,加热裂解制备提取质粒的原理:,基因的体外重组,质粒大小：大于15 kb，温和的SDS碱法提取，操作过程也要尽量轻柔，避免质粒被机械剪切而断裂。小于10 kb的质粒可用剧烈的加热裂解法提取。碱或加热处理时间：对提取质粒的质量影响很大，时间延长会使质粒不可逆变性，应注意避免。除去RNA：由于含有大量的RNA，要用RNase A处理。 RNase A可在第一步加入，节省时间。溶菌酶：小量提取，不加溶菌酶。大量提取时添加7 溶菌酶，并给予一定时间处理。,注意事项,基因的体外重组,质粒的电泳检查：23带：23种螺旋构型质粒的电泳速率不同最亮带：负超螺旋质粒中间带：缺口开环质粒滞后带：两条链都断裂的线性质粒出现两条带，开环质粒带很弱，是正常的。,基因的体外重组,质粒不能酶切：可在沉淀质粒之前，用苯酚或苯酚、氯仿抽提，提高质粒的质量。质粒的纯化：现在多用离子交换、吸附、凝胶过滤等原理纯化，有很多商品化的试剂盒。,转化:某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，使其基因型和表型发生相应变化的现象.转染:除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程.转导:用噬菌体做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过程.,遗传转化与筛选鉴定,一、转化,1. 概念,遗传转化操作：将重组DNA分子导入受体细胞过程。物理方法：热击诱导，电穿孔法，基因枪化学方法：PEG介导，脂质体转染 接合转移：细菌细胞之间的直接接触导致DNA从一个细胞转移至另一个细胞的过程。噬菌体转染: -DNA体外包装成为噬菌体颗粒,转染细菌。,2. 转化方法,大肠杆菌热击诱导转化：制备感受态细胞，加入DNA，热击42C 90s，冷却，涂平板电转化：电转仪，控制高压放电。受体细胞制备（减少细胞壁的形成）。酵母电转化：YPAD培养基(50 ml)培养酵母菌 at 30C ，250 rpm ，45 h ，OD600=0.81.0。 4C ，4000 rpm ，5 min收集细胞。洗涤并重悬于250 ul /1 M cold 山梨醇。取 50 ul 酵母与4ul DNA 混合物于0.2 cm杯，1.5 kV转化。与YPAD混合后，30C 培养1 h。收集细胞，洗涤重悬sorbitol 。取3050ul 涂平板，SC-Ura， 30C 24d筛选转化子。 基因枪：高压打击;花粉管通道：植物,物理转化方法,PEG介导：制备原生质体，加入DNA载体，加入PEG，混合，离心，除去上清，涂原生质体再生平板脂质体转染：脂质体包裹DNA，与细胞混合，主要用于动物细胞转化氯化铯转化酵母：,化学转化方法,受体菌：制备链霉菌新鲜孢子，热击50度10min/预萌发制备供体菌感受态：把质粒转化ET12567/PUZ8002大肠菌，过夜培养，在对数期，洗涤收集细胞把大肠杆菌与孢子混合，涂平板24小时后，涂抗生素，抑制大肠杆菌，筛选转化子,接合转移方法,未连接的外源DNA片段载体片段载体的自连物非正确连接的重组分子正确连接的重组分子,重组子的筛选与的鉴定,外源DNA片段与载体DNA的连接反应物：,非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞转化子：导入外源DNA的转化细胞非重组子：仅含有空载体分子的转化子重组子：含有重组DNA分子的转化子目标重组子：含有连接正确的重组分子非目标重组子：不含目的基因重组子,转化后的细胞类型：,筛选与鉴定的目的：找出正确连接的重组子,原理：利用载体DNA分子所携带的选择性遗传标记基因筛选重组子。标记基因所对应的遗传表型与受体细胞是互补的，因此在培养基中施加合适的选择压力，即可保证重组子显现，而非重组子不现（不生长）。大肠杆菌/链霉菌/棒杆菌等细菌抗生素筛选法：抗生素的抗性基因，氨苄青霉素。篮白斑：lacZ基因，重组子白色，非重组子蓝色。噬菌斑：转化子被裂解形成噬菌斑，而非转化子正常生长营养缺陷型筛选法：酵母用氨基酸缺陷型，动物细胞用核苷酸缺陷型筛选,筛选方法载体的遗传标记法,菌落原位杂交法：核酸分子探针序列特异性地杂交目的基因。限制性酶切图谱法：酶切，相应位点、片段大小。DNA序列测定法：序列、方向、边界等。外源基因表达产物检测法：外源基因编码产物是蛋白质，产物表达、功能、结构来筛选和鉴定期望重组子。,筛选方法其他方法,谢谢！,
