气相色谱分析方法课件.ppt

一、色谱分析法概述,Chromatography,1.色谱分析法简介2.色谱分析法原理3.色谱分析法分类4.色谱分析法特点5.色谱分析法应用6.色谱常用术语,色谱法，也称层析法、层离法。 色谱法是混合物最有效的分离、分析方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差异（如吸附作用、分配作用、电离作用等），使各组分以不同程度分布在两相中: 其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是流动的，称为流动相。 当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，从而达到互相分离。,1.色谱分析法简介,2. 色谱分离原理,试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在色谱柱中的两相间不断进行着的分配过程。在一定温度下，组分在固定相和流动相间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数，用K 表示，即：,分配系数是色谱分离的依据。,慢中等快,色谱分离,色谱法,液相色谱法,气相色谱法,气-液色谱法,气-固色谱法,液-固色谱法,液-液色谱法,2.色谱分析法分类,其他色谱方法,薄层色谱和纸色谱离子色谱：以特制的离子交换树脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。凝胶色谱法,4.色谱法的特点(1)高选择性 、(2)高效能、 (3)高灵敏度可以分析质量分数为10-610-9数量级、检出限量低至10-1l g的物质，适于微量和痕量分析。,5.色谱法的应用(1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析；,(2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。,(3)色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，常用于制备分离，得到高纯样品。,(4)色谱质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。,6、色谱常用术语,色谱图 进样后色谱柱流出物通过检测系统时，响应值随流出时间而分布的曲线称为色谱曲线图或色谱图。,基线：纯流动相经过检测器时,检测到的信号,体现系统的稳定情况。色谱峰的高度、宽度、半峰宽度（h、Y 、Y1/2）保留值（保留时间tR ，死时间t0 ，调整保留时间tR）峰面积相对保留时间.,6、色谱常用术语,相对保留值r21,组分2与组分1调整保留值之比： r21 = tR2 / tR1= VR2 / VR1,r21值越大，两组分的色谱峰相距越远，分离得越好； 用于定性分析。,分离效果的评价分离度R,定义为两相邻组分保留时间之差与两峰底宽度和之半的比值。,R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。,色谱法研究的核心：选择最适合的色谱体系和条件，在最短的时间达到最佳的分离效果。,高效液相色谱分析法,流程及主要部件主要类型操作条件的选择操作步骤与定性、定量分析,二、流程及主要部件,1.流程,高压输液系统进样系统色谱柱检测系统记录仪,2.主要部件,高压输液泵在线脱气装置进样装置色谱柱检测器,(1) 高压输液泵动力元件 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。(2)在线脱气装置 在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。,(3) 进样装置,注射器进样装置 高压定量进样阀(六通阀),(4) 色谱柱-高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm,柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,一般在分离前备有一个前置柱,(5) 液相色谱检测器,紫外检测器示差折光检测器,紫外光度检测器（UV）：可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光光二极管阵列检测器（PDA）：钨灯和氘灯组合光源优点：这种检测器对温度和流速不敏感，适宜于梯度洗脱。缺点：不能用于对紫外-可见光完全不吸收的试样。, 示差折光检测器,一种浓度型检测器，是通过连续测定测量池中溶液折射率的变化来测定组分的浓度。溶液的折射率等于溶剂及其中所含各组分溶质的折射率与其各自的摩尔分数的乘积之和。优点：凡与流动相折射率不同的组分，都可以用差示折光检测器来检测，所以差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7gmL-1。缺点：对温度和流速的波动很敏感。,1.分离原理,K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。,三、液一液分配色谱法（LLPC）,2.固定相,使固定液与担体之间形成化学键，常用的是在硅胶表面利用硅烷化反应，形成SiOSiC型键。如十八烷基键合硅胶柱（简称碳十八柱，ODS柱）,反相色谱适用于弱极性或非极性化合物的分离。其流出顺序是极性大的先流出，极性小的后流出。,3. 流动相,1. 流动相的流量、性质和极性,采用二元或多元组合溶剂作为流动相（甲醇，乙腈）色谱纯使用前过滤、脱气,2洗脱方式,1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 2）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 适于分析极性差别较大的复杂组分。3. 柱温 可控，一般选室温25左右。,四、液相色谱柱分离条件的选择,流动相的选择原则：,(1)应具有足够的纯度，一般选用色谱纯试剂。 (2)流动相与固定液应互不相溶。 (3)流动相对试样各组分应有适当的溶解度。 (4)粘度小。 (5)检测器对流动相不产生响应。,反相色谱最常用的流动相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。水甲醇体系：大约50水的时候粘度最大水乙腈体系：35水的时候粘度最大。,五、操作步骤与色谱的定性、定量分析1、操作步骤首先是进行分析中所用各种标准液、试样液、混合液等的配制及流动相的配制（过滤、除气）；二进行色谱系统的选择及有关参数的确定；三进行进样分析测定；最后是计算并出具报告。2、色谱的定性、定量分析高效液相色谱法的基本概念、理论基础及其常用的定性、定量分析方法与气相色谱法相同。,六、高效液相色谱法的应用和进展,1、在生物化学和生物工程中的应用2、在医药研究中的应用3、食品分析4、环境分析5、精细化工,高效液相色谱法测定饮料中各糖类的含量,查阅资料，确定色谱条件。包括：液相色谱仪，配（）检测器，检测波长（） nm；色谱柱：C18柱(25 cmX4.6 mmID，5 um)柱；流动相：A一B一C (？+？十？)；流速： （） mL/min；进样量：（）mL。,液相色谱仪的操作,高效液相色谱法测定速溶咖啡中咖啡因的含量,1、实验原理样品用水溶解过滤后，用配有紫外检测器的高效液相色谱(HPLC)测定咖啡因，外标法定量。2、实验器材所有试剂除特殊注明外，均为分析纯，水为超纯水。乙睛：色谱纯；咖啡因标准品：纯度 99%；标准储备液(100 mg/L)：准确称取0.010 0 g咖啡因标准品于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，作为标准储备液。根据需要再用水将标准储备液稀释成适当浓度的标准工作液。4、仪器和设备4.1 高效液相色谱仪配紫外检测器4.2 超声波振荡器,5、操作步骤5. 1 提取 称取0. 1 g(准确至 0. 000 1 g)均匀试样于 100 mL容量瓶中，加人 80 mL水，置超声波振荡器中声 20 min，冷却后用水定容至刻度并混匀，过 0. 45 um滤膜后，供HPLC测定。,5.2 测定5. 2. 1 色谱条件 a) 液相色谱仪，配紫外检测器，检测波长273 nm； b) 色谱柱：C18柱(25 cmX4.6 mmID，5 um)柱或相当柱； c) 流动相：乙睛一水一乙酸(16+83十1)； d) 流速 0. 5 mL/min； e) 进样量 5 mL/min。,5. 2. 2 色谱测定 根据样液中咖啡因的含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中的咖因的响应值均应在仪器的检测线性范围内，对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色条件下，咖啡因的保留时间约为 9 min。标准色谱图参见下图。,5. 2.3 空白实验 除不加试样外，按上述测定步骤进行6、结果计算 用色谱数据处理机或按公式计算试样中咖啡因的含量，计算结果应扣除空白值：式中：X 试样中咖啡因的含量，单位为毫克每千克(mg/kg) ；A 样液中咖啡因的峰面积，单位为平方毫米(mm2)；Cs 标准工作液中咖啡因的浓度，单位为毫克每升(mg/L) ；V 样液最终定溶体积，单位为毫升(mL) ；As 标准工作液中咖啡因的峰面积，单位为平方毫米(mm2)；m 样品量，单位为克(g)。,应用,分析（色谱）制备（色谱） 获得高纯度样品（色谱纯）,阿奇霉素已知杂质的相对保留时间表,供试品溶液色谱图中如有杂质峰，除辅料峰与相对保留时间小于0.27的峰外，按相对保留时间对各杂质进行归属，按校正后的峰面积计算（附校正因子表，附图2）。最大单个杂质不得过3.0，其他任一杂质不得过1.0，杂质总量（包括已知杂质和未知杂质）不得过5.0%。,二、气相色谱分析（Gas Chromatography,GC）,气相色谱过程色谱分离条件的选择气相色谱分析方法气相色谱仪及其操作,1、气相色谱过程 待测物被蒸发为气体并注入到色谱分离柱柱顶，以惰性气体（也称载气）将待测物蒸汽带入柱内分离。,载气系统进样系统分离系统检测系统记录系统, 进样系统, 气相色谱检测器 热导池检测器(TCD)：浓度型检测器，即响应值和单位时间内进入检测器的浓度成正比。 氢火焰电离检测器(FID)：质量型检测器，即响应值和单位时间内进入检测器的质量成正比。, 载气及其最佳流速的选择载气的选择(线速度)：N2 1012 cm/s；H2 1520 cm/s，通常换算成柱前体积流速表示。, 柱温 （p142 图7-6） 汽化温度 比汽化室高3070, 进样时间和进样量 液体进样量为0.1L5L，在1s内把试样样进完。,2、色谱分离条件的选择,分离条件的选择是基于对各组分K值的改变，从而达到较好的分离效果。,3、气相色谱分析方法（1）定性分析,依据：利用色谱图确定各色谱峰所代表的化合物。常用的方法： 纯物质对照，利用保留值tR定性； 将已知纯物质在相同的色谱条件下的保留时间与未知物的保留时间进行比较，就可以定性鉴定未知物。 利用加入法定性； 首先作出未知样品的色谱图，然后在未知样品加入某已知物，又得到一个色谱图。峰高增加的组分即可能为这种已知物。 相对保留时间定性； 相对保留值测定方法：在某一固定相及柱温下，分别测出组分i和基准物质s的调整保留值，通常选容易得到纯品的，而且与被分析组分相近的物质作基准物质，如正丁烷、环己烷、正戊烷、苯、对二甲苯、环己醇、环己酮等。,大气中酚的测定,2. 定量分析（自学）,根据检测器对待测物的响应（峰高或峰面积）与待测物的量成正比的原理进行定量。归一化法内标法内标标准曲线法外标准曲线法,外标法（又称标准曲线法）,用欲测组分的纯物质加稀释剂配成不同质量分数的标准溶液，取固定量标准溶液进样分析，从所得色谱图上测出响应信号（峰面积或峰高等），然后绘制响应信号（纵坐标）对质量分数（横坐标）的标准曲线。分析试样时，取和制作标准曲线时同样量的试样（固定量进样），测得该试样的响应信号，由标准曲线即可查出其质量分数。,气相色谱仪的用途,课程引入,演示测定“市售白酒品质”全过程,问题：气相色谱仪的操作过程如何分解？,气路的安装与检漏气体的打开与设置（高压高瓶、减压阀、净化器、稳压阀等的使用）载气流量的测定气相色谱仪开机、关机各温度参数的设置进样操作,气相色谱仪的分析流程展示 。 (动画：气相色谱仪的分析流程),气路系统基本操作1,以GC9790J型气相色谱仪（浙江温岭色谱仪器有限公司生产）为例,气路的安装与检漏训练,检漏操作：用毛笔将皂液涂于各接头处，看是否有气泡溢出。若有，则表示漏气；若无，则表示不漏气。,钢瓶与减压阀的连接。,减压阀与气体管道的连接。,气体管道与净化器的连接。,净化器与气相色谱仪的连接。,气体的打开与设置训练：,逆时针打开载气（N2）钢瓶总阀，顺时针调节减压阀“T形杆”至压力表显示输出压力为0.4MPa。,调节载气柱前压1稳压阀对应圈数为3.0圈，对应载气流量约为30 mL/min。,按逆时针方向打开净化器开关。,气路系统基本操作2,载气流量的测定训练：了解载气流量测定的几种基本方法,认识皂膜流量计：,转子流量计刻度稳压阀电子流量计皂膜流量计,用皂膜流量计测量稳流阀不同圈数下载气的准确流量，并绘制稳流阀圈数载气流量曲线,在橡胶滴头中加入肥皂水,固定流量计,挤捏胶管形成皂膜,皂膜至0刻度开始计时，至设置刻度时停止计时,气路系统基本操作3,U载气流速 cm/sR色谱柱半径,F载气流量 mL/minV流量计容积T皂膜流过流量计时间,载气流量的测定训练：载气流量与流速的换算公式,气路系统基本操作4,气相色谱仪的基本操作1,气相色谱仪开机、关机训练打开或关闭GC9790J型气相色谱仪的电源开关与加热开关：,注意：要求必须打开载气并使其通入色谱柱后才能打开仪器电源开关与加热开关，同理，必须关闭仪器电源开关与加热开关之后才能关载气钢瓶与减压阀。,仪器各温度参数的设置训练设置柱箱温度95；,气相色谱仪的基本操作2,设置检测器温度120；,设置汽化室温度140。,进样操作训练进样操作步骤（动画：取样、进样）用丙酮等溶剂清洗微量注射器15次以上。用待测溶液清洗微量注射器15次以上。气泡的排除。准确吸取待测溶液。进样。,润洗后吸取样品,排除气泡,进样,气相色谱仪的基本操作3,进样技术进样时要求操作稳当、连贯、迅速。进针位置及速度、针尖停留和拔出速度都会影响进样的重现性。一般进样相对误差为25%。,用10L微量注射器在仪器上练习进样操作，清洗溶剂是乙醇，样品是丙酮，进样量0.5L。,气相色谱仪的基本操作4,色谱工作站的操作训练,打开FL9500色谱工作站设置分析方法采样停止采样记录测试数据关闭FL9500色谱工作站,气相色谱仪分析流程1,问题：气相色谱仪的基本组成？学生就仪器回答教师总结气相色谱仪的基本组成及作用（共由六大系统组成）,气路系统。作用是提供连续运行且具有稳定流速与流量的载气与其它辅助气体。主要由钢瓶、减压阀、净化器、稳压阀、稳流阀等部件组成。进样系统。作用是将样品定量引入色谱系统，并使样品有效地气化，然后用载气将样品快速“扫入”色谱柱。主要包括进样器和气化室。分离系统。主要由柱箱和色谱柱组成，其中色谱柱是核心，主要作用是将多组分样品分离为单一组分的样品。,检测系统。其作用是将经色谱柱分离后顺序流出的化学组分的信息转变为便于记录的电信号，然后对被分离物质的组成和含量进行鉴定和测量，是色谱仪的“眼睛”。主要有FID检测器与TCD检测器。数据处理系统。最基本的功能是将检测器输出的模拟信号随时间的变化曲线，即将色谱图绘制出来。目前使用较多的是色谱数据处理机与色谱工作站。温度控制系统。在气相色谱测定中，温度的控制（主要对色谱柱、气化室与检测器三处的温度进行控制）是重要的指标，它直接影响柱的分离效能、检测器的灵敏度和稳定性。,教师总结气相色谱仪的基本组成（续）,气相色谱仪分析流程2,问题：气相色谱仪的分析流程？学生讨论、总结（动画：仪器分析流程）,气相色谱仪分析流程3,N2或H2等载气（用来载送试样而不与待测组分作用的惰性气体）由高压载气钢瓶供给，经减压阀减压后进入净化器，以除去载气中杂质和水分，再由稳压阀和针形阀分别控制载气压力和流量，然后通过气化室进入色谱柱。待载气流量，气化室、色谱柱、检测器温度以及记录仪的基线稳定后，试样可由进样器进入汽化室，则液体试样立即汽化为气体并被载气带入色谱柱。由于色谱柱中的固定相对试样中不同组分的吸附能力或溶解能力是不同的，因此有的组分流出色谱柱的速度较快，有的组分流出色谱柱的速度较慢，从而使试样中各种组分彼此分离而先后流出色谱柱，然后进入检测器。检测器将混合气体中组分的浓度（mg/mL）或质量流量（g/s）转变成可测量的电信号，并经放大器放大后，通过记录仪即可得到其色谱图。,并行学习,问题：你能操作使用其它型号的气相色谱仪（如GC7890F）吗？给学生仪器使用说明书，学生自学说明书，对不理解的问题可提问，教师当场解答。学生独立完成仪器的操作训练学生编写仪器（GC7890F）操作规程（作为课后作业）,作业,基本操作训练不熟练的同学，可利用“实验室开放”的机会重复练习。了解本实验室其它型号的气相色谱仪，如GC900A（上海科创色谱仪器有限公司生产），利用“实验室开放”的机会独立完成基本操作训练。查阅资料，了解目前常州武进地区最常用的气相色谱仪的型号，认识该仪器并编写相关操作规程。,4、气相色谱仪及其操作（p144）启动仪器前先检查气路，电路是否按照要求接好，通入载气，先开钢瓶阀，再开减压器，调节针形阀，控制载气流速度使之符合操作条件。启动、恒温，开启总电源开关，再依次打开柱槽、进样器、热导温控开关，将柱温、汽化室、检测器温度调节旋钮转至要求的位置，加热至一定时间后，用温度测量旋钮分别检查三处温度是否符合要求，若温度已符合要求，再检查载气流速是否正常。,调整基线衰减到要求值，打开热导开关，将桥电流调节旋钮旋到电流要求值，同时打开数据处理系统，击“查看基线”，再击“基线调零”。此时，基线回到“0”位置，仪器稳定后，基线应在“0”位置，若不在，击“基线调零”，选择适当的时间值电压值和分析方法及其他选项，待基线走直后，即可进行分析。进样，用微量进样器注入待测样品。关机，测量完成后，将桥电流调节旋钮转到最小位置，关闭热导电源，柱槽，进样器，热导温控开关，再关掉总电源，待温度下降后，关断载气。,气相色谱分析法的应用实例,永久性气体分析,色谱柱：60 cm ，5A 分子筛柱温：先室温，3 min 后以10程序升温载气：He检测器：热导池,1H2；2O2；3 N2；4 CH4；5 CO；6 CO2；,永久性气体色谱图,农药残留量分析,色谱柱：3mm2m 玻璃柱固定相：0.23%OV172.8%OV210，Chromosorb WAW-DMCS（80100目） 20 :100柱温：200 气化温度：210 检测温度：230载气：N2（99.99%），6070 mL / min检测器：电子捕获检测器,六六六、DDT配样色谱图见下页,农药残留量分析（图）,六六六、DDT配样色谱图,1溶剂；2-六六六 ；3-六六六 ；4-六六六 ；5-六六六 ；,6p,p-DDE；7O,p-DDT；8p,p-DDD； 9p,p-DDT,气相色谱法的特点,高选择性,高灵敏度可以检测出10-11g10-13g物质分析速度快几分到几十分，某些快速1s内可分析数个组分。应用范围广： 适用于沸点低于400的各有机或无机试样分析。如：痕量杂质分析，可测出超纯气体、高纯试剂中的杂质；大气污染物分析；农药残留物的分析；不足之处： 不适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。,HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：流动相的差别和分析对象的差别,1流动相差别2分析对象GC：能气化热稳定性好且沸点较低的样品，占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品, 分子量大、难气化、热稳定性差样品均可检测 ; 用途广泛，占有机物的80%3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压,