第二章细胞破碎与提取要点课件.ppt

第二章 蛋白质的制备 -细胞破碎与萃取,第一节 蛋白质制备总则,来源、 胞内（胞外）、 可溶性、 分子大小、 等电点、 稳定性（对温度、pH、蛋白酶、金属离子的耐受性）等,二、方法选择依据： 根据不同蛋白质的性质和研究目的,一、目标：高效率、高收率、高纯度、高活性,1、蛋白质的性质：,工业化应用：经济性（高收率，纯度次要） 一般研究：80%-90%纯度 结构研究：95%以上纯度 医疗：全面分析,2、研究目的：,越到后面的纯化越困难，增加成本，延长操作时间，收率低,考虑产品的质量、数量和经济性,三、确立有效成分的测定方法,1、蛋白质初步提取和浓缩,吸附法 超滤法 沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀） 透析,三、确立有效成分的测定方法,2、蛋白质高效分离纯化,色谱法（凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等） 电泳法 （聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦、毛细管电泳等）,3、根据蛋白质性质确立分离方法,溶解度不同：等电点，有机溶剂，盐析电荷不同：电泳，离子交换分子形状大小不同：离心，透析，凝胶过滤,四、蛋白质的制备流程：,原料液,细胞分离(离心，过滤),细胞胞内产物,细胞破碎,碎片分离,清液胞外产物,粗分离(盐析、萃取、超过滤等),纯化(层析、电泳),脱盐(凝胶过滤、超过滤),浓缩(超过滤),精制(结晶、干燥),包含体,溶解(加盐酸胍、脲),复性,首先：,材料的选择和预处理细胞的破碎和细胞组分分离有效成分的萃取,第二节 材料的选择、预处理与保存,一、原料选择原则：,有效成分含量高、原料来源丰富，易得；,原料中杂质含量少；,原料成本低等；,植物采收具有季节性,微生物生长的对数期,注意动物的年龄与性别,微生物：及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。,二、原料的预处理：,动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、 脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。,植物原料：要择时采集并就地去除不用的的部分， 有用部分保鲜处理。,（3）防腐剂保鲜：常用乙醇、苯酚等。适用于液体原 料，如发酵液、提取液等。,三、原料的保存方法,（1）冷冻法：适用于所有生物原料。常用-40速冻。,（2）有机溶剂脱水法：丙酮，该法适用于原料少而价值高、 有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。,第三节 细胞破碎,一、破碎方法的原则和依据,原则：最大提取、不易变性、减少干扰具体须从材料特性和目的物特性综合考虑。,1、材料细胞的特性,动物细胞无细胞壁，易破碎，只需用温和方法植物细胞有细胞壁难破碎，须用中等或强度大的方法微生物细胞较复杂，一般用较强的方法,2、目的物的特性,. 处理量 有些处理量大，如组织捣碎机等。 有些处理量少，如超声波破碎等。,细胞中的位置游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。结合状：结合在膜或细胞器内，先收集膜或细胞器，再破碎,敏感性 温度、pH、氧、剪切力、杂酶等影响, 机械法,1.组织捣碎机： 适用：动植物组织,二、破碎方法,原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞,具体方法：,2.匀浆器 适用：较柔软、易分散的组织细胞,3.研钵 适用：微生物（细菌）与植物细胞, 物理法,1超声波破碎,2渗透压冲击法：适用：处理胞壁较脆弱的微生物。细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂,3反复冻融法：-15-20， 适用：动物材料将待破碎的细胞冷至15到20，然后放于室温(或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。,4急热骤冷法： 8590数分钟，冰浴冷却 适用：细菌及病毒中对热不太敏感的物质,化学法,2表面活性剂法 破坏细胞膜，释放目的物（需与其它方法结合应用）。,1溶剂处理法： 丙酮、氯仿、甲苯等 溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。,（四）酶解法,2外加酶法 将细胞壁分解，使内含物释放出来。细菌：加溶菌酶（结合反复冻融或加EDTA）酵母：采用-葡聚糖酶霉菌：添加几丁质酶植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。,1自溶法 保温一定时间，通过细胞本身的酶将细胞破坏。,例：外源蛋白在大肠杆菌中的积累,三、包含体及其纯化,包涵体（inclusion bodies），或包含体，是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包涵体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包涵体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。,包涵体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些基因表达产物没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包涵体后，溶解包涵体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以，包涵体的出现不仅增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为生物化学家的蛋白质折叠（protein folding）机理研究提出了新的课题。,重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素、人干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒包涵体（inclusion bodies IBs)。,2、包含体的构成,基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。,分离包含体后，需使目标蛋白恢复应有的天然活性。（蛋白质折叠）,包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。,3、包含体特点:,是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。,包含体难溶于水，易溶于变性剂（如盐酸胍、脲）。,细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，离心（5000 -20000g 15min）就可以沉淀。,几种常见的工艺路线（一）,机械破碎(高压匀浆、高速珠磨）,差速离心提取出包含体,加变性剂溶解,除变性剂复性,基因工程包含体的纯化方法,路线1 的特点,特点:用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单。 缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。,基因工程包含体的纯化方法,几种常见的工艺路线（二）,机械破碎,膜分离除可溶性蛋白,加变性剂溶解包含体,除变性剂复性,基因工程包含体的纯化方法,路线2 的特点,优点：应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，封闭式操作，不污染环境也不受环境污染。,基因工程包含体的纯化方法,缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常导致可溶性蛋白质的滞留。,几种常见的工艺路线（三）,化学破碎（加变性剂）,离心除细胞碎片,除变性剂复性,基因工程包含体的纯化方法,路线3 特点：,基因工程包含体的纯化方法,优点：化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。,缺点：所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。,一、概述,第四节 萃取,1、基本概念及分类概念：萃取是利用溶质在互不混溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。,液-固萃取,液-液萃取,化学萃取,物理萃取,双水相萃取,超临界萃取,萃取原理,参与溶质分配的两相不同,分类：,概念：用某种溶剂把有用物质从固体原料中提取到溶液中的过程称为固-液萃取，也称浸取或浸出。,应用：用温水从甜菜中提取糖，用有机溶剂从大豆、花生等油料作物中提取食用油，用水或有机溶剂从植物中提取药物、香料或色素等。,液-固萃取,用溶剂从溶液中抽提物质叫液-液萃取，也称溶剂萃取。经典的液-液萃取指的是有机溶剂萃取,液-液萃取,有机溶剂萃取法广泛应用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物工业规模的提取上。,应用,比化学沉淀法分离程度高；比离子交换法选择性好、传质快；比蒸馏法能耗低；生产能力大、周期短、便于连续操作、易实现自动化控制,优点,溶剂萃取法和其他新型分离技术相结合，产生了一系列新型分离技术：超临界流体萃取（Supercritical fluid extraction）反胶团萃取（Reversed micelle extraction）双水相萃取技术（Partition of two aqueous phase system ）,液-液萃取,用于高品质的天然物质、胞内物质（胞内酶、蛋白质、多肽、核酸等）的分离提取上。,根据萃取原理分类的 基本概念,化学萃取 利用脂溶性萃取剂与溶质之间发生化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相分配的过程。,物理萃取 溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡而进行萃取的分离过程。,2、萃取技术的操作特点, 萃取过程具有选择性 能与其他纯化步骤相配合适用于各种不同的规模传质速度快，生产周期短，便于连续操作,3、萃取需要考虑下列问题, 生物系统的错综复杂和多组分特性, 产物的不稳定性, 相分离性能,把目标物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相中。物质的溶解和相似相溶原理。萃取是通过溶质在两个液相之间的竟争性溶解（分配）而实现的。,二、溶剂萃取技术（液-液萃取）,影响萃取操作的因素：,温度pH值盐分,温度互溶性增大；温度产物稳定性提高，粘度增加，扩散性能减小。,影响分配系数，影响物质解离情况,无机盐类如硫酸铵、氯化钠等一般可降低产物在水中的溶解度而使其更易于转入有机溶剂相中，另一方面还能减小有机溶剂在水相中的溶解度。盐分分配系数,d乳化,分散,非均相,一种,另一种,乳剂,乳化即水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或水相中的现象。,乳化剂类型,O/W (水包油型),W/O (油包水型),（亲憎平衡值）,HLB,HLB数即亲水与亲油平衡程度，HLB数越大，亲水性越强，形成O/W型乳浊液，HLB数越小，亲油性越强，形成W/O型乳浊液。,乳化与去乳化,在发酵液中，蛋白质是引起乳化的最重要的表面活性物质。 由蛋白质引起的乳化多为水包油型（O/W）。,乳化带来的问题：有机相和水相分相困难，出现夹带。,破乳的方法：,1.加热破乳,升温加速乳状液液珠的布朗运动使絮凝速率加快，同时使界面粘度迅速降低，使聚结速率加快，有利于膜的破裂。,2.高压电破乳,高压电场的破乳较复杂不能只看作扩散双电层的破坏，在电场下液珠质点可排成一行，呈珍珠项链式，当电压升到某一值时，聚结过程在瞬间完成。,3.过滤破乳,当乳状液经过一个多孔性介质时，由于油和水对固体润湿性的差别，也可引起破乳。,4.化学破乳,化学破乳的原则是破坏吸附在界面上的乳化剂，使其失去乳化能力。常用的是使用破乳剂。破乳剂也是一种表面活性剂，有很高的表面活性，能将界面上原来存在的乳化剂顶替走；但破乳剂分子一般具有分支结构，不能在界面上紧密排列成牢固的界面膜，从而使乳状液的稳定性大大降低。,5.电解质破乳,对于稀的乳状液，起稳定作用的是扩散双电层，加入电解质可破坏双电层，也能使乳状液聚沉,三 反胶束萃取 （反胶团萃取）,1、基本术语,胶束(micelles): 向水中加入表面活性剂，水溶液的表面张力随S增大而下降。当S达到一定值后，溶液的表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低。临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC): S在水溶剂中形成胶束的最低浓度。,反胶束(reverse micelles): 若向有机溶剂中加入一定浓度S和水，在有机溶剂中所会形成内部含少量水的胶束。微水相或“水池”(water pool)：反胶束内溶解的水。,2反胶束的溶解作用,微水池溶解和分离作用：反胶团的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子, 为生物分子提供易于生存的亲水微环境. 因此,反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子。,2反胶束的溶解作用,溶解推动力A静电作用：理论上,当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引力的作用,溶质易溶于反胶团,溶解率或分配系数较大,反之,则不能溶解到反胶团相中,左图为pH值对不同蛋白质的溶解率急剧变化,当pH7,即在带正电荷的pH范围内蛋白质的溶解率接近100%,说明静电相互作用对蛋白质的反胶团萃取起决定性作用。,2、反胶束的溶解作用,B空间相互作用 盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应, 含水率W0随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小, 空间排阻作用增大, pro溶解下降. 如，AOT/异辛烷系统的含水率与I-0.5成正比。图还示：AOT/异辛烷系统的含水率与AOT浓度无关,这是多数反胶团系统的共性.,3、反胶束萃取的影响因素,1) pH valueAOT = 二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸钠。,2)盐浓度,盐浓度,W0,S&Pro Z,选择性,3)、盐离子的种类,4) 蛋白质分子量M,5)、表面活性剂SA种类BS,6) 助表面活性剂,4、应用,1) 蛋白质分离,2) 胞内酶的提取,四、 超临界流体萃取,Supercritical Fluid Extraction,简介：,超临界流体萃取(SCF)是20世纪70年代后期迅速发展起来的一种新兴的萃取分离技术，是利用超临界流体作为萃取剂，对物质进行溶解和分离的过程。超临界流体具有气体和液体之间的性质，且对许多物质均具有很强的溶解能力，分离速率远比液体萃取快，可以实现高效的分离过程。,超临界流体的发展,1822年，首次报道1879年，发现超临界流体对固体有溶解能力1970年 从咖啡豆提取咖啡因1992年，首先报道了超临界聚合反应,（一）、超临界流体的萃取的原理,1. 流体的临界特征气相、液相、固相三相成平衡态共存的点叫三相点。液、气两相成平衡状态的点叫临界点。在临界点是所要求的温度和压力分别称为临界温度（Tc）和临界压力（pc） 。稳定的纯物质及由其组成的固定组分混合物具有固有的临界状态点。,超临界流体(SCF),2. 超临界流体的特征,超临界流体(SCF)是处于临界温度和临界压力以上的非凝缩性的高密度流体。超临界流体没有明显的气-液界面，既不是气体，也不是液体，是一种气-液不分的状态，性质介于气体和液体之间。流体处于超临界状态时，其密度接近液体密度，并且随流体压力和温度的变化发生十分明显的变化。,超临界流体的性质,超临界流体的主要特性,密度类似液体压力和温度的变化均可改变相变粘度, 扩散系数接近于气体SCF的介电常数，极化率和分子行为与气液两相均有着明显的差别,溶质在超临界流体中的溶解度随超临界流体密度的增大而增大。,2. 超临界流体的特征,超临界流体萃取正是利用这种性质，在较高压力下，将溶质溶解于流体中，然后降低流体溶液的压力或升高流体溶液的温度，使溶解于超临界流体中的溶质因密度下降，溶解度降低而析出，从而实现特定溶质的萃取。,可作为超临界流体的物质：二氧化碳、一氧化亚氮、六氟化硫、乙烷、庚烷、氨等。,常用的流体介质,二氧化碳：临界温度：31.1；临界压力：7.2MPa临界条件容易达到、化学性质不活泼、无色无味无毒、安全性好、价格便宜、纯度高、容易获得等优点,3. 超临界流体萃取特点(优点), 萃取和分离合二为一 压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数 萃取温度低 临界CO2流体常态下是气体，无毒 超临界流体的极性可以改变,4. 萃取技术的应用举例,生物活性物质和生物制品的提取 CO2萃取技术主要应用于有害成分成分的脱除、有效成分的提取、食品原料的处理等几个方面。例如：用SFE从咖啡、茶中脱咖啡因；啤酒花萃取；从植物中萃取风味物质；从各种动植物中萃取各种脂肪酸、提取色素；从奶油和鸡蛋中去除胆固醇等。,例1 脱咖啡因超临界流体萃取技术得到最早大规模的工业化应用的是天然咖啡豆的脱咖啡因。,用SF-CO2法从咖啡豆中脱出咖啡因工艺流程,例2.啤酒花萃取,普通的有机溶剂萃取法制取的啤酒花萃取液为暗绿色膏状（即啤酒花浸膏），含有许多不纯物质，而且还残留有机溶剂。液体CO2和SC-CO2抽提的酒花萃取物颜色为微榄绿，在2025MPa，40萃取4h，浸膏得率可14，硬树脂萃取率仅为5.2%，而且不萃取农药，芳香成分不氧化。,例3. 其他从工业性应用的萃取分离角度，SC-CO2萃取技术在医药、食品、化妆品等工业领域中有较宽的应用面。医药工业 酶、维生素等的精制回收动植物中药效成分的萃取（生物碱、生育酚、EPA、DHA、鸦片、吗啡、精油等）医药品原料的浓缩、精炼、脱溶剂酵母、菌体产物的萃取,食品工业 植物油脂的萃取动物油脂的萃取奶脂中脱除胆固醇等食品脱脂咖啡、红茶脱咖啡因、酒花萃取香辛料萃取植物色素的萃取共沸混合物分离，含醇饮料的软化脱色、脱臭，烟草脱尼古丁,化妆品及香料工业天然香料萃取，合成香料的分离和精制化妆品原料萃取，精制（界面活性剂、脂肪酸脂、甘油单酯等）,1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下相含有大部分琼脂(或可溶性淀粉)。再如下图中，2.2的葡聚糖水溶液与等体积的0.72甲基纤维素钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。,葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系,五、 双水相萃取,有机溶剂萃取的不足：许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂 ；蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。,亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水分都占大比例（8595），蛋白质在两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。,双水相萃取的优点,使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成；,适合热敏物质的提取，主要是胞内酶；,（一）、双水相体系的组成,双聚物：,聚合物-低相对分子质量的化合物：,PEG/DEX、聚乙二醇/ 聚乙烯醇、聚乙烯醇/甲基纤维素、聚丙二醇/葡聚糖、聚丙二醇/甲氧基乙二醇等,PEG/磷酸钾、 PEG/磷酸胺、PEG/硫酸钠、 PEG/葡萄糖等、,（二）、双水相体系形成的原因,双水相体系的成因是聚合物之间的不相溶性，即聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，从而分为两相。一般认为，只要两种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合时就可发生相分离，并且水溶性差别越大，相分离的倾向越大。,2. 加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也能形成两相。,水溶液中聚合物的疏水性依下列次序递增： 葡萄糖硫酸盐甲基葡萄糖葡萄糖羟丙基葡聚糖甲基纤维素聚乙烯醇聚乙二醇聚丙三醇，这种疏水性的差别对目的产物与相的相互作用是重要的。同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加。,（三）、影响双水相萃取的因素,聚合物及其相对分子量,H会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数；另外，pH还影响系统缓冲物质磷酸盐的离解程度，从而影响分配系数。体系pH与蛋白质等电点相差越大，蛋白质在两相中分配越不均匀。,2. pH的影响,在PEG/Dex中，无机盐离子在两相中也有不同的分配，因此在两相间形成电位差。由于各相要保持电中性，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产生很大的影响。 一些无机离子的分配系数正离子 分配系数K 负离子 分配系数KK 0.824 I 1.42Na 0.889 Br 1.21NH4 0.92 Cl 1.12Li 0.996 F 0.912,3.离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响,由于亲水聚合物的多元醇或多糖结构保护了蛋白质，蛋白质在双水相中的稳定性增加，所以一般都可在室温下操作。而且室温时粘度较冷却时低，有助于相的分离并节约了能源开支。,4. 温度的影响,双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。,1. 双水相萃取法常用于胞内酶提取。,（四）、双水相萃取的应用,在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃取生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应器。,2. 两水相反应器,