视觉通路 分子讲解学习课件.ppt

视觉通路 分子,一、前人研究,参考文献：胥佳利师姐等人的关于不同光照条件对母鸡离顶盖通路c-fos基因表达的影响,1.目的及意义,c-fos基因是即早基因家族最重要成员之一,普遍存在于中枢神经细胞,正常情况下表达水平很低且难以检测,但在多种刺激因素下可诱导该基因迅速的一过性表达。因此,c-fos基因的表达产物可作为中枢神经系统活动的标志物,并可据此描绘出一个参与该信息传递过程的中枢通路,获得脑部相应部位功能活动数据。 注：即早基因家族为细胞受刺激或激活后立即转录的基因，一般15-30min，如T细胞激活中参与信号转导的原癌基因c-fos和转录因子基因NF-AT等。,鸟类的90%视网膜节细胞的投射由中脑视顶盖接受,是非常重要的视觉中枢;从视顶盖中央灰质层经丘脑圆核到大脑外纹体组成的离顶盖通路是鸟类最重要的视觉通路,但目前未见有关家禽脑部重要视觉通路对不同光照刺激引起的c-fos基因表达的报道,鸡脑离顶盖视觉通路对不同强度光刺激的反应有待于进一步研究。,光照对母鸡产蛋性能有较显著影响,进一步探讨光信息对鸡生产性能的影响及作用机理,对养鸡业科学利用光照提高鸡的生产性能有重要意义。本研究利用神经通路追踪法的HRP逆行标记技术,由丘脑圆核注入微量30%HRP标记离顶盖通路,用c-fos法检测该通路对不同光照刺激的反应,为进一步探究光照对母鸡生产性能影响的神经调节机制打下基础。,简要介绍,本实验采用神经标记和免疫组化技术相结合的方法,对不同光照对母鸡离顶盖通路c-f os 基因表达的影响进行了观察研究。将120 日龄母鸡右眼遮光5 d 后向丘脑圆核引入微量30%H RP, 48 h 后解除遮光并给予不同强度的光照刺激1 1.5 h, 暗适应1.5 h 后灌流固定,取脑制作连续冰冻切片, 用TMB 法检测离顶盖通路H RP 逆行标记神经细胞, 通过Fos 蛋白免疫组化方法检测c- f os 基因在这些部位的表达。,结果显示, 母鸡离顶盖通路各核团对不同强度的光刺激有不同的反应, SGC 层和ROT 核对30 lx 光照最为敏感, 而SP/ IPS 核对40 lx 光照反应较为明显。注：1.HRP，辣根过氧化物酶 (horse radish peroxidase，简称HRP) 2.TMB, 3,3,5,5-四甲基联苯胺,为一种色原试剂,禽类的视觉系统主要分为2 个平行通路: 离顶盖通路和离丘脑通路, 对于包含鸡在内的眼球侧置的单眼视觉的大多数鸟类来说, 视顶盖接受90% 对侧神经的投射, 是非常重要的视觉中枢 。视顶盖具有明显的由细胞和纤维相间排列构成的分层构造。,视顶盖分层构造,从其浅表到深部可区分为分为5 层，分别为：视神经层( Stratum opt icum, SO) 、表面灰质纤维层( St ratum griseum et f ibrosum superf iciale, SGFS, 又分为A - J 层10 个亚层) 、中央灰质层( St ratumg riseum centrale, SGC) 、中央白质层( St ratum albumcentrale, SAC ) 和室周灰质层( St ratum griseumperiventriculare, SGP)。,有研究证明, 视顶盖的视觉传出神经主要从SGC 层投到同侧和对侧丘脑的圆核( Nucleusrotundus, Rt) , 且SGC 不同亚层的细胞投射向圆核的不同部位, 圆核投射到同侧的外纹体( Ectost riatum)。,ECT：外纹体RT：圆核SP：顶盖 前下核IPS：顶盖前间下核SGC：中央灰质层,光照对母鸡产蛋性能有较显著影响,探讨光信息对鸡生产性能的影响及作用机理,对养鸡业科学利用光照提高鸡的生产性能有重要意义。,本研究利用神经通路追踪法的HRP逆行标记技术,由丘脑圆核注入微量30%HRP标记离顶盖通路,用c-fos法检测该通路对不同光照刺激的反应,为进一步探究光照对母鸡生产性能影响的神经调节机制打下基础。,实验过程,材料与方法1材料1.1 动物 120日龄健康雌性白来航鸡1.2 主要试剂 HRP，TMB，兔抗鼠C-FOS，SP免疫组化试剂盒,1.2方法,1. HRP的引入 用速眠新将动物麻醉后固定于脑立体定位仪上,向母鸡左侧丘脑圆核缓慢注入0.5 L30%HRP,维持右眼遮光状态48h。2. 光照刺激 试验组：右眼眼罩移至左眼, 右下眼睑保持睁开状态, 光照刺激1 1.5 h。 对照组：维持右眼遮光。 3. 取材 麻醉，灌流，取左脑 4. 切片 冰冻切片,5. HRP 组织化学显色 TMB 呈色显示HRP 标记神经细胞, 部分中性红轻度复染以显示脑部组织构造。6. FOS 蛋白免疫组化检测 兔抗鼠C-FOS 为第一抗体进行孵育, 采用链霉卵白素-过氧化物酶连接法(SP法）进行免疫组化染色, DAB显色, 部分用Unna 氏多色性美兰染液轻度复染。 阴性对照: 用0 01 mo l/ L PBS ( pH 7 3) 替代一抗, 进行上述试验。 7. 结果分析 略,结果与分析,2. 1 TMB 法显示的HRP 逆行标记神经细胞从ROT 注入HRP 后, 经T MB 呈色反应法显示的HRP 逆行标记神经细胞呈圆形、椭圆形或多角形, 其阳性细胞主要分布在左侧中脑视顶盖SGC 层。其中注射部位与标记细胞的出现位置有一定对应关系。,Fos 样免疫反应 呈棕黄色颗粒, 位于胞核, 复染的切片可见这些核团的神经细胞胞体主要呈三角形、卵圆形和纺锤形。试验组 左侧离顶盖通路中脑视顶盖SGC 层、SP/ IPS 核和间脑ROT 均见有Fos 样免疫反应阳性神经细胞分布, SP/ IPS 核内分布少些。对照组少见或未见阳性神经细胞分布, 阴性对照切片未见阳性神经细胞分布。,SGC 和SP/ IPS 核内许多Fo s 样免疫反应阳性细胞与相邻切片的HRP 标记细胞重叠, 表明这些细胞是投射向ROT 核的离顶盖通路细胞。不同强度光照后母鸡脑左侧离顶盖通路不同部位Fo s 样免疫反应阳性神经细胞平均光密度不同。证明不同光照刺激对产生fos蛋白有不同结果,我的总结,TMB 法显示的HRP 逆行标记神经细胞是定位实验，将神经投射区域找出来Fos 样免疫反应 是定量实验，光照具体通过影响离顶盖通路中的那部分来影响的，同时测fos蛋白定量分析，来分析不同强度的光照对fos蛋白产生的影响，以决定那种光照对鸡影响最大，从而得出影响鸡产蛋的最佳光照强度。,离顶盖通路,离顶盖通路,离顶盖通路是鸟类视觉系统的一条主要途径, 由视网膜顶盖圆核外纹体等组成。视网膜接受外界视觉后主要沿这条通路直接传送到端脑, 也有些视觉信息通过一些侧支回路间接地投射到端脑。顶盖峡核回路构成离顶盖通路的一个侧支, 峡核大细胞部顶盖的兴奋性通路和峡核小细胞部顶盖的抑制性通路构成了峡核顶盖之间的正负反馈回路.,视网膜-视顶盖 鸟类的视顶盖是视觉信息的整合和传递中枢，鸟类的视顶盖虽然仍重要, 但纹状体在许多方面已占统治地位，视顶盖有一对前叶称视叶。视顶盖-圆核(Rt) 鸟类视顶盖的投射纤维大多投射到同侧的丘脑圆核。主要是从视顶盖的S G C 层的不同亚层有次序的投射到圆核的不同亚区。圆核在离顶盖系统中不只是信息传送结构, 也是信息加工的重要场所。,中脑分为背侧的四迭体和腹侧的大脑脚四迭体(Corporaquardrigemina)：又称顶盖(Tectum)，由前后2对圆丘组成。前丘(Colliculusrostralis)较大，是光反射的联络站，为灰质和白质相间的分层结构。后丘(Colliculuscaudalis)是声反射的联络站，其表面为白质、深部为灰质的后丘核，,丘脑(Thalamus)：占间脑的最大部分，为一对卵圆形的灰质团块，由白质髓板分隔为许多不同机能的核群组成。左、右两丘脑的内侧部相连，断面呈圆形，称丘脑间粘合，其周围的环状裂隙为第3脑室。丘脑是皮质下的主要感觉中枢。在丘脑后部的背外侧，有外侧膝状体和内侧膝状体。外侧膝状体位于前方较外侧，接受视束来的纤维，是视觉冲动传向大脑皮质的联络站。,人脑可分为5个部分端脑，指大脑两半球；间脑、中脑、后脑，由延髓和脑桥组成；小脑。,圆核-外纹体(鸟类) 圆核到外纹体的投射只是外纹体的局部区域, 但明显地不直接进入外纹体周围的围外纹体(E p ),从圆核投射到外纹体是由至少5 个并行的亚集团伴着从圆核的各个亚核投射到外纹体各亚核过程。外纹体虽然没有直接的端脑外投射, 但其核心部(E c) 发出纤维投射到围外纹体和新纹体中间外侧部(EI L ) , 中继后再投射到古纹体中间部(Ai )。以上这些结构都属背侧室峙。从Ai 又发出纤维投射到同侧视顶盖深层。这样就形成了一个回路即:视顶盖 R t E c E p A i 视顶盖,外纹体（Ectostriatum E）：为鸟类特有。呈三角形，位于背侧髓板背侧，从后者突入新纹体，含深染细胞。它接受来自圆核、圆下核、三角核、丘脑背外侧核、腹侧上纹体和感觉主核的纤维，在鸽子还接受发自中脑和延髓广泛区域的纤维；传出纤维参与组成纹体被盖束河纹体小脑束，投射至新纹体、背侧皮质样区和丘脑背外侧核。外纹体为视觉中枢。,离丘脑通路：略可参考：沈端文的爬行类鸟类离顶盖通路和离丘脑通路的比较唐宗湘, 马殷华的鸟类视觉系统的离顶盖通路唐宗湘的离顶盖通路鸟类离顶盖通路的结构和电生理特性,C-fos基因表达的相关机制,参考文献：卢静等的C-fos 基因表达的相关机制和意义宋毅等的灵杞黄斑颗粒对光损伤大鼠视网膜cfos、caspase3 及bclxL 表达的影响沈蔚的视网膜损伤与c-fos基因表达,C-fos基因表达的相关机制和意义,c-fos基因是一种即刻早期基因,诱导其表达的相关机制主要与NMDA、NO、Ca和GABA等因素有关。c-fos基因的表达产物Fos蛋白与靶基因的特异序列结合,调节其转录水平发挥信使作用。,c-fos基因概述,近年来发现一种c-fos基因参与重要脑功能活动的信号转导和调控过程,多种刺激因子,如缺氧、光线刺激、机械刺激、疼痛刺激等均可诱导中枢神经系统(CNS)中c-fos基因的表达。细胞受刺激后,胞核内的c-fos基因被激活,转录形成mRNA,后者进人胞浆,翻译合成分子量为55kD的核磷蛋白,即Fos蛋白。,FoS蛋白经磷酸化修饰后返回胞核内与另一家族原癌基因c一jun编码的Jun蛋白形成复合物。Jun与哺乳动物基因转录因子AP-1结构、功能相似,故以Jun/AP-1表示。Fos和Jun/AP-1通过各自的a螺旋区以光价键结合形成亮氨酸拉链,Fos -Jun/Ap-l复合物与目的基因结合,激活目的基因的转录活性。,通过上述过程,细胞外刺激信号转化为调节细胞核内基因表达的信号,产生细胞的远期效应,可作为接受一定刺激的神经元激活的标志,是目前较为理想的脑功能活动的定位标记。,c-fos表达的意义,多种刺激均可诱导c-fos基因表达，Fos-Jun / AP-l复合体可能作用于许多靶基因,如前强啡肤基因、神经肤-Y基因、神经生长因子基因等，因此，Fos蛋白不仅是神经元刺激后的激活标志，而且介导了其后的一系列反应。目前较为肯定的是:阿片肽基因可能是FoS蛋白的靶基因。,在正常神经细胞中有低水平的表达。当前的研究已将该基因的表达作为神经细胞受损情况和可恢复性的标记物之一。研究证实C-fos 基因在光性感光细胞凋亡中有必不可少的作用。光损伤后C-fos 的快速诱导要早于损伤的形态学改变。,许多刺激都能诱导c-fos表达,而且随着刺激的种类、强度、持续时间的不同,c-fos基因在CNS表达的时程、分布和数量有差异。,试验中研究了这个通路传导，但是通路中的第一部分视网膜细胞是将光信号转化成电信号，这样才进行后续的信号传导的，怎样转化的？,离顶盖通路,眼球壁,内容物,外 膜,（纤维膜）,角膜,巩膜,中 膜,（血管膜）,虹膜,睫状体,脉络膜,内 膜,（视网膜）,虹膜部,睫状体部,视部,房水,晶状体,玻璃体,盲部,一、眼球的外形 前、后极，赤道，眼轴，视轴,二、眼球的构造,（一） 眼球壁,1、眼球纤维膜 即外膜,（1）角膜（cornea）,（2）巩膜（sclera) 巩膜静脉窦,2、眼球血管膜 即中膜,（1）脉络膜 (choroid),（2）睫状体：(ciliary body) 睫状突、睫状环、睫状肌,（3）虹膜：(iris) 瞳孔、瞳孔括约肌、瞳孔开大肌,3、眼球内（感觉）膜即 视网膜(retina),视部,盲部,睫状体部,虹膜部,睫状突,睫状小带,睫状肌,虹膜角膜角,巩膜静脉窦,瞳孔,虹膜,视神经盘（视神经乳头） （盲点）,黄斑,中央凹,外层,内层,（二） 眼球的内容物,包括房水、晶状体和玻璃体，它们和角膜一样透明而无血管分布，共同构成了眼的屈光系统。,1、眼球房和房水(aqueous fluid),睫状体产生,眼球后房,瞳孔,眼球前房,虹膜角膜角,巩膜静脉窦,睫前静脉,眼静脉,巩膜静脉窦,虹膜角膜角,作用,屈光,营养角膜、晶状体,维持眼压：循环障碍时眼压增高，称青光眼（glaucoma）,2.晶状体(lens) 双凸透镜状，无色透明，有弹性，外面有晶状体体囊。老年时出现老视；晶状体浑浊时称白内障（cataract）。,vs,3、玻璃体(vitreous body),为胶状物质，表面为玻璃体囊，具有屈光和支撑视网膜的作用。支持作用减弱时，造成视网膜剥离。,眼底重要解剖结构：,视 盘 无视觉（NF）黄 斑 中心凹，视觉敏锐区(锥c)血管视网膜,1,色素层 (外 1)： 色素上皮层 神经层 (内 9)： 锥、杆细胞层 外界膜 外颗粒层 外网状层 内颗粒层 内网状层 神经节细胞层 神经纤维层 内界膜,I,II,III,视网膜的功能： 感光 锥c明亮光、形、色 杆c暗光 传导 (锥、杆c；双极c；神经节细胞) 光 I II III,光 神经冲动,视中枢,视网膜建模的研究进展,视觉是一个非常复杂的神经生理活动过程。光信息从1 3 亿个光感受细胞输入, 通过复杂的处理由100 多万个神经节细胞产生相应神经冲动, 经视神经、视交叉、视束传到外侧膝状体, 再经视中枢的复杂处理, 最终形成视觉。,视网膜的结构非常复杂。根据其细胞的功能的不同可以分为5 类, 即光感受细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞和神经节细胞。神经节细胞的轴突穿过眼球组成了视神经。而光感受细胞还可被分为视杆细胞和视锥细胞。,视网膜上视觉最敏锐的区域叫黄斑区, 其中央有一直径1.5 mm 的中央凹。在中心凹处主要集中的是视锥细胞, 在中央凹以外视杆细胞逐渐增多。视网膜的刺激传递是从光感受细胞到双极细胞最后传到神经节细胞产生放电。,外层,内层,水平细胞和无长突细胞则构成视网膜传递的横向结构。光感受细胞的主要功能是接受光刺激。视锥细胞主要对强光敏感, 而视杆细胞主要对弱光敏感。光感受细胞的电反应强度与细胞膜色素分子吸收的光子个数有关。,水平细胞位于光感受细胞下方, 通过化学传递来接受光感受细胞的信号以及和其相邻层的电信号。水平细胞的作用相当于一个低通滤波器, 为双极细胞提供一低频信号。双极细胞可以接受或抑制水平细胞和光感受细胞传来的信号, 双极细胞根据其感受野的中心极性可以分为on 和off 两类。,无长突细胞和水平细胞一样都是横向结构的细胞。无长突细胞接受双极细胞及其他无长突细胞的信号, 它是首先产生神经冲动的细胞。它的反应与所给刺激的特性有关, 并且各个细胞体都有所差异。无长突细胞对运动较为敏感。神经节细胞分为瞬时和持续两类,它主要接受双极细胞和无长突细胞的信号然后产生神经冲动, 通过轴突传递到视神经。,对于某些有视觉障碍的人( 如老年黄斑变性、色素性视网膜炎) 来说, 他们的大部分视网膜细胞和视神经细胞都保存完好。所以可以尝试在视网膜上设计视觉假体, 通过将视觉信息转换为电刺激来刺激视网膜上未受损的部分来部分重建视觉。,视网膜建模可分为：视网膜上( epiret inal) 视觉假体、视网膜下( subret inal) 视觉假体和视神经( optic nerve) 视觉假体的设计服务。,视网膜上视觉假体需要从外界如摄像头获取图像, 通过处理后转换为电刺激传给植于视网膜最上层的微电极阵列来刺激神经节细胞。视网膜下视觉假体通过光电二极管把光转换为电流来刺激色素上皮层与双极细胞之间的区域。视神经视觉假体,基于算法的模型 基于算法的模型是应用人工神经网络、实验数据及数学算法等通过调节模型中的参数达到最优效果来模拟视网膜功能。用硬件实现的模型 用硬件实现的模型主要是用晶体管、电阻、电极等硬件来模拟视网膜的各层结构以实现视觉信息处理功能。目前已有不少研究小组设计出了成型的芯片。虽然各个小组所设计的芯片的像素不同, 尺寸也不同, 分层和算法也不完全相同, 但是都应用了视网膜的滤波等特性以实现对视网膜的模拟。,不论是硬件模型还是算法模型基本上都由3 层结构组成, 即输入层、信号处理层和视觉输出层。所以说视网膜模型应该包括对应于输入层的传感器、对应于信号处理层的编码器及对应于视觉输出层的转换器。,模型中的电刺激应该由脉冲宽度、脉冲频率、脉冲形状等多个参数来控制。视网膜视觉假体的设计需要考虑到很多方面,诸如图像的编码、信号的压缩和传递、参数的设置、训练学习过程等。随着我们对神经刺激和视网膜结构了解的不断加深以及生物兼容性材料研究的进展, 相信在不久的将来可以设计出较为有效的模型来实现视觉修,视网膜中的自主感光神经节细胞,在20世纪末，人们发现视网膜中少数神经节细胞可以表达一种感光色素黑视素(OPN4)，因此具备自主对光产生反应的能力，这类细胞被称为自主感光视网膜神经节细胞(ipRGCs) 或者含黑视素神经节细胞(mcRGCs)。与其他类型的视网膜神经节细胞不同，ipRGCs 除了能够接受来源于光感受器的信号输入，还能通过自身表达的感光色素直接对光产生反应。,在视觉系统当中，ipRGCs 主要参与了非成像视觉的形成，如光线引起的昼夜节律调控和瞳孔收缩反应。少数ipRGCs 的轴突可以投射到外膝体等视觉相关脑区，从而参与调控成像视觉。近年来，得益于分子生物学和遗传学的快速发展，出现了许多与ipRGCs 相关的转基因动物模型和标记ipRGCs 细胞的方法，ipRGCs 的分类和功能研究也因此取得了很多重要进展，许多关键问题已经或正在得到解决。,例如，在ipRGCs 中，树突分布在撤光亚层的细胞为何具有给光输入？在光感受器缺失、或者光感受器和下级神经元没有功能连接的情况下，昼夜节律和瞳孔反射的相关回路是否可以独立工作？本文将回顾ipRGCs 的发现过程，对其分类、生理和功能进行概述。,视网膜中少数神经节细胞能够合成感光蛋白黑视素（melanopsin）， 因此具备了自主感光的能力， 被称为自主感光神经节细胞（ipRGCs）。ipRGCs 可根据树突形态和分层位置的差异分为五个不同的亚型， 其轴突主要投射到视交叉上核、橄榄顶盖前核等脑区， 参与调控昼夜节律、瞳孔对光反射等非成像视觉功能。,此外， 部分ipRGCs 的轴突投射到外侧膝状体和上丘， 可能在调节成像视觉中发挥功能。下面将介绍一下ipRGCs 的发现过程和最新研究进展。,ipRGCs 的发现,根据经典的哺乳动物视觉理论，环境中的光线到达视网膜后，首先会激活光感受器中的视蛋白(opsin，一种G 蛋白偶联受体)，经一系列细胞内信号转导，造成光感受器的超极化，其末端神经递质释放减少。递质释放变化所包含的信息，通过光感受器的下级神经元双极细胞，传递到神经节细胞，在此产生动作电位，将信号传递到更加高级的视觉中枢。,视网膜中除了光感受器，其它类型的神经元并不表达能够感光的视蛋白，所以不具备直接对光线产生反应的能力，其光反应的产生都需要来自光感受器的信号输入。但是，Keeler1927 年通过在视网膜变性小鼠上进行的实验发现，成年的视网膜变性小鼠光感受器完全缺失，但是仍然能够在接受光刺激时产生瞳孔收缩反应尽管瞳孔收缩的速度比正常小鼠慢，幅度也有所减小。,上世纪90 年代，Foster 等人发现照明变化能够影响视网膜变性小鼠的昼夜节律性等生理反应；同时，他们发现缺失光感受器的视网膜在较短波长的光照射下，11-cis-retinal 仍然可以在感光色素介导下被转化为反式，说明除光感受器以外的其它类型视网膜细胞中表达了某些类型的感光色素。,这些实验都显示，在缺失光感受器的情况下，小鼠依然能够感知环境中的光照信息，提示在视网膜中除了光感受器之外还存在其他类型的感光神经元。由于实验技术和条件的限制，光感受器之外的感光神经元一直没有被鉴定出来，所以上述实验结果很大程度上还是被归因于视网膜变性小鼠中可能残留了少量光感受器。,1998 年，Provencio 实验室在非洲爪蟾的表皮感光载黑素细胞中发现了一类新的感光色素，称其为黑视素，利用原位杂交的方法，他们发现黑视素的mRNA 在非洲爪蟾视网膜的内核层细胞中有表达。2000 年，Provencio 实验室再次利用原位杂交的方法，发现小鼠和灵长类动物的视网膜中存在黑视素，而且表达在内核层和神经节细胞层的非光感受器细胞中。,Gooley等人将大鼠视交叉上核逆向标记与原位杂交技术结合，发现黑视素主要表达在一类投射到SCN 的视网膜神经节细胞中。2002 年，研究人员利用转基因小鼠和抗体染色的方法，发现在啮齿类动物的视网膜中，少数神经节细胞表达黑视素；在使用镉离子阻断突触传递(即来自光感受器的信号输入)、甚至脱离视网膜后，这类神经节细胞依然能够保持对光反应的能力，因此称这类细胞为自主感光视网膜神经节细胞,ipRGCs表达感光色素黑视素，所以能够不依赖于光感受器而直接对光反应。作为视蛋白家族(opsins) 的成员，黑视素也是一种G 蛋白偶联受体，依赖11-cis-retinal 吸收光子，但是其具体的感光通路目前并不清楚。在哺乳动物视网膜中，已发现黑视素有两种异构体，可能具有不同的生理性质,已有的实验指出，在培养的哺乳动物细胞系中(转染了TRPC3 通道的HEK293 细胞) 表达黑视素，并在培养基中加入11-cis-retinal，可以有效地诱导细胞在光照条件下产生去极化反应。与光感受器不同，ipRGCs 不能直接从视网膜色素上皮层获得11-cis-retinal（11-顺式-视黄醛）。在不持续添加11-cis-retinal 的情况下，ipRGCs 可以长时间保持对光反应的能力，在体外培养的细胞系中也是如此。,一个较为合理的假说是，黑视素可视素蛋白，只是转化成all-trans-retinal（全反视黄醛）；当其他波长的光子照射后，自动恢复原来的状态。但是，这个假说只在头索动物(文昌鱼) 的黑视素同源蛋白中得到证实，在哺乳动物方面仍然缺少直接证据，需要更加有说服力的生理学或结构生物学结果来证明。此外，有研究发现，利用携带黑视素的病毒转染其它类型的视网膜神经节细胞，可以有效地使其产生光反应，为治疗视网膜色素变性等疾病提供了一种可能的方法,ipRGCs 的分类、树突分层和生理特性,ipRGCs 的分类、树突分层和生理特性：，小鼠的ipRGCs 可以分为五个不同的亚型，分别以M1M5 表示，目前常用的标记ipRGCs 的小鼠模型包括：标记M1 亚型ipRGCs 的Opn4:tau-LacZ 或者Opn4:tdTamato ； 标记M1、M2 两个亚型的Opn4-EGFP；标记全部五个亚型且通过Cre 来诱导报告基因表达的转基因小鼠Opn4Cre/+:Z/AP。,ipRGCs 的投射和功能,利用原位杂交、免疫组化染色、转基因小鼠表达报告基因和逆向标记等方法，ipRGCs 轴突投射的靶部位也逐渐被揭示。早期发现的一类转基因小鼠模型中(Opn4:tau-LacZ)，只有M1 亚型的ipRGCs 表达LacZ 报告基因。通过对LacZ 轴突终末在不同脑区的分布进行分析，发现投射比较密集的区域包括视交叉上核(SCN)、膝状体间小叶(IGL) 及橄榄顶盖前核(OPN).前两者主要负责昼夜节律的调节，后者是瞳孔反射回路的重要部分。,注：Opn4:tau-LacZ-黑视素：Tau蛋白-乳糖Z微管系统是神经细胞骨架成分，可参与多种细胞功能。微管由微管蛋白及微管相关蛋白组成，Tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白,Opn4:tau-LacZ 小鼠只有M1 细胞表达LacZ，因此在该小鼠的不同脑区进行逆标，逆标到的M2 亚型ipRGCs 的胞体能够被抗体染色，但不表达LacZ，从而可以获得M2 亚型ipRGCs 的投射区域。研究发现：M1 是投射到SCN 的主要亚型，而M2 则是投射到OPN 的主要亚型，提示M1 在昼夜节律调控中、而M2 在瞳孔反射中发挥更重要的作用。由于M3M5 这些亚型的ipRGCs 缺少各自独立的标记方法，目前的研究还没有对其投射的差异做出细致分析。,光线照射ipRGCs 产生光反应后，其轴突末梢可以释放包括谷氨酸和垂体腺苷酸环化酶激活肽( PACAP) 在内的神经递质，从而调节昼夜节律等相关的功能。在正常情况下，可以利用单次光照改变暗养后的内源节律(约23 h)，使其产生相位后；在缺失PACAP 的情况下，则这种效应消失。此外，PACAP 的受体在视网膜中也有表达，但是ipRGCs 是否可以通过旁分泌的方式激活这些受体，以及其生理功能，目前还没有明确的解释，可能和神经元的保护相关。,缺少了光感受器的小鼠，由于ipRGCs 能够直接对光反应，因此小鼠依然能够产生昼夜节律调节和瞳孔反射。但是，如果利用遗传学方法杀伤ipRGCs，光感受器不受影响，成像视觉不受影响，但小鼠的昼夜节律调节和瞳孔反射几乎完全消失，证明来自光感受器的信号在调控非成像视觉时，也必须通过ipRGCs。,在胚胎期大鼠视网膜上就能检测到黑视素的表达，其投射的脑区SCN 中，神经元活动的标志物c-FOS 在光照后表达增加。如果敲除黑视素基因，c-FOS 在SCN 中的表达不再随光照变化。实验证明了出生时，ipRGCs 已经具有感光功能且投射回路已经建立。这种黑视素蛋白的早表达、ipRGCs 感光能力的产生和对相关脑区的有效输入，对新生动物形成昼夜节律具有重要意义。,研究人员还发现，新生小鼠已经具备了对光照的回避反应，而敲除了黑视素的新生小鼠失去光照回避反应，证明ipRGCs在光感受器出观感光功能前的新生小鼠具有重要的生物学意义。,ipRGCs 也能够参与成像视觉的形成。在灵长类动物中，ipRGCs可以投射到成像视觉的相关脑区，如dLGN 和SC；并且，ipRGCs 的感受野具有对中心- 周边颜色拮抗的特性，可能参与了颜色视觉的形成。利用水迷宫等行为学方法检验缺失光感受器的小鼠，发现其依然具有区分不同模式图像的视觉能力(pattern vision)。如果对这种缺失光感受器的小鼠呈现模式视觉的刺激，视皮层等成像视觉相关的脑区中会检测到c-FOS 表达的显著增加。,如果同时缺少光感受器和黑视素，小鼠的模式视觉能力就会完全消失；同时，视皮层中c-FOS 的表达也不再随模式视觉相关的刺激增加。ipRGCs 介导了不依赖于光感受器的模式视觉，这与ipRGCs 能够投射到dLGN 和上丘等成像视觉相关脑区的结果相一致。,总结,从黑视素的发现开始，人们对ipRGCs 的研究取得了迅猛进展。黑视素感光机制的研究， 揭示了哺乳动物中可能存在着不依赖于11-cis-retinal 循环的感光能力。与channel rhodopsins 等光控离子通道不同，黑视素属于G 蛋白偶联受体，其调控通道开放的途径和自身表达水平的调节机制仍然有待阐明。,利用分子生物学、遗传学提供的实验技术，ipRGCs 可以被有效地标记出来。不同亚型的ipRGCs 具有独特的形态特征和投射模式，以及不同的生理反应特性。这些发现将更好地揭示昼夜节律调节和瞳孔反应的神经调控过程，并进一步探明整个回路的功能。同时，ipRGCs 在成像视觉中的作用，也逐渐被认识到。,利用遗传学标记并调控ipRGCs 的活动，可以对视觉信息的传递及处理过程有更多理解。作为一类重要的神经节细胞，ipRGCs 的树突形态和轴突投射也可以作为研究神经元特异性连接和回路形成的良好标本，以此分析不同亚型ipRGCs 特有的形态及其投射的分子机制，对研究视觉通路发育形成和病理条件下的重构过程，具有重要意义。此外，在视网膜细胞中表达黑视素，也可能成为治疗视网膜变性疾病的方式。,Morris水迷宫,最初用于研究脑内结构对学习和记忆的调节作用，后来逐步发展成为目前最为常用的评价动物学习与记忆的模型。morris水迷宫实验的基础是，啮齿类动物在水中有强烈的逃避水环境的动机，并以最快、最直接的途径逃离水环境。学会逃避水环境的过程体现动物的学习能力；根据周围环境进行空间定位，有目的地游往水中安全的地方（平台），体现动物的空间记忆能力。广泛运用于神经生物学、药学等领域的基础和应用研究中。,优点,由于对年龄相关性空间记忆损害有可靠的敏感性，Morris水迷宫是判断老年小鼠空间学习记忆能力的特别有用的工具。驱动动物逃避的是水刺激，而不需要食物和水的剥夺。因此，避免了剥夺食物和水后给实验动物带来的新陈代谢方面的问题，而这方面问题对某些品系的动物来说可能是危险的。动物不必接受电击，这在那些食欲促进任务（appetitive tasks）如辐射状迷宫和T迷宫中是常规的要求。,可以消除气味线索。能提供较多的实验参数，系统全面地考察实验动物空间认知加工的过程，客观地反映其认知水平。将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，减少它们对学习记忆过程检测的干扰。既可以检测空间参考记忆又可以检测空间工作记忆。在用固定平台测试小鼠的空间参考记忆后再将平台的位置改为不固定，就可检测它们的工作记忆能力。显然，寻找不固定平台的认知过程要复杂一些，需要动物对时间和空间上的分离信息加以整合和判断。操作简便，数据误差较小。,不足,由于需要监视系统及分析软件，只有少数装备较好的实验室可以开展工作。实验程序的设计需要考虑的因素较多，同时需要实验者具备一定的神经生理学、认知生理学和数理统计方面的知识，给实验的开展和结果的解释带来困难，同时也限制了该迷宫的深入广泛的应用。由于体力消耗太大，体温也丧失过多，年老体弱鼠完成任务较困难。并非所有鼠株都适合于Morris迷宫测试，如BALB/c不能学会该任务（成绩并不随天数的增加而进步），129/SvJ的学习成绩也偏差。,个体间的成绩差异巨大。某些株，如129/SvJ株的小鼠由于有年龄相关性视路病变(visual pathology)，在衰老时完成以视觉为基础的学习记忆任务时就会出现困难。在C57BL/6株，由于严重的秃头症（alopecia）存在，可能使某些小鼠产生抑郁，加上溃疡性皮炎，最终可能影响小鼠的游泳能力而影响实验成绩。对轻微的学习记忆能力的减退，该迷宫程序可能不敏感。将动物浸入水中可能引起内分泌或其它应激效应。后者与脑损害或药理学操作间的相互作用具有不确定性7a。经过自动监视系统的操作仍需要借助于手工才能完成，这可能使实验变得一些乏味。所占实验场地过大。,谢谢,此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢,