常规组织病理学技术课件.ppt

常规组织病理学技术,1,固 定,取 材,脱水，透明，浸蜡,包 埋,切片,镜下观察，诊断,常规病理学技术（病理工作流程）,快速冰冻,取材,常规组织处理,OCT包埋,细胞学检查,取材,染色,固定,2,组织固定,目的：保持组织和细胞的形态学特征，防止因为酶活性或微生物而使组织坏死，自溶及腐败。保持组织和细胞中可溶性成分不被溶解。减少蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞成分丢失。维持细胞膜，内质网，核膜等细胞结构的完整。,3,组织固定,目的：使组织中的各种物质沉淀和凝固起来，产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。固定剂兼有硬化作用，使组织硬化增加组织硬度，便于制片。 防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。经过固定的组织，能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辩认。,4,组织固定,固定的机制和原理有很多种，包括:反应基团间的共价结合交联的共价结合脱水与酸性物质作用盐的形成和热能共同作用,5,组织固定,理想的固定剂：保留蛋白，mRNA以及DNA的生化特征。支持组织化学染色，免疫组化，原位杂交和各种其他技术。能快速渗透和固定组织。适合各种不同的组织和不同大小标本的固定。固定剂易于回收和处理，价格合理。无毒，无害，无可燃性。,6,组织固定,固定剂的种类：1、按照化学性质分类类：醛类：甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。类：氧化剂类：四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。类：蛋白变性类：甲醇，乙醇，醋酸等类：其他：氯化汞，苦味酸等 。2、按照成分分类：单一固定液：如甲醛，酒精，醋酸，锇酸，丙酮等混合固定液：中性甲醛，AF液等,7,组织固定,常用的固定方法蒸汽固定法：甲醛或锇酸可产生蒸汽。用于保存可溶性成分；小而薄的组织，冷冻干燥组织灌注固定法：肺，肾脏，肝脏等细胞涂片的固定：浸入法和滴加法，浸入法应注意相互污染的问题微波固定法：微波加热可缩短固定时间，但时间和温度掌握困难,8,常用固定液介绍,9,甲醛（分子式:HCHO）固定:纯甲醛是一种蒸汽溶于水后成为37%40%的甲醛溶液（又称福尔马林溶液）固定液为10%的中性福尔马林（即约含4%W/V的甲醛溶液）甲醛在水溶液中形成HOCH2OH（亚甲基氢氧化合物）复合物,10,甲醛（分子式:HCHO）固定:甲醛的亚甲基氢氧化合物能与蛋白质末端多种不同的功能基团结合，使蛋白多肽分子间形成桥键，使蛋白质不再发生改变，保存原位。-,11,甲醛（分子式:HCHO）固定的优点:组织形态结构保存好固定均匀，穿透性强组织收缩少增加组织硬度，便于切片价格便宜,12,甲醛（分子式:HCHO）固定的缺点:封闭抗原决定簇： 醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象发生改变，可能部分和完全遮盖抗原决定簇，使之不能完全暴露，导致免疫组织化学染色产生假阴性。 处理措施： 固定后能够充分水洗，可减少分子间交联。 抗原修复还可使抗原再现。 缩短固定时间(824小时)，降低固定温度(4)可减少交联。,13,甲醛（分子式:HCHO）固定的缺点:甲醛内杂质含量多，影响酶染色含甲酸，固定液酸化，影响染色产生甲醛颗粒，影响观察，尤以多血的肝，脾组织常见易挥发，污染环境,14,10%中性缓冲福尔马林固定液： 100ml40%福尔马林 900ml蒸馏水 NaH2PO4 4g Na2HPO4 6.5g最常用的固定液，抗原保存好，合适免疫组化染色。,常用甲醛固定液,15,优点：-保存组织中易溶于水的物质，如尿酸结晶和糖原-常与其他试剂配制成多种混合固定液：加快固定时兼有脱水的作用缺点：-可溶解脂类物质，要求保留脂类物质时不能使用酒精-对组织收缩较大，单纯酒精固定组织收缩明显，变硬变脆，制片困难-渗透力差，组织表面已固定，组织中间固定不佳-沉淀核蛋白，球蛋白，白蛋白，影响核染色-价格贵,乙醇（alcohol）固定,16,醋酸（cetic acid）固定-对染色质固定较好。-对脂肪、糖元不能固定。- 能使组织膨胀，可抵偿因乙醇、升汞、甲醛等固定液引起的组织收缩和硬化，故常配成5%混合固定液。- 穿透速度最快，固定时间短。- 5醋酸的p值在28，此时可停止细菌和酶的活动，可防止组织自溶变性。,17,-能沉淀蛋白质，它不能固定脂肪、类脂和糖类。-穿透力较弱，单独使用可使组织收缩。多与醋酸和铬盐（重铬酸钾）配成混合固定液。-固定后细胞的结构，特别是核的细微结构显示清晰。-易产生汞盐的沉着，损害切片刀，因此染色前必须脱汞。,氯化汞（ercury bichloride）,18,-能沉淀蛋白质，但对脂肪和类脂无固定作用。-穿透力很慢，细胞收缩显著，但不会使组织硬化。-有软化皮肤的作用，配制的Bouin氏液对头皮及全身皮肤制片效果甚好。-固定时间太久会影响HE染色。-糖元较好的固定剂。,苦味酸（icric acid）,19,-可以作固定剂，又可作脱水剂，穿透速度快，可使蛋白质沉淀凝固，2毫米以下的组织固定半小时至1小时即可。-可引起组织较强的收缩使之变硬，对核固定不佳。-对某些酶的固定很好，如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等。-一般多与氯化汞、甲醛混合液使用，先用低浓度丙酮再经高浓度丙酮固定以减少组织收缩和过度硬化。,丙酮,20,-强氧化剂，不能与酒精等还原剂混合，常配成0.5%水溶液固定组织。-单独固定组织不能沉淀蛋白质，但加入冰醋酸转变为铬酸，（即酸化重铬酸钾），可使蛋白质凝固沉淀。-与甲醛混合是固定线粒体、高尔基复合体和嗜铬细胞等优良固定剂，若配成Eenker氏液，能很好的固定细胞质、胞核及染色体。-穿透速度快，组织收缩小，固定的组织必须流水充分洗涤（612h），否则影响染色。对酸性染料染色良好，对碱性料染较差，若加入升汞及醋酸等，则对细胞核染色极佳。,重铬酸钾,21,乙醇-甲醛液（AF液）配制：95%或无水乙醇90ml加入40%瓶装甲醛10ml，常用固定液。 兼有脱水作用，用于固定肥大细胞和糖元较好，米粒大小固定46h，大块组织1224h，固定后不经水洗，直接放入95%酒精开始脱水。,22,enker氏液配制:重铬酸钾2.5g+升汞5g+蒸馏水100ml，加温溶解，冷却过滤，贮于棕色瓶内，成为贮存液。用时取此液95ml再加入冰醋酸5ml即成。 enker氏液固定后，细胞核和细胞浆染色较为清晰，特别显示骨骼肌的横纹 固定时间12-24h，然后冲洗24h，切片脱腊后需脱汞（浸入5%碘酒精10），脱碘（5%硫代硫酸钠）流水洗。,23,Bouin氏液配制：苦味酸饱和液75ml+甲醛25ml+冰醋酸5ml 此液渗透快，组织收缩小，固定均匀，为常用固定液。它对肝、皮肤、胰脏特染效果好，但固定过久对碱性染料的着色有影响。,24,Garnay氏液配制：纯酒精60ml+氯仿30ml+醋酸10ml细胞极好的固定液，对淋巴组织及腺体固定很好，米粒大的组织固定12h，也适宜RNA、DNA及糖元的固定。,25,Helly氏液配制：重铬酸钾25g+升汞50g+蒸馏水1000ml+甲醛50ml白细胞颗粒良好的固定剂，可用于造血器官，如骨髓，脾脏的固定。,26,B5固定液配制：储备液：氯化汞12g+醋酸钠2.5g+蒸馏水200ml。使用前加2ml甲醛到20ml储备液中常用于骨髓，淋巴结，脾和其他造血组织的固定。,27,组织固定注意事项,组织离体后尽早放入固定液中固定液体的体积应大于标本的45倍，甚至20倍固定的容器口要方便组织固定后取出组织固定时间不宜太长，一般不超过72小时，固定不足和固定时间太久都可能影响染色，免疫组化等,28,组织取材,尸检组织取材外科切除标本取材活检小组织取材,29,组织取材,要求：取材组织厚度小于3mm，长度和宽度大约2cm为宜。取材刀锋利，避免组织损伤。剔除标本中的线头，吻合钉。有钙化和骨化的组织要脱钙。保持取材台的干净，流水冲洗。避免小标本丢失，可用伊红染料标记。肿瘤标本取材应注意相互关系。核对标本，以免张冠李戴,30,组织处理,1、脱水： 将组织内的水分用某些化学试剂置换出来的过程称脱水。 脱水是透明前必要的过程。所用试剂为能与透明剂相混溶的试剂。 常用脱水剂有乙醇，正丁醇，丙酮。 脱水过程从低浓度到高浓度，时间一般为20min120min。高浓度乙醇中不能放置太久时间,31,-尸检及活检：有条件时，将组织分别进行脱水，因为不同组织脱水时间有差异。-动物组织： 应区分动物大、小，如狗组织接近新生儿组织，大白鼠和小白鼠也有差异，前者需时稍长，后者则较短。-脱水时间与脱水剂的关系：脱水剂的新旧（纯度）影响脱水时间，必须灵活掌握。-穿刺组织：如肾穿刺、活检小组织，常规用擦镜纸包裹，涂伊红，以防丢失。,1、脱水时的注意事项：,32,-非石蜡溶剂的脱水剂：如乙醇和丙酮等，其组织在脱水后必须再经二甲苯透明才能浸蜡。-脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：如正丁醇等组织在脱水后即可直接浸蜡，不经过中间溶剂如二甲苯之类的试剂。,脱水剂的种类和效果,33,组织处理,2、透明： 用化学试剂，通常为二甲苯将组织内的脱水剂置换出来的过程称透明。 透明发挥了一个桥梁作用，透明剂可以与包埋剂和脱水剂相溶。 常用透明剂有二甲苯，笨，三氯甲烷等。 一般置换23次透明剂，每次时间1540min。 透明剂易使组织变硬变脆，所以不能让组织在透明剂内放置时间太长。,34,组织处理,3、浸蜡与包埋： 经过前期处理的标本，再置入支持物中，使支持物渗透入组织，并将组织埋入，包裹的过程。 常用支持物有石蜡，树脂，碳蜡，明胶，火棉胶。 一般采用熔点为5658,经三道溶化的石蜡浸渍后,透明剂被全部置换出来。浸蜡温度高于蜡的熔点2 3 。,35,石蜡：石蜡有高熔点和低熔点之分，一般普遍应用熔点为56以上的石蜡。低熔点在54以下，用于酶的显示和保存抗原活性。石蜡分软蜡（5254），硬蜡（5658），蜂蜡60。一般气温用硬蜡，气温低时用软蜡。火棉胶：碳蜡明胶,浸蜡剂的种类,36,组织处理,3、浸蜡与包埋： 将蜡液注入包埋的模具中，放好组织后，移至冷台，使组织和蜡液凝固在一起的过程。 包埋应注意组织的埋面，保持组织在一个平面上，间距合适，避免气泡，包埋要迅速，防止组织与蜡分离。,37,组织处理,手工处理全封闭柜式自动脱水机（室温）全封闭柜式自动脱水机（加温）全封闭柜式自动脱水机（真空负压）,38,全封闭柜式自动脱水机（樱花tissue-tek VIP6）,39,常规石蜡切片,多采用轮式切片机，一次性刀片切片厚度为4um6um展片水温4248 注意清洁，避免污染易脱片组织可用防脱片的涂胶载破片防止切片裂痕，厚薄不均的现象,40,常规石蜡切片,防脱片的涂胶载破片多聚赖氨酸：0.1%水溶液，使用时再1:10稀释，涂片3-氨丙基三已氧基硅烷（APES）带电荷玻片或阳玻片,41,冰冻切片,常用于术中快速病理诊断组织不经脱水，透明等步骤，对蛋白，脂肪，各种酶保存好，合适做组织化学，免疫组化等染色，尤其对不合适石蜡组织的抗体组织会膨胀，细胞变大，出现与常规切片的一些差异,42,常规HE染色,染色的意义和目的： 用染液对组织切片进行处理，使组织中的不同成分被染上相应的颜色，产生不同的折射率，以利于光镜观察和分析。,43,常规HE染色,HE是苏木素（haematoxylin）和伊红（eosin）的缩写苏木素是从苏木素树的树心中提炼的天然碱性染料，苏木素经过氧化后变成苏木红，在媒染剂作用下形成蓝色色精，对细胞核具有良好的染色能力伊红属酸性染料，化学名称四溴荧光素二钠，分为水溶性和醇溶性两种，常规HE使用的是水溶性伊红,44,常规HE染色染色的原理,细胞核染色的原理：细胞核主要是DNA，带负电荷，呈酸性，容易与带正电荷的碱性染料结合，苏木素氧化呈苏木红，苏木红与媒染剂中金属阳离子结合形成蓝色色精，以离子键或氢键与核结合。细胞质的染色的原理：细胞质主要是蛋白质，为两性化合物，等电点为pH4.75.0。当染液的pH值低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，伊红是一种酸性染料，水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白的氨基正电荷结合而使细胞质着色。,45,常规HE染色染色步骤,1、脱蜡二甲苯脱蜡10分钟左右二甲苯脱蜡5分钟左右无水酒精(乙醇)洗去二甲苯1分钟无水酒精(乙醇)洗去二甲苯1分钟95%酒精1分钟85%酒精1分钟自来水洗片刻,46,除去汞盐沉淀物: 对于用升汞固定或含有升汞混合固定液的切片，切片脱腊后需脱汞（浸入5%碘酒精10），脱碘（5%硫代硫酸钠）流水洗染色。除铬沉着物: 有些组织用含铬的enker氏液等固定，致有铬沉淀物。可应用盐酸乙醇溶液，或用5%碘酒和5%硫代硫酸钠水溶液处理。,常规HE染色染色步骤,47,脱甲醛色素: 甲醛固定组织时间较长及温度较高情况下，甲醛易氧化自行分解产生甲酸，导致组织成酸性，此时可能有甲醛色素产生。此种色素无光泽，不溶于水，乙醇，二甲苯等。对于这种色素可用下列方法除去。 1 浓氨水1 ml，75%乙醇200 ml。切片脱蜡后置溶液中30 或较久流水洗染色。 2 1%氢氧化钾1 ml，80%乙醇100 ml。切片脱蜡后置溶液中10 流水洗5 80%乙醇5 蒸馏水洗染色。,常规HE染色染色步骤,48,常规HE染色染色步骤,2、染色苏木素染色15分钟左右自来水洗片刻1%或0.5%或0.25%盐酸水分化35秒钟自来水洗，温水蓝化片刻伊红酒精染液浸染20秒2分钟,49,常规HE染色染色步骤,3、脱水、透明、封固85%的酒精脱水20秒 95%的酒精1分钟无水酒精染12分钟无水酒精染2分钟二甲苯浸2分钟二甲苯浸2分钟中性树胶或加拿大树胶封片,50,常规HE染色结果,细胞核呈蓝色钙盐和各种微生物呈蓝色或紫蓝色细胞质，肌纤维，纤维结缔组织，红细胞和伊红色颗粒呈不同程度的红色,51,常规HE染色质量标准,切片完整，厚度46um，厚薄均匀，无皱褶，无刀痕细胞核，质染色分明，红蓝适度，透明洁净，封固美观,52,细胞病理学,细胞病理学（cytopathology）是通过观察细胞类别，形态和性质，协助临床筛查，诊断和研究疾病的科学。是病理学得分支学科。,53,细胞学检查的材料来源,体腔抽出液体的脱落细胞粘膜表面的脱落细胞针吸细胞内镜刷洗细胞细胞印片培养细胞爬片,54,细胞学检查的优缺点,优点： 方法简单安全，受检者痛苦小 设备简单，标本来源容易，可以反复获取。 制片技术简单，可以快速诊断缺点： 存在假阳性好假阴性 无法分辨细胞结构 无法明确细胞来源,55,细胞学检查基本技术,标本采集：刮片，抽吸，冲洗，针吸。涂片技术：动作轻巧，力度均匀，厚薄适宜涂片方法：退片，涂抹，印片，喷射，膜式沉淀，离心沉淀式薄层细胞学，爬片固定：95%酒精固定，1530min染色：HE染色，巴氏染色，瑞士染色细胞蜡块,56,标本采集注意事项,痰液应收集晨起深部咳出的痰尿液取中段尿尿液，胸腹水应当尽快制片，防止细胞自溶,57,哈瑞氏（harris）苏木素染液最常应用染色时间为510配制 蒸馏水 1000ml 苏木素 35g 碘酸钠 1g 钾明矾 5080g 水醋酸 20ml其优点是： 配后即可应用染色力较强。其缺点是： 极易产生金属膜沉淀。,HE染液的配制,58,埃利希（Ehrlich），苏木素染液 配制 无水乙醇 100ml 甘油 100ml 苏木精 2g 钾明矾 23g 醋酸 510ml置于阳光下自然氧化3个月左右成熟。其优点是： 染色结果甚佳，贮存愈久染色愈强，而且不需分色。,HE染液的配制,59,HE染液的配制,0.5%-1%水溶性伊红乙醇液：伊红y 0.5-1g+95%乙醇25ml+蒸馏水75ml+醋酸 12滴。 伊红 B： 0.5g+80%乙醇100ml溶解后用,60,组织病理学诊断的局限性,病理学诊断是疾病诊断的“金标准”？病理学诊断具有局限性： -活检不到位，组织不能代表病变 -组织挤压或电灼伤严重，影响诊断 -组织固定不良，自溶不能诊断 -非肿瘤性疾病，组织学无特征性改变 -疾病的复杂性，如疑难和少见病例的诊断免疫组化，组织化学，分子病理可以辅助诊断,61,