分子生物学检查7版课件.ppt
分子生物学检查,南方医院实验诊断学教研室 温淑娟,1 基因诊断2 流式细胞术及其临床应用3 染色体检测,1 基因诊断,一、基因诊断在实验诊断中的位置二、基因诊断在临床诊断中的必要性三、基因诊断的原理、途径四、基因诊断在临床医学中的应用,临床医学实验诊断技术的发展,细胞形态学技术(细胞形态和/或数量) 生化检验技术(生物化学代谢产物和酶)免疫学诊断技术(识别特定蛋白质分子的差异) 分子诊断技术(DNA/RNA和蛋白质),基因诊断的检测对象和其在诊断中的位置,转录 翻译 分泌和表达 DNA 核膜mRNA 蛋白 细胞膜功 临床 能性产物 表现 核酸诊断 生化诊断 血清学诊断 临床诊断 （基因诊断） （酶法测定） （血清蛋白）,基因诊断可以更早、更本质地反映生理、病理状况,基因诊断的实验诊断对象,先天遗传性疾患后天基因突变引起的疾病外源基因侵入致病,基因诊断的原理 运用现代分子生物学和分子遗传学方法检查基因的结构及其表达功能是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。基因诊断的途径 基因突变的检测,基因连锁分析,基因表达分析基因诊断的优点 病因诊断，针对性强；快速；灵敏；特异性高基因诊断的必要性-不可替代,基因诊断的常用技术,一、聚合酶链式反应二、DNA测序三、核酸分子杂交技术四、单链构象多态性分析五、单核苷酸多态性分析六、连接酶链式反应七、基因芯片技术,聚合酶链式反应（PCR),PCR？PCR的原理PCR的技术特点,反转录PCR荧光PCR,PCR在临床医学中的应用,PCR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶链式反应,是模拟DNA体内复制过程，在DNA聚合酶作用下，进行特定DNA片段的体外复制。,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、复性,变性、复性,PCR的技术特点,特异性强(几乎没有方法学的假阳性)灵敏度高简便快速对样品要求低PCR的局限性,RT-PCR(反转录-PCR)（reverse transcription-PCR）,模板选用的是RNA通过逆转录酶聚合而成的cDNA模板cDNA是一条单链，在反义引物的引导下合成第二链模板DNA，此时才开始常规的PCR扩增在RT-PCR中，模板量及所抽提的RNA极其重要可进行一步RT-PCR或两步RT-PCR(巢式或半巢式）,病原体,DNA,RNA,PCR,裂解抽提,扩增产物检测,核酸纯化,PCR检测流程,RT-PCR,凝胶电泳,酶切分析,杂交,核酸序列分析,PCR扩增及产物分析,PCR产物电泳图,p,1 2 3 4 Marker,270 bp,荧光PCR,Oligo 1: Fluorescein,Oligo 2: LC Red 640,荧光共振能量传递（FRET Probe）,双标记探针（Taqman Probe）,FQ-PCR反应原理,特异性荧光双标记探针 Taq酶 53外切酶活性,荧光PCR仪,FQ-PCR实时动力学曲线,FQ-PCR的技术特点,封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性可定量检测，扩展了临床应用空间光谱技术进一步提高了灵敏度可检测单拷贝基因荧光探针杂交，进一步提高了特异性扩增与自动分析一体化，检测更加简便快速,PCR在临床医学中的应用,早期诊断 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证 输血源的筛选母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断肿瘤的诊断,核酸分子杂交技术,核酸分子杂交？常用的核酸分子杂交技术及应用,常用的核酸分子杂交技术及应用, Southern印迹杂交-DNA印迹 Northern印迹杂交-研究RNA的方法 斑点杂交-狭缝杂交。DNA、RNA均可检测 原位杂交-检测DNA或RNA同时还可对其进 行细胞及基因组内定位,单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism)SNP,指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP在人类基因组中广泛存在。是人类可遗传的变异中最常见的一种。基因芯片技术逐步应用于SNP检测，使大规模进行SNP检测成为可能。,SNP的意义和应用,疾病连锁分析和未知致病基因的定位疾病的关联分析复杂疾病或过程的基因定位法医学应用,疾病发生的分子遗传机制的阐明环境因子易感基因的检出药物基因组学研究器官移植配型和物种进化的研究,基因芯片Gene Chip,原理：是将大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。,基因芯片技术的应用,优生方面：避免许多遗传病的发生疾病诊断方面：器官移植、组织移植、细胞移植方面的基因配型病原体诊断,2 流式细胞术及其临床应用,流式细胞术流式细胞仪组成及其工作原理流式细胞术的临床应用,流式细胞技术,流式细胞技术是在流体状态下观察细胞状态的一种技术能够对细胞或微球的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测分类收集细胞,流式细胞仪,流动室和液流系统激光源和光学系统光电管和检测系统计算机和分析系统细胞分离纯化系统(有细胞分选功能时),流式细胞技术工作示意图,流式细胞仪,流式细胞术的临床应用,免疫学：免疫活性细胞的分型与纯化、淋巴细胞亚群与疾病关系的分析、免疫缺陷病的诊断、器官移植后的免疫学监测血液学：白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一肿瘤学：鉴别良恶性肿瘤，预测预后，评估化疗药疗效分子生物学:可在单细胞水平进行基因的表达、调控及功能研究。,3染色体检查,染色体检查在临床医学上的意义 1、判定男女,3染色体检查,染色体检查在临床医学上的意义 1、判定男女 2、诊断遗传病 3、优生优育 4、有助于白血病的诊断和分型,正 常 女 性 核 型 图,染色体检查的基本步骤,取材：主要采取外周血白细胞、皮肤组织、绒毛组织、羊水细胞、骨髓细胞培养：加入丝裂原获分裂细胞，制成染色体标本显微镜下进行初步的染色体观察和分析照相并进行核型分析讨论分析结果并作出诊断报告,染 色 体 图 象 分 析 系 统,人类染色体数目或结构畸变导致的遗传性疾病称染色体病。 共同的临床特征： 先天性多发畸形、智力低下、生长发育迟缓和皮肤纹理改变。性染色体异常的患着还将出现内、外生殖器异常或畸形。,先 天 愚 型 核 型 图,先 天 愚 型 患 者,Turner综合征核型图,Turner综合征患者,4P三体综合征,4 P三体综合征,谢谢,
