《分析样品制备技术》教学ppt课件—3.5 色谱分离法.ppt

,色谱分离法简介,色谱分离法简介,1、色谱分离技术的概念2、色谱分离系统的组成3、色谱分离技术的分类4、色谱法的特点,1、色谱分离技术的概念,色谱（chromatography）分离技术是一类分离方法的总称，又称色谱法、层析法、层离法等。它是利用不同组分在固定相和流动相中的物理化学性质的差别，使各组分在两相中以不同的速率移动而进一步分离的技术。,色谱分离法简介,固定相:在色谱法中，表面积较大的固体或附着在固体上且不运动的液体，静止不动的一相称为固定相；流动相:自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相 。,2、色谱分离系统的组成,色谱分离法简介,根据分离时一次进样量的多少，色谱分离的规模可分为:色谱分析规模(小于10mg)、半制备(1050mg)、制备规模(0.110g)和工业生产规模(10g)。色谱分离的规模小，但产值高。,3、色谱分离技术的分类,色谱分离法简介,3、色谱法的分类,超临界流体色谱流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体,根据流动相的相态不同:,气相色谱以气体作流动相,液相色谱以液体作流动相,色谱分离法简介,固定相涂敷在玻璃或金属板上薄层色谱,3、色谱法的分类,根据固定相的附着方式分类,液体固定相涂在纸上纸色谱(平板色谱),固定相装在圆柱管中柱色谱,色谱分离法简介,色谱法的缺点是处理量小、操作周期长、不能连续操作。,4、色谱法的特点,(1) 分离效果高,(2) 应用范围广,(3) 选择性强,(4) 设备简单,色谱分离法简介,1、色谱分离技术的概念2、色谱分离系统的组成3、色谱分离技术的分类4、色谱法的特点,总结,纸色谱法,1、概念 纸色谱法又称纸层析法，是一种以滤纸为载体的色谱分离方法。,纸色谱法,12,对滤纸的一般要求是：（1）质地和厚薄必须均匀，边缘整齐，平整无折痕，无污渍。（2）纸纤维疏松度适当。过于疏松易使斑点扩散，过于紧密则流速慢。（3）有一定的强度，不易断裂。（4）纯度高，不含填充剂，灰分在0.01%以下。否则金属离子杂质会与某些组分结合，影响分离效果。,1、概念 纸色谱法又称纸层析法，是一种以滤纸为载体的色谱分离方法。,纸色谱法,(1)划线：先将滤纸放在被有机溶剂的蒸气所饱和的容器内，确定起始线及原点，用铅笔在离滤纸一端23cm处画一直线。(2)点样：用一支吸取试样的毛细管点在滤纸的原点上，再将滤纸一端浸入有机溶剂中。（3）展开：点样斑点直径为0.20.5cm，干燥后再展开。（4）测量：,2、纸色谱法的操作过程,纸色谱法,纸色谱法,常用比移值Rf来表示某组分在滤纸上的移动情况，其表达式为：,比移值最大等于1，此时组比移值最大等于1，此时组分随展开剂一起上升到滤纸前沿；比移值比移值最小等于0，此，此时组分始终留在原点，组分不随展开剂上升而停留在原点。,纸色谱法,3、纸色谱法的基本原理,1、滤纸中的纤维素通常吸收20。25的水分，其中约6的水分子通过氢键与纤维素上的经基结合，在分离过程中不随有机溶剂流动，形成纸色谱中的固定相；2、有机溶剂为流动相，又称展开剂。3、待分离组分在固定相和流动相分配或吸附的差异来进行分离。,纸色谱组分,固定相：不流动吸附的水或其他溶剂,流动相/展开剂：沿着滤纸流动的溶剂或混合溶剂,纸色谱法,吸附色谱是靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离的方法。吸附力主要是范德华力，有时也可能形成氢键或化学键。吸附法的关键是选择吸附剂和展开剂。,3、纸色谱法的基本原理,常见的展开剂及其极性大小顺序如下：水乙醇丙酮正丁醇乙酸乙酯氯仿乙醚甲苯苯四氯化碳环己烷石油醚,纸色谱法,4、应用,纸色谱法特点： 1）设备简单， 2）操作容易，3）分离效率很高，4）应用很广泛、适于微量分析。,纸色谱法,纸色谱法定义纸色谱法的操作过程纸色谱法的基本原理纸色谱法的应用,总结,薄层色谱法,一、薄层色谱法概念及原理,薄层色谱法（常用TLC表示）又称薄层层析，属于固液吸附色谱。样品在薄层板上的吸附剂（固定相）和溶剂（移动相）之间进行分离。由于吸附剂对不同组分的吸附能力的不同，使它们在薄层上的移动速度也有差别，从而得以分离，显然试样中吸附能力最弱的组分在薄层中移动距离最大，而试样中吸附能力最强的组分在薄层中移动距离最小。,二、吸附剂与展开剂的选择,（1）吸附剂： 选择吸附剂时，要求有一定的比表面积，稳定性和机械强度好，不溶于展开剂，不与展开剂和样品组分反应。（硅胶、氧化铝最为常见）硅胶或氧化铝对各类有机化合物的吸附能力大小顺序如下：羧酸醇、酰胺伯胺酯、醛、酮腈、叔胺、硝基化合物醚烯烃卤代烃烷烃,（2）展开剂：选择展开剂时，主要考虑极性，其洗脱能力与极性成正比。分离极性大的化合物赢选用极性展开剂，而分离极性小或非极性的化合物应选用极性小的展开剂。单一溶剂极性大小顺序如下：酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯四氯化碳二硫化碳环己烷石油醚,二、吸附剂与展开剂的选择,（1）制板 倾注法： 将适量过滤倒入烧杯中，加少量水搅拌成均匀糊状，迅速倒在玻璃板上，用玻棒小心铺平，轻轻振动，尽量使吸附剂均匀。然后风干，置于烘箱中，在105110下活化45min左右，取出放于干燥器中备用。 刮平法：将一长条玻璃的两边放置两块合适的玻璃为边，再将调好的糊状硅胶迅速倒在玻璃板上，用有机玻璃尺沿一个方向将硅胶刮为均匀薄层。去掉两边玻璃，晾干、活化，取出放于干燥器中备用。 涂布器法：用转移的涂布器（市售或自制）来制作薄层，快速方便，制成的薄板质量好。,三、薄层色谱法操作过程,（2）点样 用一根玻璃毛细管或点样器，吸取样品溶液，在距薄层一端约2cm的起始线上点样，每点间距约2cm，样品点直径一般小于0.5cm。注意点样量要适中，太少时，某些成分不能被检出；太多时容易产生拖尾现象，即每个斑点都拉得很长，互相重叠，不能分开。 (3）展开 将点好样的薄层板置于已为展开剂蒸气饱和的层析缸中，点有样品的一端浸入展开剂中，盖好盖子，使层析缸密闭，直至展开完毕。 对于样品中的有色组分，在薄层上会出现对应的有色斑点，而无色组分需用合适方法使其斑点显色，显色之前应使展开剂完全挥发。,三、薄层色谱法操作过程,(4)检测显色也称定位，即用某种方法使经色谱展开后的混合物斑点呈现颜色，以便观察其位置，显色方法主要有以下几种: 蒸气显色法：利用样品组分与单质碘、液溴、浓氨水等物质的蒸气作用而显色。将上述易挥发物质放于密闭容器中，再将展开剂已完全挥发的薄层板放入则显色。 显色剂显色法：将一定浓度的显色剂溶液均匀喷洒在薄层上，是样品组分显色。 紫外显色法：某些化合物在紫外光照射下回发出荧光，可将展开剂挥发后的薄层在紫外灯下观察荧光斑点，并用铅笔在薄层上做记号。一些不发荧光的物质用荧光衍生化试剂作用后也可用同样的方法观察。,三、薄层色谱法操作过程,四、注意事项,1）展开时，层析缸中的有机溶剂蒸气必须达到饱和，否则，Rf值将不能重现。2）在薄层用的吸附剂中，硅胶适用于酸性和中性组分的分离，碱性组分与硅胶有相互作用，不易展开，或发生拖尾现象，不好分离；氧化铝适用于碱性好中性组分的分离，但不适用于酸性组分的分离。3）如果单一展开剂效果不好，可以用混合溶剂，通过改变溶剂组分和比例来调整展开剂的极性，从而达到分离效果的目的。4）点样时要注意待前一滴溶剂挥发后再点后一滴，这样能够使点成的斑点尽量小，不会严重扩散。5）样品浓度要合适，太高容易引起斑点拖尾，太低则斑点扩散，一般控制浓度为0.1%1%。,五、薄层色谱法-应用,痕量组分的检测同系物与异构体分离无机离子的分离,薄层色谱法概念及原理吸附剂与展开剂的选择薄层色谱法操作过程注意事项薄层色谱法应用,总结,固相萃取概念与原理,一 、固相萃取(SPE)概念,SPE ：Solid Phase Extraction是一种液相色谱分离，利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物与干扰化合物分离，达到分离和富集目标化合物的目的。,固相萃取概念与原理,固相萃取概念与原理,二 、固相萃取的模式及原理, 阴离子交换 阳离子交换,反相固相萃取正相固相萃取离子交换固相萃取,固相萃取概念与原理,1、反相固相萃取,流动相：极性（水溶液）或中等极性固定相：非极性。分离对象：中等到非极性物质。,固相萃取概念与原理,（1）反相固相萃取原理,分析物中的CH键 + 硅胶表面官能团吸附极性溶液中的有机分析物保留在SPE。用非极性溶剂解吸吸附在固定相中的目标物质。,固相萃取概念与原理,（2）常用反相固相萃取柱,LC-18、LC-8 ：标准的单键合硅胶ENVI-18、ENVI-8 ：聚合键合类填料ENVI-Chrom P：苯乙烯：疏水 ENVI-Carb：含碳,固相萃取概念与原理,2、正相固相萃取,流动相：非极性、中等极性固定相：极性。分析物质：极性、中等极性、非极性,固相萃取概念与原理,（1）正相固相萃取原理,保留取决于分析物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间的相互作用。 用比样品本身更极性的溶剂洗脱吸附的分析物质。,固相萃取概念与原理,（2）常用正相固相萃取柱, 极性官能团键合硅胶 LC-CN， LC-NH2， LC-Diol 极性吸附物质 LC-Si， LC-Florisil， ENVI-Florisil， LC-Alumina,固相萃取概念与原理,固相萃取概念与原理,目标物质分离,固相萃取(SPE)概念固相萃取的模式及原理反相固相萃取正相固相萃取,总结,固相萃取操作,固相萃取的装置,固相萃取操作,1、固相萃取的装置,固相萃取操作,1、固相萃取的装置,固相萃取操作,1、固相萃取的装置,流量控制阀 堵头 装置顶盖 顶盖支脚 导向针 试管架 真空表 玻璃缸 废液槽,固相萃取操作,2、操作程序,（1）活化吸附剂 萃取之前要用适当的溶剂淋洗小柱，以使吸附剂保持湿润，可以吸附目标化合物或干扰化合物。,固相萃取操作,2、操作程序,（2）上样（吸附） 样品倒入活化后的固相萃取小柱，然后利用抽真空，加压或离心的方法使样品进入吸附剂。,固相萃取操作,2、操作程序,（3）洗涤（去除杂质）在样品进入吸附剂，目标化合物被吸附后，可先用较弱的溶剂将弱保留干扰化合物洗掉。,固相萃取操作,2、操作程序,（4）洗脱和收集 再用较强的溶剂将目标化合物洗脱下来，加以收集。,固相萃取操作,总结,固相萃取的应用,HPLC与SPE的比较,100,2025，000,塔板数,球型（不均匀）,球型(均匀）,颗粒形状,40,5,颗粒度(um),塑料柱,不锈钢柱,硬件（柱子）,SPE,HPLC,固相萃取的应用,1、柱子的比较,？,固相萃取的应用,2、塔板数的比较,N = L/H,固相萃取的应用,五、固相萃取 应用,1、食品领域应用,2、环境检测应用,3、药物分析中的应用,固相萃取的应用,1、食品领域应用,农药残留：茶叶中519种农药及相关化学品残留量的测定（GB/T 23204-2008）,兽药残留：水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定（GB/T 20361-2006）,污染物： 动植物油脂中苯并（a）芘的测定（GB/T 5009.27-2016）,非食用物质：食品中苏丹红染料的检测方法（GB/T 19681-2005）,固相萃取的应用,2、环境检测应用,水中四环素类抗生素 车内空气中的醛酮检测（HJ/T 400-2007） 土壤中多环芳烃 饮用水中亚硝胺 水样中烷基汞,固相萃取的应用,3、药物分析中的应用 城市水体中精神类药物的检测 中药材中黄曲霉毒素的检测 保健食品中总皂苷的检测 中药基质盐酸可乐定的测定,固相萃取的应用,发展趋势设备的自动化、高通量新材料、专属性,固相萃取的应用,HPLC与SPE的比较柱子的比较、塔板数的比较食品领域应用环境检测应用药物分析中的应用发展趋势,总结,