细胞衰老课件.pptx
Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging,Cell,Baar et al., 2017, Cell 169, 132147 March 23, 2017 2017 Elsevier Inc.,1,DNA损伤修复,Apoptosis,Senescence,or,背景介绍,清除,持续累积,加速疾病、衰老,（衰老细胞）,2,退出细胞周期；形成持续的促炎表型衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）；影响组织微环境；早期对于创伤愈合有利。,衰老细胞：正常细胞受到不可修复的压力后形成的持续的损伤状态。,年轻组织中：少量衰老细胞分泌SASP，诱导多能性干细胞形成分化并促进组织修复。,SASP影响干细胞信号转导以及分化。IL-1：抑制干细胞分化；IL-6：诱导并维持干细胞多能性。,3,衰老组织中：衰老细胞大量堆积，并分泌SASP，致使其邻近细胞被封锁于持续的类干性样的去分化状态，不能进行分化或组织修复。,衰老-干性加锁模型:,4,FOXOs家族:（Forkhead box O family,叉头框转录因子O家族)。作为insulin /IGF信号通路的靶基因，调节体内的抗氧化反应以及DNA损伤修复。,如何靶向衰老细胞:,5,FOXO4在衰老细胞中表达上调，并维持其活性；FOXO4-DRI扰乱PML/DNA-SCARS，衰老细胞释放激活的p53；FOXO4-DRI选择性并强力靶向衰老细胞进入p53依赖的凋亡；FOXO4-DRI对抗化疗药引起的衰老；FOXO4-DRI抗衰老以及抵抗快速衰老Xpd TTD/TTD小鼠脆弱的特征；FOXO4-DRI逆转快速衰老小鼠肾功能下降；FOXO4-DRI减轻自然衰老小鼠的衰弱以及肾功能下降。,实验结果,6,FOXO4在衰老细胞中表达上调，并维持其活性；,衰老细胞模型：IMR90原代人成纤维细胞（基因组稳定），电离辐射（IR）诱导细胞衰老。,凋亡相关信号通路的变化？,促凋亡因子PUMA， BIM显著上调；抗凋亡因子Blc-2减少。,“刹车”,衰老细胞存活的关键？,Q,7,凋亡相关的转录因子：,STAT1/2/4， NF-kB， TP53， FOXO4,X,X,X,8,慢病毒shRNA沉默FOXO4促进衰老细胞凋亡。,结论：FOXO4通过抑制凋亡通路促进衰老细胞的存活。,9,FOXO4-DRI扰乱PML/DNA-SCARS，衰老细胞释放激活的p53；,衰老细胞内FOXO4募集至常染色质区。,设计化合物干扰FOXO4的功能。,10,衰老细胞中，PML小体与含53BP1的DNA-SCARS（染色质改变增强衰老DNA片段）融合并联合调节衰老相关分泌表型SASP的表达。p53：调节凋亡及衰老，并定位于DNA-SCARS，被ATM于Ser15位磷酸化，阻断MDM2介导的降解。,高分辨结构显微镜,FOXO4结合在PML小体上，与含53BP1的DNA-SCARS紧密相邻。,FOXO4与pSer15-p53紧密相邻。,11,设计多肽：选择FOXO4-p53相互作用的结构域，且与FOXO1，3不重叠，在人与小鼠中均保守。,FOXO4-DRI：FOXO4肽的D-retro inverso（DRI）异构型，即利用D型氨基酸取代肽链中正常L型氨基酸，并且反转这种肽链主骨架的方向。,12,NMR-滴定法：将重组p53的N末端结构域滴定至1H，15N-标记的FOXO4的Forkhead结构域的溶液中，会导致1H，15N HSQC的交叉峰的化学位移，表明p53与FOXO4特异性结合，逐步滴加FOXO4-DRI肽使FOXO4的化学位移恢复至未结合状态。说明FOXO4-DRI肽可以竞争性与FOXO4结合，且较p53亲和力更高。,13,FOXO4-DRI肽与HIV-TAT（亲水序列）融合：通过形成暂时的孔隙促进非能量依赖的FOXO4-DRI的摄取。,摄取：,14,FOXO4可调节衰老细胞中p21cip1的表达，通过p21cip1 ，p53可诱导p16in4a不依赖的细胞周期阻滞，并通过转位至线粒体内激活促凋亡基因的表达。,Cdkn1a：p21Cip1的编码基因的启动子。其中两个p53结合位点中间包含一段FOXO的靶序列。,FOXO4-DRI对于p21Cip1以及p53的作用？,FOXO4-DRI减少衰老相关的p21Cip1的表达。促进p53聚积并促进活化的pSer15-p53的核外排。,结论：FOXO4-DRI干扰FOXO4与p53结合，破坏衰老相关FOXO4/PML/DNA-SCARS复合物，并导致p53活化及核外排。,15,FOXO4-DRI选择性靶向衰老细胞进入p53依赖的凋亡；,FOXO4-DRI抑制衰老细胞存活。,实时细胞密度监测。,16,另外两类靶向衰老细胞的化合物：槲皮素/达沙替尼非特异性靶向衰老细胞泛BCL抑制剂ABT-263/737对衰老细胞有一定选择性但低剂量对正常细胞即有杀伤。,FOXO4-DRI对于衰老细胞杀伤更强，且对正常细胞毒性较小。,连续多次低剂量给药方案：,17,53以及Caspase介导FOXO4-DRI对于衰老细胞的杀伤。,FOXO4-DRI诱导衰老细胞内Caspase3/7活化。衰老细胞靶向凋亡（targeted apoptosis of senescent Cells，TASC）,18,体内衰老模型：化疗药引起的衰老阿霉素（Doxo）为代表快速衰老模型XpdTTD/TTD小鼠自然衰老模型,体内衰老细胞监测：p16：3MR,19,FOXO4-DRI抵抗化疗药引起的衰老以及肝功能损伤；,Doxo诱导IMR90细胞衰老以及SASP。,20,FOXO4-DRI耐受性优于BCL i,提前或同时给予FOXO4-DRI处理不会加重Doxo对细胞的杀伤。仅在Doxo诱导细胞衰老之后促进衰老细胞的死亡。,21,序贯疗法:,Doxo：10 mg/kg，2次FOXO4-DRI：5 mg/kg，4次,Doxo诱导小鼠体内细胞衰老以及肝损伤。,22,23,利用GCV靶向清除衰老细胞,结论：FOXO4-DRI可以有效清除阿霉素诱导的衰老细胞并削弱阿霉素诱导的肝毒性。,24,FOXO4-DRI逆转快速衰老XpdTTD/TTD小鼠衰老脆弱的特征；,快速衰老模型： XpdTTD/TTD小鼠 三个月即可出现衰老的特征。,XPD：编码DNA解旋酶的基因在DNA损伤修复以及转录中发挥重要的作用。TTD：早衰营养不良毛发稀疏综合症。XPD突变。TTD鼠表现为：骨质疏松/硬化/不孕不育/寿命短等衰老特征。,25,26,行为学实验：,对外界刺激的反应能力增加，活动增加。,结论：FOXO4-DRI可以逆转快速衰老小鼠衰老以及脆弱的特征。,27,FOXO4-DRI逆转快速衰老小鼠肾功能下降；,衰老小鼠血液中尿素水平升高，肾小管区域SA-GAL染色以及IL-6分泌增加，肾小管细胞FOXO4水平增加。,28,体外肾切片模型：,FOXO4-DRI可诱导衰老小鼠肾内凋亡细胞增加。,29,安全性评价：,FOXO4-DRI不会引起血小板减少或不可增殖的器官（如心脏）的损伤。,30,FOXO4-DRI减少SASP并减轻肾损伤。,衰老细胞中LMNB1丢失。,结论：FOXO4-DRI通过靶向肾内的衰老细胞使快速衰老小鼠的肾功能恢复正常。,31,FOXO4-DRI减轻自然衰老小鼠的衰弱以及肾功能下降。,32,结论：FOXO4-DRI靶向清除肾内的衰老细胞可以使自然衰老小鼠的肾功能恢复正常。,33,Highlights1.一种改良的FOXO4-p53干扰肽可以导致衰老细胞内p53的核外排2.该FOXO4多肽可诱导衰老细胞靶向凋亡（ targeted apoptosis of senescent cells, TASC）3.TASC效应可以削弱阿霉素诱导的肝毒性4.TASC可以使快速衰老以及自然衰老的小鼠重获青春（健康，毛发变密，肾功能恢复）,讨论,FOXO4：衰老细胞存活的中心。,34,清除衰老细胞：没那么简单！还有很多悬而未决的问题,35,Thank you！,36,
