现代光学分析：第8章 多光子荧光 final version课件.ppt
第八章 多光子激发荧光原理与应用,2,共聚焦荧光显微镜存在的问题,共聚焦的激发光被散射或吸收 成像深度受限 细胞的光损伤与光漂白严重 不能长时间的观察 共焦针孔挡住了散射的荧光光子 不利于荧光信号的收集,普通光学显微镜,激光共聚焦扫描显微镜,多光子激发激光扫描显微镜,荧光显微镜,光学显微镜的发展历程,6,多光子激发的历史,1931年，Maria Geppert-Mayer提出双光子理论。1961年得到实验验证。1990年Denk, Strickler(Cornell University, USA)，将双光子激发用于荧光激发系统，制造出了世界上第一台双光子扫描显微镜，并应用于生物学观测。1997年，美国伯乐(Bio-Rad )公司首次制造出商业化的多光子显微镜。,5,多光子激发的基本原理,通常情况下，一个分子或者原子每次只能吸收一个光子，从基态跃迁到激发态。当光强足够高时，就会产生多光子跃迁，即一次吸收多个光子。一荧光分子的双光子吸收为例（下图），荧光分子同时吸收两个相同频率的光子，被激发至高能级，经过一个弛豫过程后发生自发跃迁，辐射出一频率略小于两倍入射光频率的荧光光子。,激发光,S0,S1,700nm,Fluorescence,Two-Photon Excitation,700nm,多光子荧光的特点：（1）. 荧光分子的多光子激发需要的激光波长比单波长长。如双光子激发波长大约是单光子激发所需激发波长的一倍。因此多光子激发能够用红外或者近红外光代替紫外光源。,8,(2) 多光子激发只产生在焦点附近的一个极小区域中。单光子吸收截面1=10-17 10-18cm2,双光子吸收截面210-49cm4s/光子三光子吸收截面3 10-75cm6s2 /光子依赖于多个光子同时到达,只有焦点处能满足多个光子同时达到产生多光子吸收。,共聚焦荧光,多光子荧光,单光子,双光子,（3）荧光强度与激发光功率对数的斜率（n）反映了荧光物质在被激发时吸收的光子数。,连续和脉冲激光器,连续激光,脉冲激光,高的瞬时功率,11,多光子激发光源的特点,脉冲宽度 75MHz平均功率 250mW,12,现有多光子激发光源,Ti:Sapphire (700 1000 nm) Spectra Physics /Millennia /Tsunami, Coherent) ,Nd:YAG (1064nm)激光泵浦， Microlase Optical Systems 功率大、波长范围宽Cr:LiSAF (800 900 nm) Bandwidth Products,二极管泵浦 当平均功率100mW，脉冲宽度100fs，波长可调谐范 围大约50nm ；热稳定性较差；价格低、无须水冷,为什么使用飞秒激光器？,多光子激发需要超快的激光器，皮秒脉冲不能实现三光子激发 。 深度成像需要更高、更窄脉冲输出功率。 多光子激发光源处于近红外区，对细胞毒性和光漂白更小。,100fs1000fs的脉冲激光产生同样荧光信号所需要的相对平均激发功率,脉冲宽度增加时多光子激发产生荧光强度的相对值降低,不同宽度的脉冲对样品不同深度成像时所需要的相对功率,多光子激发显微荧光成像系统,飞秒激光器共聚焦显微镜,共焦荧光显微镜与多光子荧光显微镜的光路图,21,specimen,S0,S1,specimen,lens(short ),(long ),gas laser Ar/Kr,solid-state laser titanium sapphire,10 ns,S0,S1,sunlight1P: 1s,sunlight2P: 10,000,000 y,universe,sunlight3P: age of,notes,end of slide show,Confocal versus MultiphotonLaser Scanning Microscopy,22,多光子显微镜对成像深度的改善 .利用红光或红外光激发，光散射小(小粒子的散射与波长的四次方的成反比）. .不需要针孔，能更多收集来自成像截面的散射光子。 .针孔不能区分由离焦区域或焦点区发射出的散射光子，多光子在深层成像信噪比好. .单光子激发所用的紫外或可见光在光束到达焦平面之前易被样品吸收而衰减，不易对深层激发。,300nm, 500nm, 700nm的光在大动脉组织内散射次 数随成像深度的变化。,24,多光子荧光成像的特点,.对生物样品的光损伤小。 克服了共聚焦显微镜在活体细胞和组织观察中的主要缺陷， 减少了焦点外的光学伤害和背景光强度，极大地降低了紫外光对生物体正常生理活动的破坏和影响，为活体观测和研究提供了有利条件。.有效观测时间长。 荧光染料的光致漂白（即染料分子会因激发次数过多结构受到破坏而失效）是制约实验观测，影响实验结果准确性的主要因素之一。 对于共聚焦显微镜，由于整个激光照射区域内的染料分子都会被激发，导致非焦点区域的染料过早漂白。 而双光子激光的光漂白只产生在焦点附近极小的区域内，从而大大减少了对非观测区荧光染料的破坏，使实验能够在保持生物活性的前提下长时间进行。,多光子,多光子将光漂白限制在焦平面,多光子成像减少光漂白,上图展示的是X-Z平面的光漂白图案，该图案的采集方式是驱动XY 扫描装置扫描用罗丹明（绿色）染色的Formvar 膜，使激光光束只在一个单一的XY平面反复移动扫描。 图中白色方框代表可以通过共聚焦针孔被检测器采集到的焦平面部分。 从白框的上下角发出的蓝色斜线代表激发光光线穿过薄膜的光路。 当光束扫描薄膜时，荧光染料被激发而产生次级荧光。最终在聚焦区域产生光漂白，黑色区域展示的是光漂白的结果。 经过共聚焦显微镜扫描的薄膜，无论焦平面还是其上方和下方，在光路经过的区域都会产生光漂白。 多光子显微镜扫描后，薄膜X-Z焦平面上被漂白的只有焦平面附近区域。,.穿透深度深。 生物体（细胞，组织等）一般都是高散射体。由于散射系数反比于入射光波长的四次方，多(N)光子成像将散射系数减弱到原来的1/N4，使大部分入射光强能够到达样品焦平面，提高了穿透深度，有利于获取深层次组织的清晰荧光图像。如假设单光子激发的散射系数为1，则双光子激发的散射系数为1/4 / 24 = / 16。那么三光子激发的散射系数是多少？,多光子荧光成像的特点,.荧光收集率高。 与共聚焦显微镜相比，双光子成像不需要光学滤波器（针孔），提高了荧光收集率。收集效率提高直接导致图像对比度提高。而共聚焦显微镜受到小孔限制，如果想提高收集效率，就需要扩大孔宽度，而这将导致分辨率下降，反之亦然。.信噪比高。 多光子吸收采用的波长是单光子吸收的2倍以上,所以生物试样中的瑞利散射更小, 荧光测定的信噪比更高。.对探测光路的要求低。 由于激发光与发射荧光的波长差值加大以及自发的三维滤波效果，多光子显微镜对光路收集系统的要求比共聚焦显微镜低得多，光学系统相对简单。,多光子荧光成像的特点,.适合多标记复合测量。 许多染料荧光探针的多光子激发光谱要比单光子激发谱宽阔。这样可以利用单一波长的激发光同时激发多种染料，从而得到同一生命现象中的的不同信息，便于相互对照，补充。 例如EGFP和DsRed的单光子激发波长分别是488nm和568nm，无法实现利用一束单波长激发光同时激发。 Jakobs等利用双光子技术，用925nm 激光同时激发了两种荧光蛋白，观察了它们在sherichia coli内的表达情况。,EGFP(488nm),(2) DsRed（一种在热带珊瑚虫提取的荧光蛋白）(568nm),Silmutaneous detection(925nm),多光子荧光成像的特点,26,多光子与共聚焦成像效果的比较,27,多光子与共聚焦成像效果的比较,28,共聚焦和多光子成像深度的比较,多光子激发在紫外成像的优势,.在可见光脉冲中能得到紫外衍射的显微观察像.,.即使不使用紫外域光源、光学元件仅用可见光源、光学元件就能得到紫外光激励的高空间分辨率图像.,多光子与单光子比较,单光子照明锥体大体积激发需要针孔荧光强度正比于I光漂白和光损伤较大,双(多）光子激发局限在焦点无需针孔收集散射光荧光强度正比于In光漂白和光损伤小深度成像31,32,多光子在生物成像中的优势,.在生物显微镜观察方面,最先考虑的是不损坏生物本身的活性状态,维持水分、离子浓度、氧和养分的流通。在光观察场合,无论是热还是光子能量方面都必须停留在细胞不受损伤的照射量、光能量内。,.多光子显微镜则能够满足此,而且还具有很多优点。如三维分辨率、深度侵入、在散射效率、背景光、信噪比、控制等方面,均有以往激光显微镜不具备,或具有无法比拟的超越特性。,33,多光子激发扫描显微成像系统的不足,.只能对荧光成像。 .如果样品包括能够吸收激发光的色团,如色素,样品可能受到热损伤。. 受昂贵的超快激光器限制, 多光子扫描显微镜的成本较高。,34,多光子激发显微镜应用举例,41,多光子激发光解笼与光激活,笼锁荧光素,追踪蛋白流动,核酸的运动,43,葡萄糖代谢NAD(P)H自发荧光,完整胰岛组织,光谱图骨骼肌细胞,NADH在胞浆和线粒体中分布优点：光损伤小，亚细胞信息，时间长,44,三光子激发成像,DNA三维形状：用DAPI（荧光染料）标记细胞核的DNA,多光子技术应用的早期研究成果,.钙生物学研究 与荧光探针技术相结合，多光子显微镜可以对细胞内的钙离子动态过程进行实时监测、对钙离子浓度进行准确测量，研究钙波、钙振荡现象同其他信号传导过程的联系，使对钙信号的研究从亚细胞层次深入到分子水平。 1994年，Piston和Webb用705nm的激光激发了分子探针Indo-1（单光子激发波长为355nm），获取了活细胞中的钙离子三维像。 1996年，他们又观察到了老鼠肌细胞局部自发钙离子释放现象。利用分子探针Indo-1和Fluo-3对钙离子进行了动态跟踪，观测到两种自发钙运动：从单个点向外传播的钙波和重复的、随机的从多个位置产生的钙“火花”（calcium sparks），并且测量了它们的传播速度和爆发频率。 多光子激发扫描显微镜还用于研究外界刺激或者其他离子、离子通道如钾离子通道对钙离子动力学的影响。,.神经学研究 在神经学研究中，Rose等首次用双光子激发对海马趾神经刺和锥状神经树中钠离子进行了瞬时动态测量。 Cox用双光子显微镜证明了动作电位能够影响神经轴，导致能够引起神经递质释放和目标神经突触激活的钙离子内流。,. 胚胎学与组织学研究 胚胎发育本身包含复杂的生命信息，对外界条件十分敏感。共聚焦显微成像往往妨碍胚胎发育，不能得到胚胎正常发育的信息。多光子成像非常适合胚胎发育的长期动态跟踪。 Squirrell和Wokosin等用多光子四维成像连续24h观察了hamster胚胎线粒体动力学，胚胎发育未受影响； 而对比实验中，共聚焦显微观察8h就抑制了胚胎发育的进行。 多光子能够获取深层次组织清晰的荧光图像，尤其适用于高散射介质的活体观测，具有其他光学显微镜不可比拟的优势。 共聚焦显微镜可以探测到牙齿表面下40m处，而双光子的探测深度可以超过100m。 Parasassi等利用双光子显微镜观察了Laurdan标记的纤维之间的细胞以及蛋白质自荧光，研究了小鼠主动脉血管壁横切面中氢氧化物诱导的蛋白水解过程。,40,Efficient Simultaneous,Detection of Multiple Labels,胚胎发育过程的长时间动态观测,.分子生物学研究 利用某些报告基因，多光子成像可以在不破碎细胞前提下显示基因在生物体内的表达，已广泛应用于基因转染和表达研究。 Jakobs等利用双光子荧光显微镜跟踪了drFP583（或者称为DsRed，一种从热带珊瑚虫中提取的荧光蛋白）和GFP在活体大肠杆菌中的表达。,(2)EGFP(488nm),(1) DsRed（一种在热带珊瑚虫提取的荧光蛋白）(568nm),Silmutaneous detection(925nm),.代谢过程研究 多光子技术可以用来对标记物质的代谢过程进行监测，记录代谢物的分布、代谢速度，从而突破传统的生物化学分析方法，从单个细胞层次实时研究代谢过程，已应用于药物、糖类等物质的代谢研究。 例如，细胞内NAD(P)H水平反映了葡萄糖的代谢水平；哺乳动物组织中的葡萄糖代谢时间经历数小时，而且NAD(P)H酶的自荧光激发需要360nm紫外光。 受对细胞活性和组织的光损伤局限，共聚焦显微镜无法实现这种观测；多光子技术就能很容易地解决这一问题。 Piston利用双光子技术观察了不同细胞中NAD(P)H自荧光的变化。,.化学疗法的动态跟踪 化学疗法经常用来治疗癌症，但其治疗机制并不完全清楚。将荧光染料C-652li连到化学药物AN-152上，利用双光子技术可以直接观察其与细胞的作用过程。 结果表明，AN-152直接进入细胞质，然后进入细胞核。这一技术有助于了解药物的作用机理，改善治疗效果。,Fig. Fluorescence images of a single MCF-7 cell(LH-RHreceptor-positive), taken 4min(a), 20min(b), 40min(c), and 50min(d) after treatment with AN-125:C625(0.6uM).,4min,20min,40min,50min,.笼锁化合物的定点释放 许多重要的生物物质都有其笼锁化合物。处于笼锁化合物状态的生物物质功能被封闭；特定波长的光可以使其光解笼锁，恢复活性和功能； 人为的控制笼锁化合物的定点、定时释放，便于研究生物物质的代谢过程，并根据治疗、发育的要求进行人工操控。 Webb研究小组利用双光子技术实现了钙离子笼锁化合物的定点释放。 Pettit等通过对单个细胞内的笼锁谷氨酸的研究，对谷氨酸受体在神经细胞上的分布进行了研究。,.荧光关联谱学 荧光关联谱学（fluorescence correlation spectroscopy, FCS）是一种同单分子探测技术密切相关的信号处理方法。它利用微区内发光分子的荧光涨落获得有关荧光分子浓度、荧光分子扩散速度等信息，分析产生涨落的物理机制。 FCS首先应用于溶液等非生物体系。随着FCS技术的成熟，目前。FCS探测已经深入到细胞内部，并且达到单分子层次。 例如，利用FCS技术可测量注射到细胞内荧光小球的扩散系数；与绿荧光蛋白（GFP）结合，可进行活细胞内部蛋白质扩散系数的测量。,.多光子光谱学 基于多光子吸收的物理实验方法已在多光子谱学研究领域得到了广泛应用。 由于双（多）光子吸收所达到的能级与通过单光子吸收所达到的能级是不同的，双（多）光子吸收光谱给出与单分子吸收不同的光谱信息。 多光子光谱也被用来研究原子的运动状态，并广泛应用于原子分子物理学和量子力学研究。,.三维光学存储 目前存储密度最高的技术是以光盘为代表的存储技术。从VCD到DVD，虽然存储容量增加了，但是从存储的方式上讲，仍然是二维平面存储，即信息的存储和读取局限于一个平面上，不考虑纵向的分辨。 双光子技术在横向和纵向的高分辨率，避免了层与层之间的数据在写、读时的相互干扰，为三维高密度存储提供了技术保证。 1989年，Parthenopolous和Rentzepis等提出并实现了一种三比特数据存储方法，在现有的二维光盘的基础上将数据存储扩展到三维空间（即分层存储）。利用双波长、双光束产生的双光子激发，层内和层间距离分别达到30m和80m。 1991年，在利用一束光实现双光子激发的基础上，Webb等将记录介质层内的比特间距和层间距分别达到1m和3m，在光致聚合物上记录了10层数据。(Opt.Lett.1991,16(22),1780.) 1997年，Wang和Rentzepis等将记录的层次提高到了100层，从而将存储密度提高若干个数量级。(Opt.Lett.1997,22(8),558.),Combining myeloperoxidase (MPO) with fluorogenicZnSalen to detect lysosomal hydrogen peroxide,Chem.Sci.2013,4,2947,双光子荧光探针的最新进展,MPO-mediated strategy for lysosomal H2O2 detection,Chem.Sci.2013,4,2947.,(a) Confocal images of HeLa cells loaded with “MPO-J-S” under different stimulants. (i) Cells were treated with “MPO-J-S” for 12 h at 37 C. (ii) Cells loaded with “MPO-J-S” for 12 h were treated with H2O2 for 30 min. (iii) Cells loaded with “MPO-J-S” for 12 h were treated with PMA for an hour; upper: fluorescence images; below: merged images of fluorescence channel and DIC; red for “MPO-JS” and blue for Hoechst 33582, a nucleus marker. (b) Quantitative assays for intracellular H2O2 detection in HeLa cells. (c) Plot of the fluorescence intensity changes along with H2O2 concentrations.,Target-Activated Modulation of Dual-Color and Two-Photon Fluorescence of Graphene Quantum Dots for in Vivo Imaging of H2O2.,Anal. Chem. 2016, 88, 4833.,(A) Schematic Illustration of Target-Activated Modulation of Dual-Color and Two-photon Luminescence of TPGQD420 via FRET Process; (B) Mechanism of H2O2-Induced Tautomerism from Opened Merocyanine to Closed Spiropyran.,Anal. Chem. 2016, 88, 48334840.,In vivo ratiometric TPM images (Fblue/ Fgreen) of endogenous H2O2 levels in mice. As a control, mice untreated (A, only saline) or unstimulated (B, with TPGQD420BMC3 PEG, 100 g/mL) or inhibited (C, treatment with NAC (1.2102 M) and thenTPGQD420BMC3PEG (100 g/mL) were imaged. Finally, the LPS (1.0 g/mL)-stimulated mice injected with the nanoprobe (100 g/mL) (D) were also investigated. The images displayed in pseudocolor were obtained from different depths of the peritoneal cavity by signals process of two channels (400450 nm, 500550 nm)upon excitation at 740 nm. Scale bar = 200 m.,双光子检测NO,Plos one ,2013,8,e75331.,A fast and selective two-photon phosphorescent probe for the imaging of nitric oxide in mitochondria,Biomaterial,2015,58,72.,Schematic illustration of the reaction between iridium(III) complexes and NO.,Biomaterial,2015,58,72.,(a) Enhancement of the phosphorescent intensity upon addition of 100 equiv. NO to a solution of Ir-Mito-NO in PBS. (b) Reaction efficiency curves of Ir-Mito-NO after addition of 100 equiv. of NO. (c) Specificity for NO. (d) Cell viability of HeLa cells treated with two Ir(III) complexes for 8 h.,Biomaterial,2015,58,72.,(a) The confocal microscopy images of HeLa cells prestimulated with LPS for 4 h and then incubation with Ir-Mito-NO. The wavelengths for one and two-photon excitations were 405 and 730 nm. The emission was collected at 530-600 nm (for Ir-Mito-NO) and 488-530 nm (for Mito Tracker Green). (b) HeLa cell endogenous NO tracking by using Ir-Mito-NO. The cells were stimulated by low power laser irradiation (488 nm) to generate NO. (c) The phosphorescent intensity changes of Ir-Mito-NO in selected cells (white trace in b) during stimulation by low power laser irradiation (Orange) and the control experiment pre-treated with L-NMA than stimulation by low power laser irradiation (Blue).,A two-photon “turn-on” fluorescent probe based on carbon nanodots for imaging and selectivebiosensing of hydrogen sulfide,Analyst，2014,139,1945.,Scheme of the assay,(A) Two-photon fluorescence spectra of C-Dot-TPEA upon addition of different concentrations of Cu2+. Ex: 800 nm; (B) plot of fluorescence intensity at 495 nm of C-Dot-TPEA with the addition of Cu2+;(C) two-photon fluorescence spectra of the mixture of C-Dot-TPEA and Cu2+ upon addition of different concentrations of Na2S. Ex: 800 nm; (D) plot of fluorescence intensity at 500 nm of the C-Dot-TPEACu2+ in the presence of increasing Na2S.,A dincomplexuclear iridium(III) as a visual specificphosphorescent probe for endogenous sulphite,Chem.Sci.2013,4,4426.,双光子荧光检测O2,Nat.Rev.Urol.,2009,6,18.,双光子荧光检测Cu2+,Che.Eur.J.2013,19,15494.,双光子荧光检测Cd2+,Dyes Pigments,2014,101,30.,双光子荧光检测Hg2+,Talanta,2010,83,658.,双光子荧光检测焦磷酸阴离子（PPi),Sensors Actuate B-Chem.2013,183,124.,Fig. (a) The fluorescence spectra of L quenched by Cu2+. (b) The fluorescence spectra of 49 restored by PPi,双光子荧光检测ATP,Chem.Commun.2012,48,3206.,Two-photon fluorescence images of the intracellular ATP stores of A549, MCF-7, PANC-1, PC3, PNT-2, AsPC-1 and SNU-216 cells before and after treatment with 1-Zn(II) (100 mM) for 5 min.,RuNH2AuNPs as two-photon luminescent probes for thiols in living cells and tissues,Biomaterials,2014,35,9003.,Schematic diagram of the release of the Ru(II) complex from the RuNH2AuNPs via thiols displacement.,Biomaterials,2014,35,9003.,(a) Two-photon absorption cross section of RuNH2AuNPs and RuNH2AuNPs + RSH at excitation wavelengths from 700 to 1050 nm. (b) Logarithmic two-photon luminescence intensity of RuNH2AuNPs + RSH as a function of the log pump power at 800 nm excitation. The solid lines are the best fit straight lines with slopes n =1.9775-2.0095.,
