第16章 电泳仪分析课件.ppt

电泳技术和电泳仪,一、概述,目前，电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、无机离子等成份的分离和鉴定，甚至还用于细胞与病毒的研究。 临床常用的电泳分析方法主要有醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和毛细管电泳等。,二、电泳原理,带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。生物分子通常带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。,二、电泳原理,在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。 FQE 质点的前移同样要受到阻力 f 的影响，对于一个球形质点，服从Stokes定律，即：f 6 r （r为质点半径，为介质粘滞系数，为质点移动速度）,二、电泳原理,当质点在电场中作匀速运动时：F f 即：QE6r v=QE/6r uv/E=Q/6r迁移率u：单位电场强度下的电泳速度， 粒子的迁移率在一定条件下决定于粒子本身的性质即其所带电荷及大小和形状。,二、电泳原理,同时根据迁移率的定义，电泳移动速度V为单位时间t（单位为s）内移动的距离d（单位为cm），即Vd/t。电场强度E为单位距离L（单位为cm）内电势差E（单位为伏特），即EU/L。将这两个公式代入上述公式，得到 u=v/E=dL/Ut d=u*Ut/L由此可以得到两种物质移动距离的差为 d=(dA-dB)=(uA-uB)Et/L从这个公式可以看出物质能否进行分离决定于二者的迁移率。,三、电泳迁移分离的影响因素,1.电场强度：过高，产热，样品和Buffer扩散增加，条带增宽；蛋白变性。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置2.等电点3.缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大 ；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；一般所用离子强度为0.02-0.2之间。,三、电泳迁移分离的影响因素,3.电渗：电场中液体对固体支持物的相对移动.当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。4. 支持介质的筛孔 ：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大5.吸附作用,三、电泳迁移分离的影响因素,6.待分离大分子的性质（迁移率） ：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快,四、常用电泳技术和电泳方法,根据工作原理的不同：可分为移界电泳、区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳、免疫电泳等。,五、电泳方法简介,（一）纸电泳 指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。将滤纸条水平地架设在两个装有缓冲溶液的容器之间，样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后，再盖上绝缘密封罩，即可由电泳电源输入直流电压（100V1000V）进行电泳。,五、电泳方法简介,（二）醋酸纤维素薄膜电泳 电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、 电泳时间短、样品 用量少。因此特别 适合于病理情况下 微量异常蛋白的检测。,五、电泳方法简介,（三）凝胶电泳 由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上进行，以凝胶作为介质（多孔性，类似分子筛的作用）。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖。 它具有机械强度好、弹性大、 透明、化学稳定性高、无电渗 作用、设备简单、样品量小 (1100g）、分辨率高等优点。,五、电泳方法简介,（四）等电聚焦电泳 1 等电聚焦电泳过程 一种利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH值梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH值位置上，最后，样品的各组分在各自的等电点聚焦成一条清晰而稳定的窄带。,五、电泳方法简介,2等电聚焦电泳的特点 使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度；由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；电泳速度快;分辨率高;加入样品的位置可任意选择；可用于测定蛋白质类物质的等电点;适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。,五、电泳方法简介,（五）等速电泳 采用两种不同浓度的电解质组成，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。前导电解质的迁移率高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中 移动，实现分离。,五、电泳方法简介,（六）双向凝胶电泳（二维电泳） 第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。 第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状 。,五、电泳方法简介,胶性 PH9中电加解入质了溶双液 PH3,加上电场后建立稳定PH梯度,蛋白质溶液加入，建立电场,染色后，蛋白质因PI值不同，沿PH梯度分离开,第一向等电聚焦,PI逐渐降低,等电聚焦胶放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上,第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量逐渐降低,06-07 双向凝胶电泳示意图,PI 逐渐降低,五、电泳方法简介,（七）免疫电泳 免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。,六、常用电泳设备的基本结构,（一）电泳电源（二）电泳槽（三）附加装置,七、电泳仪的主要技术指标,1 输出电压 8 连续工作时间 2 输出电流 9 保护措施 3 输出功率 10 显示方式 4 电压稳定度 11 定时方式 5 电流稳定度 12 电源电压 6 功率稳定度 13 电源频率 7 输出组数 14 功耗,八、高效毛细管电泳仪,八、高效毛细管电泳仪,（一）毛细管电泳的基本工作原理 溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间迁移率和分配行为上的差异 而实现分离。,八、高效毛细管电泳仪,电渗流（electroosmotic flow，EOF）：当在毛细管两端加有电场时；扩散层内可迁移的阳离子向阴极移动。由于离子是被水化的，因此，在缓冲液中的液体也随迁移着的阳离子一道，向阴极移动，形成一种液流。它是一种电泳驱动力。,八、高效毛细管电泳仪,八、高效毛细管电泳仪,在许多情况下，电渗流速度比许多质点的电泳速度要快，因此，在毛细管中的所有溶质将朝一个方向迁移，不管它们带多少正电荷，都将先被检出，继之中性质点被检出，最后带负电荷的质点被检出。如下图所示。,八、高效毛细管电泳仪,迁移速度等于电泳淌度和电渗流的矢量和,八、高效毛细管电泳仪,（二）结构、流程和主要部件,电压：030kV； 分离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：10-1910-21 mol/L）,八、高效毛细管电泳仪,1.高压电源（1）030 kV 稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；2. 毛细管柱 （1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差； （2）规格：内径2075m，外径350400m；长度=1m,八、高效毛细管电泳仪,3.缓冲液池 化学惰性，机械稳定性好；4. 检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测； 检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；类型 质量检测限/mol 特点紫外-可见 10-1310-16 加二极管阵列，光谱信息荧光 10-1510-17 灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光 10-1810-20 灵敏度极高，样品需衍生电导 10-1810-19 离子灵敏，需专用的装置,八、高效毛细管电泳仪,（三）毛细管电泳的特点1. 高灵敏度 2. 高速度 3. 高分辨率 4. 样品少 5. 自动化程度高 6. 应用范围广,八、高效毛细管电泳仪,（四）毛细管电泳的分离模式 （1）毛细管区带电泳 它是通过在充满电解质溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下，依迁移速度的不同而进行分离的。根据组分的迁移时间 进行定性，根据电泳峰 的峰面积或峰高进行定 量分析。,八、高效毛细管电泳仪,（2）毛细管凝胶电泳将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，能根据待测组分的质荷比和分子体积的不同而进行分离。适用于分离、测定肽类、蛋白质、DNA类物质的分离。,八、高效毛细管电泳仪,（3）毛细管胶束电动色谱(MECC) 使MECC系统中存在两个相：流动的水相和起到固定相作用的胶束相。在含有胶束的流动相中，溶质在“水相”和“胶束相”(准固定相)之间进行分配，即使是中性溶质，因其本身疏水性不同，在二者之间的分 配也会有差异，疏水性强的溶质在“胶束相”中停留时间长，迁移速度就慢。反之，亲水性强的溶质迁移速度就快，最终中性溶质将依其疏水性不同而得以分离。,八、高效毛细管电泳仪,06-12毛细管胶束电动色谱原理图,八、高效毛细管电泳仪,（4）毛细管等电聚焦电泳 不同等电点的分子分别聚集在不同的位置上，不作迁移而彼此分离，这就是等电聚焦分离过程。毛细管的等电聚焦是在毛细管内实现的等电聚焦过程，具有极高的分辨率，通常可以分离等电点差异小于 0.01pH单位的两种蛋白质，例如肽类、蛋白质的分离。,八、高效毛细管电泳仪,（5）毛细管等速电泳 毛细管内首先导入具有比被分离各组分高迁移率的前导电解质，然后进样，随后再导入比各分离组份低迁移率的尾随电解质，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中发生分离。,八、高效毛细管电泳仪,（6）毛细管电色谱 它包含了电泳和色谱两种机制，是在毛细管中填充 或在毛细管壁 上键合（或涂壁）固 定相，从而构成毛细 管色谱柱，依靠电渗 流推动流动相，携带 样品迁移，根据样品 分子的质荷比、分子 尺寸及分配系数的差 别而分离。,八、常用电泳仪简介,（五）常用各种电泳仪简介 （1）稳压稳流电泳仪 稳压稳流电泳仪是中压电泳仪。其输出电压的调节范围为0V600V、输出电流为0mA100mA。该机工作稳定性好、调节范围宽，并设有完善的短路保护电路和过流保护电路，是目前国内中、低压电泳实验中应用最广泛的电泳仪之一。,八、常用电泳仪简介,（2）全自动醋纤膜电泳仪 全自动醋纤膜电泳仪为全自动电泳仪，有可见光单系统，使用醋酸纤维薄膜电泳片，优点为自动化程度高。只需将样品、试剂、电泳片放好，人员可离机完成实验并得到结果。,八、常用电泳仪简介,（3）全自动荧光/可见光双系统电泳仪 全自动荧光/可见光双系统电泳仪为全自动电泳仪，具有荧光/可见光双系统，在使用荧光试剂项目如同工酶时为全自动。只需将样品、试剂、琼脂糖凝胶电泳胶片放好后，操作人员可离机完成实验并得到结果。,八、常用电泳仪简介,（4）全自动琼脂糖电泳仪 全自动电泳仪，有可见光单系统，使用琼脂糖凝胶电泳胶片，优点为灵敏度高，可适用于低浓度蛋白检验 。该仪器自动化程度较差，当电泳结束和染色脱色完成后，工作人员必须将电泳片由机器中取出。,八、常用电泳仪简介,（5）双向电泳及双向电泳-液相色谱-质谱联用 双向电泳是将样品进行电泳后，在它的直角方向再进行一次电泳。双向电泳第一向为等电聚焦，第二向为梯度SDS电泳。样品经过电荷与质量两次分离后可得到分子的等电点、分子量等信息。这是目前所有电泳技术中分辨率最高，信息量最多的技术，已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具。,质谱仪的原理及结构,八、常用电泳仪简介,（6）高效毛细管电泳及高效毛细管电泳-质谱联用（7）毛细管电泳芯片（8）DNA测序系统,九、电泳仪的临床应用,（一） 血清蛋白电泳 新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色后，通常可见5条带，即清蛋白、1、2、和球蛋白。许多疾病总血清蛋白浓度和各蛋白组分的比例有所改变，通过血清蛋白电泳图谱能帮助我们对某些疾病进行诊断及鉴别诊断。,九、电泳仪的临床应用,（二）尿蛋白电泳,九、电泳仪的临床应用,（三）血红蛋白及糖化血红蛋白电泳,九、电泳仪的临床应用,（四）免疫固定电泳,九、电泳仪的临床应用,（五） 同工酶电泳（六）脂蛋白电泳,十、电泳技术的质量控制,（一）电泳分析前的质量控制 （1）标本的采集与保存 （2）电泳分析的选择 （3）电泳试剂的保存（二）电泳分析中的质量控制 （三）电泳分析后的质量控制,全自动电泳仪简介,SPIFE3000 全自动蛋白电泳系统,SPIFE3000 全自动蛋白电泳系统,放入电泳片自动点样 、电泳,SPIFE3000 全自动蛋白电泳系统,染色、脱色、烘干,一次扫瞄整个电泳图谱,SPIFE3000 全自动蛋白电泳系统,血清蛋白电泳,高敏蛋白电泳 血红蛋白电泳,SPIFE3000 全自动蛋白电泳系统,