发酵工艺控制课件.ppt

第八章 发酵工艺控制,1.温度控制,2.pH控制,4.泡沫控制,5.补料控制,3.溶氧控制,6.发酵终点的判断,发酵过程的主要控制参数 温度：不同的菌种，不同产品，发酵不同阶段所维持的温度亦不同。 pH值： 显示发酵过程中各种生化反应的综合结果。 溶氧浓度（DO值，简称溶氧）：一般用绝对含量(mgL)来表示，有时也用在相同条件下氧在培养液中饱和度的百分数()来表示。 基质含量：定时测定糖(还原糖和总糖)、氮(氨基氮或铵氮)等基质的浓度。, 空气流量：每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积，也叫通风比。一般控制在0.51.0 L(Lmin)。 压力：罐压一般维持在0.020.05 MPa。 搅拌转速：控制搅拌转速以调节溶氧。以每分钟的转数表示。 搅拌功率：常指每立方米发酵液所消耗的功率(kWm3)。 黏度：细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况，通常用表观黏度表示之。, 浊度：澄清培养液中低浓度非丝状菌的OD值与细胞浓度成线性关系。一般采用分光光度计的波长420660 nm测量，要求吸光率0.30.5。波长600700 nm间，一个吸光率单位大约相当于1.5 g细胞干重L。浊度对氨基酸、核苷酸等产品的生产是极其重要的。(11) 料液流量(12) 产物的浓度：(13) 氧化还原电位：限氧条件发酵用氧化还原电位参数控制则较理想。 (14) 废气中的氧含量：从废气中的氧和CO2的含量可以算出产生菌的摄氧率、呼吸熵和发酵罐的供氧能力。,(15) 废气中的CO2含量：揭示产生菌的呼吸代谢规律。(16) 菌丝形态：衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期长短的依据之一。(17) 菌体浓度：是控制微生物发酵的重要参数之一，特别是对抗生素次级代谢产物的发酵。常根据菌浓来决定适合的补料量和供氧量。 由以上参数计算得出的菌体生长比速、氧比消耗速率、糖比消耗速率、氮比消耗速率和产物比生成速率也是控制产生菌的代谢、决定补料和供氧工艺条件的主要依据，多用于发酵动力学的研究。,第一节 温度控制,发酵过程中，伴随着细胞的生长代谢、机械搅拌会产生一定的热量，而由于发酵罐壁散热和水分蒸发，又会带走部分热量，因此，发酵罐的温度是不断变化的，必须加以控制，才能满足微生物生长代谢的需要，从而达到高效生产的目的。,一.发酵热及其测定,二.温度对微生物生长的影响,三.温度对发酵的影响,四.最适温度的控制,一.发酵热及其测定,微生物在发酵过程中，由于生物氧化作用和机械搅拌作用等产生的热量，称为发酵热。,1.发酵热,发酵罐温的变化主要受以下几个因素的影响。,生物热,搅拌热,蒸发热,辐射热,Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射,则:,产热散热 净热量堆积 发酵液的温度上升；,相反，产热小于耗热，温度下降。,（1）生物热（Q生物）,在微生物生长代谢过程中，由于生物氧化作用而释放出的热量称为生物热。,营养物氧化分解释放出的能量，部分用于合成高能化合物，并被消耗在各种代谢途径中，如合成新细胞组分，膜运输，鞭毛运动，合成代谢产物等，其余部分则以热的形式散发出来。,微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。,产热的情况：,具有时间性。 发酵初期 对数生长期 发酵后期,如四环素发酵的发酵热最大是在2050h,最高可达29330KJ/(m3.h)，其它时段最低约为8380,生物特异性。,如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，,与营养有关。 培养基成分愈丰富，营养被利用速度愈快，产生的生物热就愈多。,（2）搅拌热（Q搅拌）,机械搅拌通气发酵罐，发酵液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：,Q搅拌=P3601 （kJ/h）,式中:,P为搅拌功率，（kW）,3601是机械能转变为热能的热功当量，kJ/(kWh),（3）蒸发热（Q蒸发）,通气时，引起发酵液水分的蒸发，被空气和蒸发水分带走的热量叫做蒸发热或汽化热。,蒸发热可按下式计算：,Q蒸发=qm(H出-H进),式中:,qm为干空气的重量流量，（kg空气/h）,H出、H进为发酵罐排气和进气的热焓，（kJ/kg干空气）,散热的情况：,（4）辐射热（Q辐射）,通过罐体表面向环境中发射红外线而散失的热量。热量的大小决定于罐内外温度差大小、罐的表面积等。,辐射热的大小，取决于罐内外温差的大小。 冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5。,在发酵过程中，Q生物和Q蒸发随时间而变化，因此，发酵热在整个发酵过程中，也随着时间而变化。为了使发酵维持在适当的温度下进行，必须采取一定的保温措施：在夹套或蛇形管内通入冷热水来控制发酵罐的温度。,2.发酵热的测定,三种测算方法：,（1）利用热交换原理：通过测量一定时间内冷却水的流量和冷却水进出口的温度，用下式计算：,如果需要求生物热时：,Q发酵=qvC(t2-t1)/V,qv为冷却水的流量，（L/h）,C为水的比热，kJ/（kg ）,t1、t2为进、出的冷却水温度，（ ）,V为发酵罐体积，（m3）,式中:,Q生物= Q发酵- Q搅拌+ Q蒸发+ Q辐射,（2）利用温度变化率S（/h）：通过罐温的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自控装置，测量温度随时间上升的速率，按下式求出发酵热：,经实测，抗生素发酵的最大发酵热均为300050000 kJ(m3 h)；谷氨酸发酵的最大发酵热约为70008000 kJ(m3 h)。,Q发酵=（m1c1+m2c2）u,式中:,m1、 m2为发酵液、罐的质量，（kg）,c1为发酵液的比热， kJ/（kg ）,C2为发酵罐材料的比热， kJ/（kg ）,u为温度上升速率，（ h）,（3）热力学方法：根据盖斯定律：“在恒压和恒容条件下，一个反应不论是一步完成或几步完成，其反应热是相同的”。这实际上是热力学第一定律的必然推论，因为焓（H）是状态函数，过程的焓变与途径无关，只决定于过程的始态和终态。发酵热可根据标准燃烧热或标准生成热来计算。,H=(H)反应物-(H)产物,二.温度对微生物生长的影响,最低、最适和最高生长温度。,温度影响微生物生长的机理 (1)影响酶活性。 (2)影响细胞膜的流动性。 (3)影响物质的溶解度。,从最低生长温度到最适生长温度，通常温度每升高10 ，生长速度就加快一倍。,(1)影响产物生成速度(2)影响发酵液的物理性质(3)影响产物合成的方向a.改变体内酶系中间产物种类产物种类;b.使代谢比例失调；(4)影响产物特性,三.温度对发酵的影响,影响合成方向：用米曲霉制曲时，如温度在低限时，得到蛋白酶，此时-淀粉酶的合成受到抑制。金色链霉菌在低于30C时合成链霉素，温度到达35C时，只产四环素影响产物生成量：黑曲霉生长最适温度33-37C，积累柠檬酸的最适温度在32C影响产物质量：凝结芽孢杆菌合成-淀粉酶时，发酵温度控制在55时，合成的-淀粉酶较耐高温，在90、60min条件下，其活性丧失仅10左右，而发酵温度控制在35时，合成的-淀粉酶在相同条件下丧失90。,青霉素产生菌的生长温度为30，产青霉素最适温度为25；,乳酸链球菌最适生长温度34，而发酵产乳酸最适不超过30,谷氨酸产生菌的生长最适温度3032，产生谷氨酸的温度一般比生长温度高，约为3437。,同一种生产菌，菌体生长和积累代谢产物的最适温度也往往不同。,多数发酵情况是：接种后的发酵液温度会下降，应适当提高培养温度以利于孢子萌发或加速菌体生长；,当发酵液温度上升后，应控制在菌体的最适生长温度；,到主发酵旺盛阶段，温度应控制在代谢产物合成的最适温度；,到发酵后期，温度出现下降趋势，直至发酵成熟即可放罐。,四.最适温度的控制,在整个发酵过程中不能只选一个最适培养温度，最适于菌体生长的温度不一定最适于发酵产物的生成 看生长和生物合成哪一个是主要方面。, 前期:菌量少，取稍高的温度，使菌生长迅速； 中期:菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。 后期:产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。,温度的选择还要参考其他发酵条件。,通气条件较差可适当降低温度。这是由于在较低的温度下，氧溶解度相应较大，而菌体的生长速率相应较小，从而弥补了因通气不足而造成代谢异常。,培养基稀薄时,适应采用较低温度，培养温度高则养料往往过早耗竭，菌丝过早自溶。 例如，提高红霉素发酵温度在玉米浆培养基中的效果就不如在黄豆粉培养基中好，因后者相对难利用，这时提高温度则有利于菌的同化。, 各个发酵阶段的最适温度的选择应从各方面综合考虑。,又：青霉素发酵：最初5h维持在30，635h为25，3685h为20，最后40h再升到25。采用这种变温培养比25恒温培养所得青霉素产量高14.7。,eg: 在四环素发酵中，采用变温控制，中后期保持较的温度，以延长抗生素分泌期，放罐前24h提高23。能使最后24h的发酵单位提高50%以上。,如何选择最适发酵温度？,1、根据菌种及生长阶段选择。微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。,2、根据培养条件选择。温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。3、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。,第二节 PH值控制,一. PH值对菌体生长和代谢产物形成的影响,二. 影响PH值变化的因素,三.发酵过程PH值的调节及控制,不仅影响微生物的生长，而且也影响着代谢产物的形成。,主要影响：,（1）导致微生物细胞原生质膜的电荷发生改变。,（ 3）影响培养基某些重要的营养物质和中间代谢产物的解离，进而影响该物质的利用。,（2）影响酶的活性。,一. PH值对菌体生长和代谢产物形成的影响,此外： pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。 影响氧的溶解和氧化还原电势的高低； pH值影响孢子发芽；,举例：影响菌体的生长：产黄曲霉的细胞壁的厚度就随pH值的增加而减小：其菌丝直径在pH6.0时为23 m；pH7.4时为218 m，并呈膨胀酵母状；pH值下降后菌丝形态又会恢复正常。影响产物合成：合成青霉素的最适pH值范围为6.56.8。,影响产物稳定性：-内酰胺抗生素沙纳霉素的发酵中，pH在6.77.5之间时抗生素的产量相近，高于或低于这个范围，合成受到抑制。在这个pH值范围内，沙纳霉素的稳定性未受到严重影响；但pH7.5时，稳定性下降，半衰期缩短，发酵单位也下降。青霉素在碱性条件下发酵单位低，也与青霉素的稳定性有关。,不同种类的微生物，对pH要求不同；,酵 母：pH 3.86.0,细 菌：pH 6.57.5,霉 菌：pH 4.05.8,放线菌：pH 6.58.0,同种微生物对pH变化的反映不同。如，石油代蜡酵母,H 3.55.0 生长良好，不易染菌；,H 5.0时，易染细菌；,H 3.0时，生长受抑制，大小不均，易自溶；,H不同，微生物代谢产物不同。,黑曲霉,H：23，柠檬酸 发酵,H：7.0，草酸发酵,谷氨酸菌,H：78，GA发酵,H：5.05.8，谷氨酰胺发酵,酿酒酵母,H：4.5-5.03，乙醇 发酵,H：8.0，甘油发酵,H在微生物培养的不同阶段有不同的影响,生长,合成,H对菌体生长影响比产物合成影响小例 青霉素：菌体生长最适pH3.56.0,产物合成最适pH7.27.4 四环素：菌体生长最适pH6.06.8，产物合成最适pH5.86.0,X,pH,丙酮丁醇菌,生长：pH 5.57.0;,发酵：pH 4.3-5.3;,链霉素菌,生长： pH 6.3-6.9,发酵： pH 6.7-7.3,青霉素菌,生长：pH 6.5-7.2,发酵：pH 6.2-6.8,微生物生长和发酵的最适pH值往往是不同的,二.影响pH值变化的因素,在发酵过程中，发酵液的pH值是不断变化的。pH值的变化取决于以下几个因素：,微生物的种类,培养基的组成,发酵条件,1.微生物的种类,eg:花生饼粉为培养基进行土霉素发酵，最初将pH分别调为5、6、7，发酵24h后，这三种培养基都在6.57.0之间。,培养开始时发酵液pH对微生物生长的影响是不大的，因为微生物在代谢过程中具有一定的调整周围环境pH值，构建最适pH值的能力。,影响pH值变化的因素,又eg: 以产生利福霉素SV的地中海诺卡菌进行发酵研究，采用pH值为6.0、6.8、7.5三个出发值，结果发现：pH值在6.8、7.5时，最终发酵pH值都达到7.5左右，菌丝生长和发酵单位都达到正常水平；pH值为6.0时，发酵中期pH值只达4.5，菌浓仅为20，发酵单位为零。 这说明菌体仅有一定的自调能力。,凡导致酸性物质的生成或碱性物质消耗的代谢过程pH下降 碱性或酸性pH升高,2.培养基的组成,NaNO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH,如氨基酸的氧化：,如硝酸钠的还原：,影响pH值变化的因素,如：生理酸性盐 (NH4)2SO4 生理碱性盐NaNO3,培养基的C/N比对pH也有较大的影响，C/N比高，发酵液偏向酸性，反之，则偏于碱性。,生理碱性物质：有机氮源、硝酸盐、有机酸等生理酸性物质：糖类不完全氧化产生有机酸、脂肪不完全氧化脂肪酸；铵盐氧化后产生硫酸,1）基质代谢,（1）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一（2）氮代谢 当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降,如灰黄霉素发酵的pH值变化，就与所用碳源种类有密切关系，如以乳糖为碳源，乳糖被缓慢利用，丙酮酸堆积很少，pH值维持在67之间；如以葡萄糖为碳源，丙酮酸迅速积累，使pH值下降到3.6，发酵单位很低。,2）产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。,3）菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。,3.发酵的工艺条件,通风充分，搅拌强度高，通气量大，营养物氧化彻底，产酸少，pH值高，反之，pH值降低。,是否调节pH和调节pH值的方法关系着发酵的质量。如果不调节pH，通常发酵液的pH变化较大；采用流加法调节pH，则发酵液的pH波动较小。,总之，发酵液的pH值变化是各种反应的综合性结果。,影响pH值变化的因素,在发酵过程中，由于微生物不断地吸收，同化营养物质、排出代谢产物，发酵液的pH值是不断变化的。 这与培养基的组成、微生物的生理特性、发酵工艺条件有关（见二）。,三.发酵过程PH值的调节及控制,1） 发酵pH值的确定（范围，时间）一般是在58之间，如谷氨酸发酵的最适pH值为7.58.0。随菌种和产品不同而不同。同一菌种，生长最适pH值可能与产物合成的最适pH值是不一样的。按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH，使产量最大。,例 pH对林可霉素发酵的影响,林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不及时补糖、(NH4)2SO4或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上至115小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。 发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3，调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵单位。,pH,7.0,t,不调pH,调pH,效价,pH,黑曲霉pH23时合成柠檬酸，pH值接近中性时积累草酸。谷氨酸生产菌在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下形成谷氨酰胺。谷氨酸发酵在不同阶段对pH值的要求不同，发酵前期控制pH7.5左右，发酵中期pH7.2左右，发酵后期pH7.0，在将近放罐时，pH6.56.8为好。梭状芽孢杆菌丙酮丁醇发酵，pH值在中性时，菌种生长良好，但产物产量很低，实际发酵最适pH值为56。链霉素产生菌生长最适pH值为6.27.0，合成最适pH值为6.87.3。,最适pH值的确定：根据实验结果 不同的pH值出发进行发酵，发酵过程中定时测定和调节pH值以维持出发pH值，或者利用缓冲液配制培养基来维持。定时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的pH值为生长最适pH。 同样的方法可测得产物合成的最适pH值。但同一产物的最适pH值，还与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。 确定发酵最适pH值时，要考虑温度的影响。,最佳pH的确定,配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况,H对产海藻酸裂解酶的影响,H对海藻糖水解酶产生的影响,H菌浓 pH酶活,H对谷氨酰胺转氨酶活力的影响,具体情况选用：,调节通气量来控制pH值,调节培养基的原始pH值,加入缓冲剂（如磷酸盐缓冲液）或使盐类和碳源的配比平衡,发酵时，流加弱酸或弱碱,合理地控制发酵条件,补料,1.控制pH值的方法, 常用方法, 调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.5-6.8 在基础料中加入维持pH的物质，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等 通过补料调节pH,控制pH的方法,在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH，如：（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH (2)当NH2-N低，pH低时补氨水；当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4 当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH,应急措施：改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度，控制有机酸的积累量及其代谢速度；改变温度，以控制微生物代谢速度；改变罐压及通气量，降低CO2的溶解量；改变加油或加糖量等，调节有机酸的积累量；,不同pH控制方式对目的突变株ISw330异亮氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。 “1”表示只加CaC03控制pH值，“2”表示只加尿素控制，“3”表示CaC03和尿素联合控制pH值。,异亮氨酸发酵,2.上述方法调节pH值达不到要求时,可用以下方法调节pH,（1）添加碳酸钙法,（2）氨水流加法,当用NH4+盐作为氮源时，可在培养基中加入CaCO3，用于中和NH4+被吸收后剩余的酸。,氨水可以中和发酵中产生的酸，且NH4+可作为氮源，供给菌体营养.通氨一般是使压缩氨气或工业用氨水(浓度20左右)，采用少量间歇添加或连续自动流加，可避免一次加入过多造成局部偏碱。氨极易和铜反应产生毒性物质，对发酵产生影响，故需避免使用铜制的通氨设备。,（3）尿素流加法,味精厂多用，尿素首先被菌体尿酶分解成氨，氨进入发酵液，使pH上升，当NH4+被菌体作为氮源消耗并形成有机酸时，发酵液pH下降，这时随着尿素的流加，氨进入发酵液，又使发酵液pH上升及补充氮源，如此循环，致至发酵液中碳源耗尽，完成发酵。 氨基酸发酵常用此法。这种方法既可以达到稳定pH值的目的，又可以不断补充营养物质，特别是能产生阻遏作用的物质。少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。也就是说，采用补料的方法，可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH值和培养液的特性(如菌浓等)等几个目的。,第三节 溶氧控制,一.供氧与微生物呼吸及产物形成的关系,二. 微生物的临界氧浓度,三.发酵过程中溶解氧的变化,四.溶氧控制,一.供氧与微生物呼吸及代谢产物的关系,发酵液中溶解氧的多少，以溶解氧系数Kd表示。,微生物的吸氧量常用呼吸强度和耗氧速率两种方法表示。呼吸强度是指单位重量干菌体在单位时间内所吸取的氧量，以 QO2表示，单位为mmolO2g干菌体 h。耗氧速率是指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，以表示，单位为mmolO2/Lh。,呼吸强度可以表示微生物的相对需氧量，但是，当培养液中有固定成份存在，对测定有困难，这时可用耗氧速率来表示。微生物在发酵过程中的耗氧速率取决于微生物的呼吸强度和单位体积液体的菌体浓度：,为微生物的耗氧速率，mmolO2(Lh),x为发酵液中菌体浓度，gL,QO2为菌体呼吸强度，mmolO2(gh),=QO2x,式中:,eg: 谷氨酸发酵中，谷氨酸产生菌为兼性好氧菌，供氧量过大或过小对菌体生长和谷氨酸积累都有很大影响。,不同发酵阶段菌体对氧的要求不同，一般生长繁殖期比谷氨酸生成期对溶氧要求低，生长阶段供氧为菌体需氧量的“亚适量”，要求溶氧系数Kd为4.05.910-6molO2(mlminMpa)，而形成谷氨酸阶段要求Kd为1.51.810-5molO2(mlminMpa)。,菌体生长阶段：若供氧过量，在生物素限量的情况下，抑制菌体生长，表现为耗糖慢，pH值偏高，且不易下降。,发酵产酸阶段： 若供氧不足，发酵的主产物由谷氨酸转为乳酸：在缺氧条件下，丙酮酸以后的氧化反应停滞，丙酮酸转化为乳酸；生产上表现为耗糖快，pH值低，尿素消耗快，长菌而不产谷氨酸。 如供氧过量，则不利于-酮戊二酸进一步还原氨基化而积累-酮戊二酸。,二. 微生物的临界氧浓度,微生物的耗氧速率受发酵液中氧浓度的影响，各种微生物对发酵液中溶氧浓度有一个最低要求，这一溶氧浓度叫做“临界氧浓度”。以c临界表示。,不同微生物的需氧量不同，一般25100mmolO2(Lh) 。 同一种微生物，随菌龄和培养条件不同需氧量不同。一般幼龄菌生长旺盛，其呼吸强度大，但是种子培养阶段由于菌体浓度低，总的耗氧量也较低；老龄菌的呼吸强度弱，但是，在发酵阶段，由于菌体浓度高，耗氧量大；,一些微生物的耗氧速度：,青霉素产生菌培养80h的耗氧速度为40mmolO2(Lh) ；,链霉素产生菌培养12 h的耗氧速度为45mmolO2(Lh) ；,黑曲霉生长的最大耗氧速度为5055mmolO2(Lh) ，而产-淀粉酶时的最大耗氧速度为20mmolO2(Lh) ；,溶氧控制的意义,在发酵过程中，微生物通常只能利用溶解态的氧。 发酵工业中，随着高产菌株的筛选，高浓度发酵，丰富培养基的采用，（相对而言氧的溶解度更低）因而对通气和搅拌的要求更高。,氧气供应不足将使菌种生长差或导致细胞代谢转向副产物的合成。由于菌体的新陈代谢与氧气呼吸有关，调节通风和搅拌，可影响发酵周期时间的长短和代谢产物生成的高低。,发酵液中氧的浓度维持在氧的临界浓度以上。,目前，在发酵工业上氧的利用率是很低的。如在抗生素发酵方面，被微生物利用的氧不超过空气中含氧量的2，在谷氨酸发酵方面氧的利用率为1030。,三.发酵过程中溶解氧的变化,发酵前期：溶解氧浓度明显下降,出现一个低峰。 原因：菌体大量繁殖,菌体浓度不断上升出现一个高峰.黏度一般在此时期也会出现一个高峰.,发酵中后期：对分批发酵而言,溶氧变化小。 原因：因菌体繁殖进入稳定期,呼吸强度不大 如不补料,供氧能力保持不变.如补料则引起溶氧量下降,经过一段时间后又逐步回升.,发酵后期：溶氧逐步上升。 原因：菌体衰老,呼吸强度弱,一旦菌体自溶,溶氧量更会明显上升.,所以,从发酵液中溶氧浓度的变化,可以了解微生物生长代谢是否正常.工艺控制是否合理.查出发酵不正常原因,溶氧对发酵的影响与监控举例：（CL发酵液中溶解氧）,P159 图9-2,四. 溶氧控制,eg:补水,第四节 泡沫控制,一.泡沫的性质,二.发酵过程泡沫的变化,三.化学消泡,四.机械消泡,一.泡沫的性质,通气搅拌发酵液中含有蛋白质等发泡性物质,泡沫对发酵的危害,1）降低生产能力,在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量,2）引起原料浪费,如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。,3） 影响菌的呼吸,如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满二氧化碳，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸。导致终产物产量下降或菌体的提早自溶，任其发展会促使更多的泡沫生成。,4） 引起染菌,由于泡沫增多而引起逃液，于是在排气管中粘上培养基，就会长菌。随着时间延长，杂菌会长入发酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封，轴封处的润滑油可起点消泡作用，从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染。,实质：气溶胶构成的胶体系统，其分散相是空气和代谢气，连续相是发酵液，泡沫间隔着一层液膜而被彼此分开不相连通。,发酵过程中泡沫有两种类型：一种是发酵液液面上的泡沫，气相所占的比例特别大，与液体有较明显的界限，如发酵前期的泡沫；另一种是发酵液中的泡沫，又称流态泡沫(fluid foam)，分散在发酵液中，比较稳定，与液体之间无明显的界限。,二、发酵过程泡沫产生的原因与变化,（1）通气搅拌的强烈程度,泡沫随通气量和搅拌速度的增加而增加，并且搅拌所引起的泡沫比通气来得大。采用较小通气量及搅拌转速，再逐步加大。也可在基础料中加入消泡剂。,（2）培养基配比与原料性质、组成,前期培养基营养丰富,粘度大，产泡沫多而持久。例：如培养基适当稀一些，接种量大一些，生长速度快些，前期就容易搅拌开。,原材料的性质有关：蛋白质原料如蛋白胨、玉米浆、酵母粉、黄豆饼粉、花生饼粉、糖蜜等是主要发泡物质,玉米浆花生饼粉黄豆饼粉,发酵过程中污染杂菌使发酵液粘度增加，也会产生大量泡沫。,糖类物质本身起泡能力很差，但在丰富培养基中较高浓度糖类物质增加培养基的黏度，而有利于泡沫的稳定,（3）菌种、种子质量和接种量,菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量。,（4）灭菌质量,培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。,泡沫的控制，可以采用三种途径： 调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原材料)或改变某些物理化学参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制，以减少泡沫形成的机会。但这些方法的效果有一定的限度。, 泡沫的控制, 采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫：通过化学方法，降低泡沫液膜的表面张力，使泡沫破灭；利用物理方法，使泡沫液膜的局部受力，打破液膜原来受力平衡而破裂。, 采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素如：杂交选育不产流态泡沫的土霉素生产菌株 对于已形成的泡沫，工业上可以采用机械消泡和化学消泡剂消泡或两者同时使用消泡。,是目前应用最广的一种消泡方法。,三.化学消泡,来源广泛,消泡效果好,作用迅速可靠,用量少,不需改造现有设备,优点,容易实现自动控制,常用的一些消泡剂：天然油脂：高碳醇、脂肪酸和酯类：十八醇是常用的一种，它可以单独或与载体一起使用。 聚醚类；硅酮类(聚硅油类)；主要是聚二甲基硅氧烷及衍生物，无色液体，不溶于水，表面张力低达21dyn/cm（泡敌为33，向日葵油40，青霉素发酵液60-68 dyn/cm）。纯聚二甲基硅氧烷的消泡能力低，常加分散剂来提高消泡活性，或乳化剂成乳状液。适用于微碱性发酵，对于微酸性发酵较差。,（1）天然油脂,最早消泡剂，来源容易，价格低，使用简单，一般来说没有明显副作用，如豆油、菜油、鱼油等。有些油是发酵产物的前体，如豆油是红霉素的前体，鱼油是螺旋霉素的前体。分子中无亲水基团，在发酵液中难铺展，所以消泡活性差，用量大，一般为发酵液的0.1-0.2%近年来出于对环境保护的重视，天然产物消泡剂的地位又有些提高，而且还在研究新的天然消泡剂,（2）聚醚类消泡剂,我国常用甘油三羟基聚醚。六十年代发明此类消泡剂，美国道康宁化学公司首先投产。它是以甘油为起始剂，由环氧丙烷，或环氧乙烷与环氧丙烷的混合物进行加成聚合而制成的。只在甘油分子上加成聚合环氧丙烷的产物叫聚氧丙烯甘油定名为GP型消泡剂；在GP型消泡剂的聚丙二醇链节末端再加成环氧乙烷，成为链端是亲水基的聚氧乙烯氧丙烯甘油，也叫GPE型消泡剂（泡敌）。按照环氧乙烷加成量为10%，20%，50%分别称为GPE10，GPE20，GPE50。, 其他的消泡剂，如：聚乙二醇等高碳醇消泡剂多适用于霉菌发酵，硅酮类较适用于微碱性的细菌发酵。所以，应结合具体产品发酵，试验上述各种消泡剂的消泡效果，以获得良好的消泡作用。 值得注意的是：消泡剂有选择性。消泡剂用多了有毒性，而且还影响通气和气体分散，因此要少量地加。,消泡剂的使用有以下几种形式（增效作用）： 消泡剂 + 载体：惰性载体(如矿物油、植物油等) 复合消泡剂：如GP和GPE以l:1混合使用于土霉素发酵，结果比单独使用GP的效力提高2倍； 消泡剂 + 乳化剂：适用于亲水性差的消泡剂。如用吐温80制成的乳剂，用于庆大霉素发酵，效力提高12倍。,使用要考虑的因素：(1)种类的选择： 不影响发酵和提取，能力持久。(2)用量的选择：0.003-0.025%(3)方法的选择： 应用之前作比较性试验，找出消沫剂对微生物生理特征影响最小、消沫效率最大的条件；成本。,四.机械消泡,物理作用，靠机械强烈振动，压力的变化，促使气泡破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。,化学消泡最显著的缺点是影响氧气的溶解，使其减少1/31/5，这对微生物供氧极为不利；机械消泡能克服这一缺点，但其应用效果不如化学消泡迅速可靠，不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素。 消泡装置设计依据：动力小；结构简单；易清洁；运行可靠；维护费用低；,机械消泡的特点：,优点,不需外加其他物质,节省原料（消泡剂）,减少因加入消泡剂而引起的污染,对提取工艺无任何副作用,缺点,不如化学消泡迅速可靠,需要一定的设备,需消耗一定的动力,不能彻底消除引起稳定泡沫的因素,方法,罐外,旋转叶片式,喷雾式,离心式,转向板式,罐内,耙式,旋转圆盘式,流体吹入式,冲击反射板式,碟片式,超声波,吸引消泡,机械消泡器,离心力消泡,补料分批发酵(fed-batch culture，FBC)： 又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法，是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式，是一种控制发酵的好方法，现已广泛用于发酵工业。,第五节 补料控制,二.补料的内容,三.补料的原则,四.补糖的控制,五.补氮和无机盐,一.FBC的作用,1） 可以控制抑制性底物的浓度高浓度营养物抑制微生物生长： 基质过浓使渗透压过高，细胞因脱水而死亡； 高浓度基质能使微生物细胞热致死(themal death)，如乙醇浓度达10时，就可使酵母细胞热致死； 有的是因某种或某些基质对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用，如高浓度苯酚(35)可凝固蛋白； 高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等。,一.FBC的作用,有的基质是合成产物必需的前体物质，浓度过高，就会影响菌体代谢或产生毒性，使产物产量降低。如苯乙酸、丙醇(或丙酸)分别是青霉素、红霉素的前体物质，浓度过大，就会产生毒性，使抗生素产量减少。采用FBC方式，可以控制适当的基质浓度，使菌处于“半饥饿”状态。,2） 解除或减弱分解代谢物的阻遏 有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏，如葡萄糖阻抑纤维素酶、赤霉素、青霉素等多种酶或产物的合成。通过补料来限制基质葡萄糖的浓度，就可解除酶或其产物的阻遏，提高产物产量。 缓慢流加葡萄糖，纤维素酶的产量几乎增加200倍；将葡萄糖浓度控制在0.02水平，赤霉素浓度可达905 mgL；采用滴加葡萄糖的技术，可明显提高青霉素的发酵单位等。这都是利用发酵技术解决分解代谢物阻遏的实际应用。在植物细胞培养中，也采用该技术来提高产量。,葡萄糖效应,3）可以使发酵过程最佳化分批发酵动力学的研究，阐明了各个参数之间的相互关系。利用FBC技术，就可以使菌种保持在最大生产力的状态。随着FBC补料方式的不断改进，为发酵过程的优化和反馈控制奠定了基础。随着计算机、传感器等的发展和应用，已有可能用离线方式计算或用模拟复杂的数学模型在线方式实现最优化控制。,二.补料的内容,能源和碳源；氮源；微量元素或无机盐；诱导物；对于产诱导酶的微生物，是提高酶产量的重要措施。,原则：控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。 根据菌体生长代谢规律； 生产需要； 环境条件方法：充足而不过量（少量多次或分批流加）,三.补料的原则,补糖时机过早，刺激生长，加速糖利用；过迟，所需能量跟不上。如谷氨酸发酵在对数生长期的末期补料。判断：培养基条件，菌种，发酵状况（残糖，pH，菌形态等），在需要时加入；,四.补糖的控制,补糖方式连续流加：每次流加又可分为快速流加、恒速流加、指数速率流加和变速流加。少量多次间歇补入大量少次补入 可与其他组分一起进行多组分补料。 以不引起发酵液成分剧烈波动为前提；,补糖量加入与消耗平衡，维持稳定的糖浓度；例：a 四环素发酵还原糖维持在0.8-1.5%b 谷氨酸追加糖液发酵：在原工艺基础上，加大接种量到10%，增加生物素用量达5g/L，减少初糖浓度（12%7-8%）尽快获得大量的生产型菌体，当菌体处在生长对数期后进入产酸期，糖浓度在2%左右时，连续流加糖液，维持2%左右的糖浓度。 优点：低浓度发酵，以利于生长和发酵； 总糖浓度达20%，产酸高。,补糖开始时，不但CRR（CO2的释放率） 、OUR（氧摄取速率 ）大幅度提高，连RQ（呼吸熵） 也提高约10，表明通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。,五.补氮和无机盐, 通氨是某些发酵生产补料工艺的有效措施，主要起补充无机氮源和调节pH值的作用。但应注意通氨时避免局部过量和泡沫情况。, 也可以根据发酵代谢的具体情况，中间添加某些具有调节生长代谢作用的物料，如磷酸盐、尿素、硝酸盐、Na2SO4、酵母粉或玉米浆等。如遇生长迟慢、耗糖低，一般可补充适量的磷酸盐，以促进糖的作用。, 流加尿素，一方面调节pH，另一方面补氮。 谷氨酸发酵时，初次加入尿素量和补加量取决于菌种的脲酶活力强弱和耐尿能力。脲酶活力低，耐尿素强，初次加入用量多2%，流加次数少脲酶活力强，耐尿素低，初次加入用量少0.6%，流加以少量多次好,补料应注意的问题：,（1）料液配比要适合：过浓会影响到消毒及料液的输送，过稀则料液体积增大，引起一系列问题，如发酵单位稀释、液面上升、加油量增加等；,（2）加强无菌控制：由于经常性添加物料易染菌,（3）经济核算：节约粮食，并注意培养基的碳氮平衡等。,第六节 发酵终点的判断,一.发酵终点的判断,二.自溶的监测,三.影响自溶的因素,生产能力（或称生产率、产率）是指单位时间内单位罐体积发酵液的产物积累量而言。生产率单位一般为g(Lh)或kg(m3h)，产物浓度单位为gL或kgm3，发酵时间单位为h。,高生产率 + 成本控制到了衰亡期，菌体的产物分泌能力都要下降，产物的生产率相应下降或停止。有的产生菌在衰亡期，营养耗尽，菌体衰老而进入自溶，释放出体内的分解酶会破坏已形成的产物。,发酵终点的判断原则根据发酵类型和生产目标判断发酵终点。对发酵及原材料成本占整个生产成本主要部分的发酵品种，主要追求提高生产率(kg/m3h)，得率(kg产物/kg基质)和发酵系数(kg产物/罐容积m3发酵周期h)下游提取精制成本占主要部分和产品价格比较贵，除了要求高的产率和发酵系数外，还要求高的产物浓度。,一.发酵终点的判断,1、产品质量因素,如果发酵时间太短：过多剩余营养物（如各种蛋白、脂肪等）残留在发酵液，分