微生物学第十五章课件.ppt

第十五章 微生物生物 技术,绪言 1 生物技术及内容 2 生物技术的发展历史 3 微生物生物技术特点及应用 4 微生物生物技术产业化发展,生物技术,基因工程,酶工程,细胞工程,发酵工程,产物,产品,产品,1.1 微生物生物技术 利用微生物进行产品生产,抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等,医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业,基因工程药物、疫苗及抗体产品,化学工程 生物化工 生物加工行业,近代生物技术,现代生物技术基因工程菌发酵,抗酒、面包、醋、堆肥,传统生物技术,（1）微生物生物技术 是将微生物学，生物化学和化学工程学的基本原理有机结合起来的一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。微生物生物技术 涉及 微生物的发酵 （发酵工程） 代谢产物的提纯 （后处理）,（2）.微生物生物技术 -发酵工程的内容 菌种特性与选育 培养基特性，选择及灭菌理论 发酵醪特性，发酵机理，发酵动力学 过滤机理，氧传递，溶解，吸收理论 连续培养，发酵控制与自动化 后处理（下游工程） 细胞破碎，分离，醪液输送，过滤，去杂，沉淀分离，蒸馏，结晶，干燥，包装，及发酵产物分离过程种控制与自动化。,（3）微生物生物技术的特征：有复杂的生物化学反应与微生物活细胞息息相关代谢调控是特色特有系统：空气除菌系统 培养基灭菌系统,（4）微生物生物技术需解决的问题 菌种问题 合适的反应器 基质的选择 发酵和提纯的比拟放大 过程控制 丝状菌的发酵无完善的理论指导,1.2 微生物生物技术的发展历史,发酵现象酿造食品工业非食品工业青霉素抗菌素发酵工业氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵）基因工程菌动物细胞大规模培养植物细胞大规模培养藻类细胞大规模培养转基因动物,（1）传统发酵阶段1667年之前：嫌气性发酵生产酒类好气性发酵生产醋类、制曲,微生物生物技术的早期阶段,1680年制成显微镜 微生物的存在1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精 酶,厌氧发酵发酵技术： 19世纪末，用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。 20世纪初期，1916年英国采用梭状芽孢杆菌生产丙酮丁醇，德国采用亚硫酸盐法生产甘油（第一次世界大战）由食品工业向非食品工业发展,好氧发酵技术： 速酿法从乙醇生产醋酸，通气法大量繁殖酵母，用米曲霉的麸曲代替麦芽糖作糖化剂生产酒靖，用微小毛霉生产干酪。 1933年等人发明了摇瓶培养法代替了传统的静置培养法。生长均匀，增殖时间短。,（2）近代微生物生物技术 40年代,1928年由 Fleming发现青霉素 1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究 表面培养： 1升锥形瓶， 40u/ml1943年沉浸培养： 5m3 200u/ml当今： 100m3200m3 5-7万u/ml 链霉素、金霉素、新霉索、红霉素,主要的技术进展：通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。抗杂菌污染的纯种培养技术：无菌空气、培养 基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。意义：抗生素工业的发展建立了一套完整的好氧发酵技术，大型搅拌发酵罐培养方法推动了整个发酵工业的深入发展为现代发酵工程奠定了基础,50年代60年代 人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术 酶的活力、 酶量调控(反馈控制和反馈阻遏) 解除菌体自身的反馈调节,特殊调节控制的利用, 突变株的应用,前体、终产物、副产物等应用 发酵动力学，发酵连续化，自动化工程技术 微生物酶反应生物合成与化学合成反应相结合工程技术,(3) 现代微生物生物技术20世纪70年代之后,细胞融合技术、基因操作技术 1、增加生物体内基因拷贝数， 可以大幅度地提高目标产物的产量 2、 特有产物的控制基因植入细胞中， 快速经济地大量生产这些产物 3、不同性能的多种质粒植入， 以非粮食物质为原料进行发酵生产或环境保护,1.3 微生物生物技术的特点,（1）具有生产价值的发酵类型微生物菌体发酵微生物酶发酵微生物代谢产物发酵微生物的转化发酵生物工程细胞的发酵,（2）微生物生物技术的特点：常温常压，能耗小，设备简单生物体自动调控农副产品作为原料易生产复杂的高分子化合物需防杂菌污染,（3）应用范围酿酒工业 生理活性物质发酵工业食品工业 维生素发酵工业 抗生素工业 微生物冶金工业有机酸工业 核苷酸发酵工业 有机溶剂发酵工业 菌体蛋白发酵工业酶制剂工业 微生物环境净化工业氨基酸工业 生物能工业,1.4 微生物生物技术产业化发展,目前，全球发酵产品的年销售额在400亿美元左右，并以每年约78的速率增长。 我国发酵行业生产企业有5000多家，主要发酵产品的年产值高达1300亿元。 微生物生物技术给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力,涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题,发酵工业发展趋向,（1）糖分解生产 从简单化合物复杂化合物， 从自然发酵人工控制突变发酵（2）化学合成产品工业生产全部或部分由 发酵法完成（3）小规模大型、现代化（4）糖质原料石油，天然气，纤维素，空气资源,重点方向（1）微生物育种（2）生物反应器技术与生物分离技术（3）微生物数据库，发酵动力学，发酵传力学发展,第一节：工业常用微生物及来源 微生物的特性及工业微生物的要求 一些工业化产品生产菌种的特点 菌种选育,一. 微生物的特性及工业微生物的要求1、微生物的特性,有些微生物能在厌氧的条件下生长,有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长,有些微生物能进行复杂的代谢,有些微生物能利用较复杂的化合物,有些微生物能在极端的环境下生长,1、菌种能在较短的发酵过程中高产有价值的发酵产品；2、菌种的发酵培养基应价格低廉，来源充足，被转化为 产品的效率高；3、菌种对任何动物，植物和环境不应该造成危害，还应注意潜在的，慢性的，长期的，要充分评估。4、菌种发酵后，不需的产品少，且产品与不需物易分离5、菌种的遗传特性稳定，易于进行基因操作；,2：工业化生产菌种的要求,3、生产菌种的来源,微生物资源广泛分布于土壤，水，空气（1）自然环境（2）收集的菌株筛选（3）购置生产菌种,表15-2国际承认的培养物保藏单位,菌种利用总趋势发酵菌转向氧化菌野生菌转向变异菌自然选育转向代谢控制育种诱发基因突变转向基因重组定向育种,放线菌（链霉素四环素；红霉素等）,真菌（青霉素、头孢等）,一些产芽孢的细菌,植物或动物来源,1、抗生素生产有关的微生物,抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：,二、 已工业化产品生产菌的介绍,2、氨基酸生产有关的微生物,代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。,50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：,HD:高丝氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制,HT:高丝氨酸转乙酰酶,AK:天冬氨酸激酶,氨基酸生产菌的要求：,代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单,谷氨酸发酵的菌种：,其它氨基酸生产菌：,棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌,常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌,3、食品酶制剂生产有关的微生物,开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。,淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根霉、枯草 芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌纤维素酶： 木霉红曲酶; 红曲霉蛋白酶： 枯草芽孢杆菌、黑曲霉,二、大规模发酵特征,一般认为：规模大，所用的设备庞大，占用场地大，人力、物力投入的规模大；消耗的原料、能源多；菌种符合生产菌种的要求，其生长代谢特性与大规模发酵相适应；需进行成本核算。,发酵罐：反应器水平, 可以得出最 终优化的基 础配方,1、用于好氧菌的发酵罐的结构和应用,大型发酵罐搅拌装置,2、厌氧菌大型发酵罐和其他 生物反应器,3、发酵工程的优化及后处理,表15-3发酵过程的主要控制项目和方法,附一 温度变化及其控制,一、温度对生长的影响,不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0260C生长，嗜温菌适应于15430C生长，嗜热菌适应于37650C生长，嗜高温菌适应于650C以上生长,二、温度影响发酵方向,四环素产生菌金色链霉菌1.当温度低于300C时，合成金霉素能力较强；2.温度提高，合成四环素的比例也提高，3.温度达到350C时，只产生四环素。 温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。,最适温度的选择,1、根据菌种及生长阶段选择,微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为370C，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30320C，青霉菌生长温度为300C。,在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。,根据生长阶段选择,发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就可以提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素菌体生长阶段280C，合成期260C，后期再升温；黑曲霉生长370C，产糖化酶32340C。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长30320C，产酸34370C。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。,2、根据培养条件选择,温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。,3、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。,三、发酵过程引起温度变化的因素,（一）发酵热Q发酵,发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。,1、生物热Q生物,在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。,生物热与发酵类型有关,微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水好氧：产生287.2千焦耳热量， 183千焦耳转变为高能化合物 104.2千焦以热的形式释放厌氧：产生22.6千焦耳热量， 9.6千焦耳转变为高能化合物 13千焦以热的形式释放二个例子中转化为高能化合物分别为63.7和42.6,培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。生物热大小与呼吸作用强弱有关在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。,培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大。,2、搅拌热Q搅拌,在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算： Q搅拌P8604186.8（焦耳/小时） P搅拌轴功率 4186.8机械能转变为热能的热功当量,3、蒸发热Q蒸发,通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热Q显热，显热很小，一般可以忽略不计。,4、辐射热Q辐射,发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5。Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q辐射,发酵热的测定,有二种发酵热测定的方法。一种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。Q发酵GCm(T出T进)Cm水的比热G冷却水流量,另一种是根据罐温上升速率来计算。先自控，让发酵液达到某一温度，然后停止加热或冷却，使罐温自然上升或下降，根据罐温变化的速率计算出发酵热。,附二、 发酵过程的pH控制,H是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。,发酵过程中pH是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否,一、发酵过程pH变化的原因,1、基质代谢,（1）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一（2）氮代谢 当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降,2、产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。,3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。,二、pH对发酵的影响,（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻,（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行,（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用,（4）pH影响代谢方向 pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH23时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺,三、pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响,生长,合成,H对菌体生长影响比产物合成影响小例 青霉素：菌体生长最适pH3.56.0,产物合成最适pH7.27.4 四环素：菌体生长最适pH6.06.8，产物合成最适pH5.86.0,X,pH,四环素,四、pH的控制,1、调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制利用后pH在6.0，利用前pH往往要调到6.56.8,2、在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3 ，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等,3、通过补料调节pH,在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH如（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH (2)当NH2-N低，pH低时补氨水； 当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4,4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH,溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。,附三、 发酵过程中氧的控制,25，一个大气压下，空气中氧在水中溶解度为0.25mmolO2/L 在培养液中为0.2mmolO2/L最适氧浓度临界氧浓度最低要求 0.0030.005mmolO2/L,描述微生物需氧的物理量,比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气，mmol O2g菌-1h-1,摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmol O2L-1h-1 。,r= QO2 .X,（一）发酵过程中的需氧因素,1. 生产菌种 一般为25100mmolO2/L2.菌体浓度 浓度高需氧大3.菌龄 幼龄菌体呼吸强度大4.培养基 丰富耗氧量大,（二）发酵过程中供氧因素,1. 搅拌 增加气液接触面积 使液体形成涡流 使菌体分散2. 通风量和空气流速3. 空气分布管4. 氧分压5. 发酵罐液柱高度6. 发酵罐体积,（三） 发酵过程的控制一般策略：,前期有利于菌体生长，中后期有利于产物的合成,溶氧控制的一般策略：,前期大于临溶氧浓度，中后期满足产物的形成。,2、溶氧控制的实例,GA,X,DO,谷氨酸发酵：,要求：氧饱和度1,控制：0-12小时 小通风 12小时后 增加通风,原因：0-12小时菌体量较小，采用小通风,12,一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。,例： 生产肌苷酸：通气量不变 17.15 mg/ml24小时增加 22.55 mg/ml30小时增加 18.25 mg/ml36小时增加 12.34 mg/ml,表15-4通常后处理的主要步骤、技 术和产品质量,4、产品的逐级扩大小试 中试 试验性生产,第二节 微生物工业发酵的方式,分批培养补料分批培养半连续培养连续培养,培养方式,间歇补料操作,连续补料操作,循环分批操作,指数速率补料培养,恒速补料操作,变速补料培养,分批培养,补料分批培养,连续培养,循环间歇补料操作,循环连续补料操作,补料分批培养的优缺点,优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。,缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会,二、固定化酶和固定化细胞发酵,1.固定化的优势 (1)固定化酶和固定化细胞可以重复使用。 (2)固定化酶和固定化细胞产品的分离、提纯等后处理比较容易。 (3)固定化酶和固定化细胞一般都做成了球形颗粒或薄片状，使产品的生产工艺操作简化，易于机械化和自动化，设备和器材也较简易。,(4)固定化酶和固定化细胞可以制成酶活力很高或细胞密度很大，而且抗酸、碱、温度变化的性能高，酶活力较稳定,因而反应速度加快，生产周期缩短。 (5)固定化酶与固定化细胞相比，各有所长。,2.固定化的几种类型,用不同的载体和不同的操作方法将酶或微生物细胞固定，根据固定化的主要机理，一般分成4类。(1)吸附固定化(2)包埋固定化(3)共价固定化(4)交联固定化(5)微囊固定化,三、固态发酵,概念固态发酵(Solid Statefermentation)又称固体发酵，是指微生物在没有或几乎没有游离水的固态的湿培养基上的发酵过程。,表15-7固态发酵生产的实例,表15-8固态发酵与液态发酵相比的优、缺点,四、混合培养物发酵,混合发酵有三个突出优势：(1)充分利用培养基、设备、人员和时间，(2)混合发酵能够获得一些独特的产品，而纯种发酵是很难做到的。(3)混合的多种菌种，增加了发酵中许多基因的功能，,第三节发酵的主要产品,各行业的微生物工业及其产品举例名 称 产品举例食品微生物工业 面包、乳酪、味精、肌苷酸、赖氨 酸 、甜味素、维生素、食用菌酿造微生物工业 酒、食用醋、酱油、柠檬酸药用微生物工业 青霉素、链霉素、维生素E、精氨 酸、基因工程菌产的活性肽医用微生物工业 菌苗、疫苗、诊断试剂、葡聚糖、甾 体激素环保微生物工业 有益菌剂、分解酚菌剂、石油净化剂能源微生物工业 乙醇、沼气、氢气、微生物电池,农业微生物工业 赤霉素、井冈霉素、Bt杀虫剂、菌肥林业微生物工业 菌根菌剂、放线菌酮、病毒杀虫剂、 食用菌饲料微生物工业 单细胞蛋白、土霉素、蛋氨酸兽医药微生物工业 土霉素、菌苗、疫苗、诊断试剂冶金微生物工业 富集铜菌剂、富集铀菌剂化工微生物工业 丙酮、丁醇、醋酸、衣康酸、PHB、 丙烯酰胺轻工微生物工业 甘油、乳酸、酶制剂石油微生物工业 黄原胶、嗜石油酵母军用微生物工业 菌苗、疫苗、细菌武器检测和预防产品,作业,1，试述工业发酵对微生物菌种的要求。3. 试述分批发酵与连续发酵的概念与优缺点。4，结合课件，查阅资料图示啤酒发酵的工艺流程。5，试述发酵过程中pH变化的原因和调控方式。,EndThanks!,