分枝杆菌分离培养及质量控制课件.ppt

结核分枝杆菌分离培养,柳正卫,结核分枝杆菌,结核分枝杆菌-结核病的病原体,1882年koch发现了结核杆菌，1896年将结核杆菌正式命名为结核分枝杆菌。,分枝杆菌书属于裂植菌纲，效线菌目，分枝杆菌科，分枝杆菌属。以伯杰系统细菌学手册分类法为国际间广泛公认和采用，伯杰系统细菌学手册确认的分枝杆菌有100多个种，根据生长速度将分枝杆菌属分为快速生长分枝杆菌和缓慢生长分枝杆菌。其中结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等26种为缓慢生长为分枝杆菌。7天以上肉眼可见单个菌落，称为缓慢生长分枝杆菌，其代表菌种是结核分枝杆菌(M.tuberculosis). 7天以内肉眼可见单个菌落，成为快速生长分枝杆菌。,分枝杆菌分类,分枝杆菌种类,类别 Rubyun分群 对人致病的分枝杆菌 缓 结核分枝杆菌复合群 人型、牛型、非洲型 慢 非结核分枝杆菌群 堪萨斯、海、猿 生 非结核分枝杆菌群 瘰疠 长 非结核分枝杆菌群 鸟-胞内、蟾快速生长 非结核分枝杆菌群 偶发、龟,分枝杆菌属主要特点,是一类直或微弯曲、有分枝生长趋势的杆菌。细胞壁脂质含量高，主要为分枝菌酸。具有抗酸性，革兰染色不易着色，常用抗酸染色。专性需氧营养要求特殊，大多数生长缓慢。不产内、外毒素和侵袭性酶等致病物质，所致疾病呈慢性。,分枝杆菌种类,分枝杆菌属，除结核分枝杆菌复合群（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌）及麻风分枝杆菌外，余者统称为非结核分枝杆菌（Nontuberculosis Mycobacteria,NTM）结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原菌，此外，牛分枝杆菌除引起牛结核病外，少数人类结核病也由其引起。非洲分枝杆菌致病力较弱，是热带非洲人结核病病原体。田鼠分枝杆菌对人类无致病性。,分枝杆菌属种类,结核分枝杆菌复合群,结核分枝杆菌牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌田鼠分枝杆菌,非典型分枝杆菌,麻风分枝杆菌,光产色分枝杆菌暗产色分枝杆菌不产色分枝杆菌迅速生长分枝杆菌,分枝杆菌属,形态直或销弯曲、两端钝圆的杆菌，菌体长1-4um，宽0.3-0.6um，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，经抗酸染色后菌体呈红色杆状，单个散在或呈“人、V、T、Y”形排列。结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质核质。,结核分枝杆菌生物学特性,1. 专性需氧菌(50% O2); 8% CO2 可促进基础生长2. 营养要求: - C 源: 甘油, 有机酸 (丙酮酸盐, 柠檬酸, 棕榈酸盐), 葡萄糖 - N 源: 天(门)冬酰胺, 谷氨酸, 等 - 鸡蛋或血清蛋白: 保护 MTB 拮抗毒素 (油酸,毒素但在血清蛋白存在的情况下可促进结核菌的生长)3 . 环境：- 生长最适温度为35-37 - 最适PH为6.8-7.2,结核分枝杆菌的生长和营养,7,生长现象：生长缓慢 在培养基上繁殖一代约需15-20小时，一般需2-4周或更长时间始见菌落生长，有极少数生长极为缓慢者需8周以上才开始有菌落生长。改良罗氏培养基菌落特征：菌落粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，乳白色或米色，无可溶性色素,不透明。液体培养基：形成菌膜，有毒株呈索状生长,结核发枝杆菌的生长特征,结核分枝杆菌菌落,结核分枝杆菌革兰染色阳性，但不易着色。经苯胺染料染色着色后，能抵抗酸和酸乙醇脱色，称为抗酸性。经抗酸染色后，结核分枝杆菌呈红色，而标本中其他细菌、细胞、杂质等均呈蓝色。,结核分枝杆菌的染色特性,结核分枝杆菌因细胞壁含大量类脂质，具有疏水性，对物理和化学因素抵抗力均较强。在室温和阴暗处干燥痰可存活6-8个月，在空气中可保持传染性8-10天，在-6-8度能存活4-5年，湿热对结核分枝杆菌杀伤力强，煮沸与高压蒸气消毒是杀灭最有效的方法之一。结核分枝杆菌对光线和射线敏感，因此紫外线照射常用于空气和物体表面消毒。,结核分枝杆菌的抵抗力,耐药性是结核杆菌的重要生物学特性,耐药菌不断生长繁殖，终致菌群中以耐药菌为主（敏感菌被药物淘汰），抗结核药物即失效。由基因突变而出现的极少量天然耐药菌（自然变异），通常不致引起严重后果。药物与结核杆菌接触后，有的细菌发生诱导变异，逐渐能适应在含药环境中继续生存（继发耐药）。耐异烟肼菌株的致病力显著减弱，耐链霉素菌株的致病力一般不降低，耐利福平菌株有不同程度降低，对利福平及异烟肼同时耐药，其致病力降低较单一耐异烟肼者更显著。,结核分枝杆菌生化反应,生化反应不活泼，不发酵糖类与非结核分枝杆菌鉴别： 耐热触酶试验；（非结核分枝杆菌）与牛分枝杆菌鉴别 烟酸试验；（牛分枝杆菌）,结核分枝杆菌抵抗力与变异性,抵抗力特点：“三耐四敏”耐干燥、耐酸碱、耐孔雀绿（1：13000）对湿热、70乙醇、紫外线、常用抗结核药物（但长期使用易产生耐药性）变异性典型形态多形性R型菌落S型菌落有毒无毒（用于制备疫苗）抗结核药敏感耐药,结核分枝杆菌致病物质,脂质 索状因子:与该菌毒力有密切关系 磷脂: 分枝菌酸：与抗酸性有关 蜡质D:具有佐剂作用 硫酸脑苷脂蛋白质糖类结核杆菌不产生内、外毒素，不产生侵袭性酶,结核分枝杆菌所致疾病与免疫性,经多途径感染，引起结核病，以肺结核多见类型：原发感染和继发感染免疫性抗结核免疫以细胞免疫为主抗结核免疫属带菌免疫抗结核免疫与型超敏反应同时出现,结核分枝杆菌鉴定程序,结核分枝杆菌检验程序,标本,核酸检测,接种固体培养基,可疑菌落,涂片抗酸染色镜检,抗体检测,慢性生长菌,快速生长菌,菌种鉴定,标本前处理,接种液体 培养基,接种小白鼠 豚鼠,脏器涂片 镜检,抗酸染色,鉴定试验,分枝杆菌菌种鉴定的意义,非结核分枝杆菌的发病率在不同的国家、不同的地区报告差别很大。据资料报道，日本在1980年报告：在分枝杆菌感染中，非结核分枝杆菌的发病率为12%，并有逐年上升趋势，其中主要为鸟胞内复合群，高达89.6%，其次为堪萨斯占8.0%我国年对非结核分枝杆菌的研究资料尚不充足，也缺乏较大规模的流调，据报告非结核分枝杆菌在我国的发病率占分枝杆菌的4.3%左右。,分枝杆菌菌种鉴定的意义,一般来说，非结核分枝杆菌对抗结核药物的敏感性低于结核菌，但各型和各菌株之间对药物的敏感性差别甚大。,分枝杆菌菌种鉴定,形态学 菌落形态、颜色生长条件 28 生长试验，结核分枝杆菌在28 的孵育环境中不能生长；而TNM菌群的大部分分枝杆菌可以生长。生化反应 硝酸还原 、烟酸试验酶 尿素酶 耐热触酶 分子生物学方法,分枝杆菌菌种鉴定,分枝杆菌菌群鉴定的目的既是鉴定菌株属于结核分枝杆菌复合群还是非结核分枝杆菌，也是进一步菌种鉴定的基础。分枝杆菌临床分离株药物敏感性试验应与菌种初步鉴定同步进行，以对硝基苯甲酸（PNB）、噻吩-2-羧酸肼（TCH）鉴别培养基初步鉴别结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非结核分枝杆菌鉴别培养基的制备过程略。,分枝杆菌菌种初步鉴定,分枝杆菌菌种鉴定质量控制要求,经过初步鉴定的分枝杆菌，需进一步进行菌种鉴定，可送上一级实验室。鉴别菌株应生长旺盛，生长时间为34周为宜。所有培养基、试剂应在规定期限内使用。所有试剂均应用标准菌株对照试验合格后使用。,非典型分枝杆菌,是指结核分枝杆菌与麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。大多为环境中的腐生菌对酸碱比较敏感对常用抗结核药耐受为条件致病菌，艾滋病患者易感染鸟复合分枝杆菌,MTB鉴定流程,Mycobact.tuberculosis,其他分枝菌,M. tuberculos培养特征(1) 10天后出现较硬菌落(2) 抗酸菌(3) 索状构成,初培养物,生长的好,生长的差,yes,敏感,抵抗,+,烟酸+NO3 试验,68 耐热触酶试验,PNB敏感性试验,no,MTB NTM,结核分枝杆菌分离培养操作,结核分枝杆菌分离培养,标本前处理：目的：杀死杂菌；液化标本方法： 4NaOH法； 4H2SO4法； 胰酶-新洁尔灭法等培养基选择：罗氏培养基、米氏培养基、小川培养基等接种培养,去污染处理(痰标本),视标本性状，加12倍体积4%氢氧化钠（NaOH)消化液于痰瓶中，拧紧螺旋盖，涡旋震荡器上震荡1min，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在1520min。标本较多时，应分批处理,病理组织或干酪块 标本切碎后置于无菌组织研磨器，加入适量（0.51ml）生理盐水后充分研磨成混悬液；混悬液经3000r/min离心30min后，沉淀物进行碱处理与24倍量2%氢氧化钠（NaOH)混合，处理15min后接种。尿液 留全量夜尿，静置45h,取沉淀部分约10ml,3000r/min离心30 min,取沉淀进行碱处理与等倍量4%硫酸（H2SO4）混合,处理15min后接种.,去污染处理(其他标本),去污染处理(其他标本),脓液 采用4%硫酸（H2SO4）以13混匀后，静置25min（期间震荡数次)，按无菌手续接种0.1ml经处理的标本至L-J培养基，每份标本接种2支培养基。酸处理去污染时间不超过25min。胸腹水,支气管灌洗液标本 参照痰标本处理办法.,去污染处理(其他标本),脑脊液 无菌操作收集的脑脊液,置冰箱或室温24h,待薄膜形成后将薄膜接种到L-J培养基;或将脑脊液 在无菌操作环境中3000r/min离心30 min,取沉淀直接接种到L-J培养基.非无菌操作采集的脑脊液标本,离心后的沉淀进行碱处理与等倍量4%氢氧化钠（NaOH)混合,处理1015min后接种于酸性L-J培养基,去污染处理（其他标本）,粪便 标本与生理盐水混合后,充分振荡使之成为混悬液;定性滤纸过滤后,滤液经3000r/min离心10 min;沉淀进行酸处理与24倍量的4%硫酸（H2SO4）混合,处理1520 min)后接种L-J培养基.咽喉棉拭子 将棉拭子放入一无菌试管,加入适量生理盐水浸泡,加入等体积 4%氢氧化钠（NaOH)后强烈振荡,静置15 min后接种.,不同温度下储存痰标本中结核分枝杆菌生存活力的改变,90,81,90,n=36,n=41,n=41,No. of sputa tested,Kim SJ, et al, 1986Paramasivan CN, et al, 1983,7,0,3,14,21,2530,28,25,4,痰标本的收集和运输,容器：带螺旋盖的McCartney玻璃或塑料瓶收集：至少两份标本（两份即时痰或1份即时痰和1分家中采集的痰）运输： 使用CPC or CPB; 使用泡沫盒加冰袋 标本加酒精或其它杀菌剂/标本灭菌后在 CTL用分子学做鉴定和药敏,含有 CPC痰标本的去污处理 TB 在0.5% CPC中的存活,新鲜痰标本用等体积 1%CPC 或0.6% CPB混合,10,20,酸性改良罗氏培养基,成分和制备方法略。,痰培养方法,简单培养：适合于大部分实验室/临床检验浓缩培养：在有离心机、相应材料和熟练技术人员的条件下适用,简单法培养过程,Sputum,Add 4% NaOH,匀化,痰去污处理 (15 min),如没有中和，接种到酸性培养基,361C孵育9周,MTB growth,铺开/水平位置孵育/ 24-48 小时后拧紧瓶盖,or,浓缩法涂片/培养,Sputum,Add 4% NaOH,匀化/去污处理,37C孵育9周,MTB growth,1.用尽可能多的无菌水/ PB稀释2. 3,000 xg离心2次以上3.用接种环或吸管转移沉淀,Swing bucketrotor,Bucket& tubes,Windshieldedswing bucketrotor,固定角度的转头,离心力对痰涂片和培养结果的影响,结果报告,1.接种后第3、7天各观察1次菌落生长情况。发现菌落生长者，经抗酸染色证实后，可报告快速生长分枝杆菌阳性。此后每周观察1次，记录菌落生长及污染情况。阳性生长物经抗酸染色证实后，可报告分枝杆菌生长。满8周后未见菌落生长者方可报告培养阴性结果。,结果报告,2.观察时发现非结核分枝杆菌生长时，应报告污染。培养污染率应控制在2%5%范围。污染率过高，提示培养基灭菌不佳，标本前处理、接种等环节有误，应当分析原因，采取相应措施。,结果报告,(1)分枝杆菌培养阴性:斜面无菌落生长,以“培养阴性”报告,不可以“”表示.(2)分枝杆菌培养阳性（）：菌落生长占斜面面积的1/4(3)分枝杆菌培养阳性（2）：菌落生长占斜面面积的1/2(4)分枝杆菌培养阳性（3）：菌落生长占斜面面积的3/4(5)分枝杆菌培养阳性（4）：菌落生长布满整个斜面(6)报实际菌落数:菌落生长不足斜面面积1/4,分离培养的操作流程,痰标本中、加12倍体积4%NaOH,涡旋振荡12min,室温静置15min,分别接种0.1ml前处理液至2支培养基斜面,置37 温箱培养,接种后3天,7天观察,此后每周观察一次,有菌落生长需经抗酸染色确认,至第8周无菌落生长报告阴性,AFB复红染色,AFB荧光染色,L-J 培养基上生长的克隆,细菌聚集融合(索状),形态学特征1 0.20.3 x 25 -抗酸/乙醇脱色的杆菌染色特性 - 静止不动; - 无芽孢;2孵育10天后出现象牙色、干燥、较硬、表面粗糙的克隆3 细菌聚集融合 / 形成索状,分枝杆菌分离培养注意事项,培养注意事项,标本的选择：选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分；新发病人应在抗结核药物治疗前留取痰标本。治疗中的病人应停药23天后留取痰标本。标本的保存：如需送上级实验室检查，应在标准痰瓶中，加入与标本等体积的防腐液0.6溴化十六烷基吡啶(CPB)的2氯化钠(NaCl)液，密封保存。此标本应及时送交上级实验室。防腐处理后，痰标本可在室温下短期存放。但仍以4保存为宜，存放时间不应超过2周。时间控制： 从加入消化液（NaOH）到接种时间1520min；消化一定要充分。加入消化液的量应视标本性状接种前倒去培养基中的冷凝水,培养基的选择：用（NaOH）的选择酸性改良罗氏培养基；用H2SO4的选择改良罗氏培养基；使用有限期内的培养基；每批次培养使用前应抽检，放置37培养，观察有无灭菌彻底培养基应放4冰箱保存，接种前应提早30分钟从冰箱中取出，保持一定平衡 接种量的控制：0.1ml，并使接种液均匀分布于培养基表面培养温度：37；第一天平卧放置斜面，并不拧紧瓶盖，第二天直立，拧紧瓶盖。观察时间：接种后3天,7天观察,此后每周观察一次,结果报告：有菌落生长需经抗酸染色确认,至第8周无菌落生长报告阴性；抗酸杆菌培养阴性应以“(培养阴性)”报告，不能以“()”表示。菌落生长不足以斜面面积14时，实报菌落数。抗酸杆菌和污染同时存在于同一斜面上， 应同时报告。培养结果报告方式： 抗酸杆菌培养阴性： 斜面无菌落生长 抗酸杆菌培养阳性（1+）： 菌落生长占斜面面积的1/4 抗酸杆菌培养阳性（2+）： 菌落生长占斜面面积的1/2 抗酸杆菌培养阳性（3+）： 菌落生长占斜面面积的3/4 抗酸杆菌培养阳性（4+）： 菌落生长布满全占斜面,快速生长菌、污染菌鉴别 非抗酸杆菌生长即报污染污染率的控制： 2%5%范围涂阳培阴率：10%涡旋振荡、离心、倾倒上清液、接种时容易产生气溶胶，应注意使用安全仪器，正确操作。,培养失败CPC离心,(1)不论从结核病控制、流行病学检查或临床诊断的角度看，分枝杆菌的分离培养检查法都是结核病确诊最可靠的方法，是结核病病原学诊断的“金标准”。,分枝杆菌分离培养检查法的重要意义,分枝杆菌分离培养检查法的重要意义,(2)开展进一步检测的基础 ，是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生物学研究的基础。(3)随着结核病控制工作水平的提高，一些具备条件的基层结核病细菌学实验室也应逐步开展分枝杆菌的分离培养.,分离培养的优点,敏感性较直接涂片法高，理论上10100条菌/毫升可检出阳性；特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速度，色素产生初步判断非结核分枝杆菌；分离出具有活力的纯培养物，为进一步试验提供基础。,分离培养的缺点,需时长，根据接种量的大小，一般28周才能得到肉眼可见菌落。结果受标本保存运送时间，培养基成分和质量，前处理方法等影响，操作较直接涂片法复杂，需经严格培训。需培养基凝固灭菌器，离心机，涡旋振荡器，恒温培养箱等设备。成本是直接涂片法的78倍。,Dio-TK快速自动变色培养系统,（土耳其，伊斯坦布尔，Diomed公司）,颜色的改变是由于不同种属的细菌代谢产物和产生的酶所造成，而且这种颜色的改变早在培养基上长出肉眼可见的菌落前就发生了,括Dio-TK培养基Dio-TK SLC（选择培养基）Dio-TK PNB（对硝基苯甲酸）Dio-TK INH（异烟肼）Dio-TK RMP(利福平)Dio-TK SM （链霉素）Dio-TK EMB（乙胺丁醇）培养基。,液体培养基,营养好，细菌生长快，利于快速诊断。米氏7H9液体培养基液体变色培养基,底层有颗粒状沉淀，上清无色透明,显色剂：四唑鎓盐还原成粉红色甲臢,液体变色培养基优点,操作简便；培养时间缩短；肉眼观察结果；无需特殊仪器；无放射性污染；进行药敏试验,结果判断带有存在主观性显色结果不能长期保存敏感性、特异性有待提高不能观察菌落特征,液体变色培养基缺点,双相培养基,由固体和液体培养基组成，同时具有两种培养基的优点双相罗氏培养基可促进细菌生长缩短培养时间可提高培养阳性率可观察菌落特征可进行药敏和菌种鉴定,用于病例发现和药敏试验液体培养系统,结核杆菌快速培养仪检测,BACTEC MGIT 960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪BacT/ALERT3D全自动培养仪,荧光物质包埋在7H9液体培养管的底部，分枝杆菌生长过程中，O2被消耗，底物产生荧光，仪器通过测定荧光强度，用生长指数来表示测定结果，培养时间通常需要742天。,分枝杆菌生长过程中代谢产生CO2， CO2的产生使瓶底颜色感受器产生不同的颜色变化。通过比色传感器来测定， CO2产生的速率和总量与细菌生长的速率和总量一致。,BACTEC MGIT,分枝杆菌荧光判读器,用于病例发现和药敏试验的液体培养系统,涂片敏感性较低特别是在儿童或者合并感染HIV的人群。培养较涂片更敏感。液体培养系统较传统固体培养系统更快速、更敏感。Product profileMGIT-TB 培养系统平均检出时间为10-14天，而鸡蛋或者琼脂固体培养基则需要3-4周的时间。MGIT也可以用来检测耐药情况。FIND与BD公司正在评价MGIT-DST的可行性以及在疫情较高的地区广泛应用的影响,Liquid media + drug: - Isoniazid- Rifampicin- Streptomycin- EthambutolTurnaround Time: 2-3 wksafter culture positive,培养的质量控制,结核菌培养实验室网络,室内质量控制,帮助实验室建立自己的室内质量控制制度帮助他们理解培养过程中的每一步推荐用一些简单的法自测，例如：用简单的盐酸滴定法测定NaOH浓度记录培养箱的最高和最低温度 (35-37oC)如果使用离心,用转速记常规检测离心机转速, 保证3000g离心力对于自动液体培养系统, 保证能做日常维持和检测工作. 检查每一批新的培养基和 PENTA所有实验结果和记录必须装册,举例: LJ培养基制备指南 (1),孔雀绿:可能对分枝杆菌有一定的杀菌作用, 选择测试后无杀分枝杆菌作用的必须避光保存鸡蛋来源:A级: 能为LJ培养基提供足够的蛋白无抗生素和染料新鲜,蛋壳无缝，表面无真菌生长 不容易获得,举例: LJ培养基制备,无菌测试阳性质控:偶然分枝杆菌3天内生长 50-100 CFU单位 的 MTB在4周内能生长送新批培养基到高一级别实验室进行生长测试试验？,培养阳性率和污染率,红线：阳性率绿线：污染率蓝线：涂片阳相率,培养一些指标,污染率: 3-5%; 5-10% (液体培养)阳性结果需要的平均时间 : 4-5 周涂阴培阳率: 10%其他分枝杆菌 (例如戈登分枝杆菌): 基线监测值，占全部的5% ?, 或者其他分枝杆菌？,谢谢！,