组织培养育苗技术课件.ppt

林木组织培养育苗技术,植物组织培养通常是用植物的各种组织，包括有性的和无性的组织碎片及单细胞，在人为控制的环境里，用含有大量元素和微量元素的无机盐、有机生长物质和糖类等的液体或琼胶培养基，加以培养，使其先长出愈伤组织，然后诱导愈伤组织生根、发芽，长成完整的新植株。组织培养的应用1 无性系快速繁殖： 濒危植物，名优特新产品。利用组织培养使其再生小植株，并在试管内大量繁殖，这是目前植物最快速的繁殖方法。 当今，全世界植物组织培养工厂的年产值已达数十亿美元。试管苗的工厂化已成为一种不可忽视的新兴产业。2 种质的保存和基因库的建立3 花药培养和花药单倍体育种4 药用植物的工厂化生产5 突变体的筛选培育,组织培养的优越性 (一)培养条件可以人为控制 植物组织培养中植物材料完全是在人为提供的培养基质及小气气候环境条件下进行生长的，摆脱了大自然中四季、昼夜变化频繁，还刁；时受灾害性气候影响的刁；利因素，并且条件均一，对植物生长有利，便于稳定地生产大量苗木。 (二)生长周期短、繁殖率高 由于植物组织培养可以人为控制培养条件，可根据不同植物不同离体部位的不 同要求而提供不同的培养条件，因此培育幼苗生长快，繁殖率高，能及时提供规格 整齐一致的优质种苗。如一个杨树腋芽，利用组织培养技术一年可生产100万棵苗木。一个苹果树的茎尖，一年内能繁殖出1000亿棵苗木。由于繁殖系数极大，因而 能在短期内生产大量苗木。,组织培养的优越性(三)管理方便，利于自动化控制 植物组织培养是在一定的场所环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，进行高度集约化的高密度科学培养生产，与田间育苗相比省去了中耕、除草、浇水、施肥、防治病虫等一系列繁杂的劳动工序，可以大量节省劳动力及田间育苗所需要的土地，便于进行自动化控制的工厂化大生产。 (四)有利于遗传和育种 利用组织培养技术，能使某株的优良性状及有利变异保存下来，同时，加速了优良品种的推广，缩短了育种周期，便于获得常规育种难以或无法得到的新基因型，创造新的品种或物种。 (五)便于种质的保存和交换 利用组织培养法来建立“种质银行”或“基因库”，保存手续简便，极易长途运输，便于地区间、国际间的种质交流，而且可以节约大量土地、人力和物力。,植物组织培养发展(一） 植物组织培养是在二十世纪发展起来的 1902年，德国植物生理学家Haberlands根据细胞学理论，大胆地提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，并提出了植物细胞全能性的理论，其采用组织培养技术，对单子叶植物叶的栅栏组织、表皮等分离出的细胞进行培养，但未能诱导培养细胞分裂，培养没有成功。,植物组织培养发展（二） 1904年，有人首次进行萝卜胚胎培养获得成功。到了30年代，又有人研究了光、温度、通气， pH、培养基的组成等各种培养条件对生长的影响，并以番茄根、小麦根尖、烟草幼茎等为材料进行组织培养获得成功。1934年还有人进行了山毛柳、黑杨等形成层组织的培养。这些工作确定了组织培养的基本方法。1943年出版了植物组织培养手册一书，使植物组织培养成为先进的植物无性繁殖技术并开始发展为一门新兴的学科。以后，随着科学研究的不断进行，培养材料逐步扩大，培养方法逐步发展，培养基逐步改进，实验手段逐步完备。目前，植物组织培养技术已在农业、林业、园艺等各个领域及生产实践中得到越来越广泛的应用。,植物组织培养发展（三） 我国的组织培养工作的开展也是比较早的。早在本世纪30年代初期，李继侗教授就对银杏的胚进行了组织培养研究，罗宗洛教授研究了离体根尖培养的适宜条件 50后代以来，特别是近十几年来，我国很多科研单位和高等院校都开展了植物组织培养的研究，其中有些科研成果已应用在生产上，收到了良好的经济效益。,？,组织培养的理论基础细胞的全能性 植物的体细胞，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发展成完整植株的潜在能力。细胞分化与脱分化细胞分化指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。脱分化是其相反的过程。指从分化状态形成原初细胞的过程。,生物个体的每个细胞在遗传上是相同的，具有相同的基因组成。个体中不同细胞具有的不同功能是由于细胞各基因活化状态不同。在一个成熟已分化的细胞中，通常仅有5%-10% 的基因处于活化状态而其他基因处于阻碣状态。细胞选择性地活化和阻碣DNA链上不同的基因，导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育方式改变，最终使细胞表现出执行特定的功能。基因活化和阻碣不同表现为合成不同的酶或蛋白质分子，引起生理状态和过程的变化，因此，在形态结构上的分化出现之前往往先出现生理生化上的分化。而活化细胞各基因的过程即脱分化过程。 最基本问题是一个全能细胞是通过什么方式使其大部分遗传信息不再表达即细胞分化通过什么方式分化的， 怎样选择性地活化和阻碣DNA链上不同的基因 怎样激活DNA链上被阻碣的基因,植物细胞发育途径的决定和分化的稳定性 细胞发育途径的决定指胚胎细胞所具有的多种发育潜能，随着发育过程逐渐受到抑制，从而使胚胎细胞发生不可逆的特化现象。细胞一经“决定”，其发育途径即不在改变。如在胚胎发育中，苗端和根端一经确立，他们便以其各自特定的方式不断分裂而衍生出一系列在结构上不同的细胞、组织和器官，执行一定的功能，该现象称为分化的稳定性。植物细胞脱分化 植物细胞分化的稳定性是相对的。 植物组织、细胞不易在细胞分裂中保持其具有的分化状态，而通常是细胞迅速增殖并脱分化，形成愈伤组织，并在不同的条件下表现出不同的形态发生潜力。（与动物不同点） 在植物组织培养中，细胞不易保持其原有的分化状态，而在不同的培养条件下在形态发生方面表现出极大的可塑性。细胞分裂的取向、分裂的速度和细胞生长的方向对分化都有重要影响；,植物组织和细胞培养中植株再生途径器官形成途径 由于在植物组织培养中细胞不易保持其原有的分化状态可通过诱导分化形成根、茎、叶、花等器官或变态器官如吸器、鳞茎、球茎、块茎等。体细胞胚胎发生途径 由于在植物组织培养中细胞不易保持其原有的分化状态可通过诱导分化形成胚状结构（胚状体），随后再生成整体植株。,器官形成途径 （一） 由外植体上原有的器官原基形成 （二） 由外植体形成的器官原基形成 1 分生细胞团形成 （1） 离体的外植体脱分化，形成愈伤组织，在新形 成的愈伤组织或继代培养的愈伤组织中形成分生细胞团， （ 2）外植体的部分细胞在重新分裂后直接形成分生细胞团而不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基 （3）分生细胞团可以继续形成愈伤组织 2 由分生细胞团分化形成不同的器官原基。 3 由器官原基形成器官,体细胞胚胎发生途径 1 诱导愈伤组织的形成 2 筛选具有胚胎发生能力的原始细胞团（PEM ， Proembryogenic masses) 3 诱导形成胚状体。研究表明由原始细胞团形成胚状体的细胞分裂方式与和合子胚形成过程中几乎相同 4 胚状体形成植株,组织培养中的器官形成方式 根芽与茎芽1) 芽产生后，于形成芽的基部张根而形成小植株；2) 一种是先产根，在根上长出芽来；3) 在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后两者结合形成一株植物。离体培养成花三种方式1) 外植体直接分化形成花芽；2) 外植体形成明显的愈伤组织再由愈伤组织直接分化形成花芽；3) 外植体再生营养枝（苗）后，再生枝在试管内再形成花芽；,影响器官和体细胞胚胎形成的因素1 培养基2 培养环境条件3 培养材料的生理状态4 继代培养,培养基* 基本培养基的类型MS培养基， LS培养基， BL培养 基 ，ER培养基， N6培养基，MH培养基* 植物激素在分化中具有明显的调节作用； 生长素： 吲哚乙酸IAA ，萘乙酸NAA，吲哚丁酸 IBA 分裂素：激动素KT ，6-苄基嘌呤BA，异戊基嘌呤2IP， 玉米素 赤霉素GA ， 脱落酸ABA， 乙烯 等* 培养基的物理性质 琼脂培养基和液体培养基 渗透压， PH等,培养环境条件在植物组织培养中，必须控制温度、光照、湿度等各种环境条件。 （1）光照强度、 光周期、光质。（2）温度（3）空气气流流速。 在进行液体培养时，通过振荡的方法进行通气（4）湿润器或干燥器。,培养材料1 取材的器官或组织类型 一般同一种植物的不同器官或组织所形成的愈伤组织在形态和生理上差别不大，但对随后分化成的器官密切相关,下列再生能力具有差异： 1） 不同器官或组织类型 2 ） 同一器官不同部位的相同组织类型 3 ）外植体的大小 组织培养所用外植体的大小，大多由 植物材料的形状所决定，小到数毫克，通常在10-100毫克。2 取材植株的个体发育状况 有两方面的差异：植株的生命周期和年季节变化3 常用的外植体：幼胚、营养芽（顶芽和侧芽）、茎段、叶、幼花芽、花器等,继代培养分化潜力的丧失在继代培养中发生内在的生理生化变化，对细胞分化和器官形成有明显影响。1 新分离的组织具有较强的再生能力，易形成各种器官和胚状体，但在继代培养中能力下降。2 自发生长或驯化：在继代培养中无需再加入生长物质即可维持其生长。3 继代培养中组织和细胞常表现出遗传上的不稳定4 组织培养中保持遗传的稳定性是一个重要的课题,林木组陪苗工厂化集约化生产基本条件1 无菌操作2 中心实验室 3 可控温度、湿度和光照的苗圃过程1 树种选择2 组培成苗3 试管苗的移栽,试管苗的移栽 木本植物的组织培养，从试管苗木移出到盆栽千口大田种植是非常困难的一关，稍不注意就难成活。由于由试管移到盆栽或大田的试管苗，环境发生了很大的变化。为了使苗木适应移栽环境，保证移栽的成活，除要求试管苗具有发育完整、良好的根系外，更重要的是正确地移栽和移栽后的科学管理。 (一)炼苗 (二)苗的取出 (三)移栽 (四)移栽苗的管理,组 织 培 养 技 术一 实验设备及培养条件无菌条件，在严格的无菌条件下培养植物材料。培养条件 在人工控制温度、光照、湿度培养植物材料。 1无菌操作室和预备室 2培养室 3化学实验室： 4细胞学实验室 5摄影室 6灭菌室,培养基的制备 （一）培养基的成分 培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机化合物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。有时还有添加抗生物质及中药等其他物质。（二）培养基的种类 长期以来，根据组织培养的不同目的和选用的不同材料，科学工作者们设计了不同种类的培养基。（三）培养基的制备步骤,培养基的成分（一）-水 1水：培养基大部分是水。配制培养基时，一般用重蒸馏水，即蒸馏水再蒸馏一次，使水中不含或少含某些离子，保证培养基中成分完全人为控制。,培养基的成分（二） -无机盐2无机盐（1）氮：是培养基中大量需要的。大多数培养基既含硝态氮，又含铵态氮。（2）磷：是植物必须的一种元素。它作为能源的ATP合成所不可缺少的，培养基中以PP43的形式添加。（3）钾、钙、镁、硫等元素：这些元素是植物生长所必需的。缺乏这些元素会产生缺素症，影响酶的活性、方向和新陈代谢。（4）微量元素：主要包括铁、锌、铜、锰等。植物对这些元素的需要量甚微，稍多即发生毒害。铁是用量较多的一种微量元素，铁在培养基中常以硫酸亚铁和Na2EDTA（螯合剂）制成螯合物的形式出现。,培养基的成分（三） - 有机化合物（1） 3有机化合物（1）碳水化合物：糖是组织培养中不可缺少的碳源，也是能量物质，而且也有维持一定渗透压（一般在1.54大气压范围之内）的作用。一般以15%的蔗糖最常用，也有用葡萄糖和果糖的。（2）维生素类：维生素是植物组织培养中经常使用的，有维生素C、B1、B6、生物素、烟酸、叶酸等，有的外植体（用于组织培养的植物材料）、愈伤组织会合成维生素，可以不必添加。维生素C有防止组织变褐的作用，维生素B1与愈伤组织的产生和生活力有密切关系，维生素B6对根的生长有促进作用。,培养基的成分（三）- 有机化合物（2）（3）植物生长调节物质：在植物组织培养中，应用较多的有生长素类，如吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4二氯苯氧乙酸（2,4D）等，还有细胞分裂素，如激动素（KIN）、苄基嘌呤（BA）、玉米素（ZT）、2异戊烯腺嘌呤（ZiP）等，此外，还有赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）、乙烯利（CEDP）等。生长素的显著作用是促进试管苗新梢的生长，诱导外植体产生愈伤组织及促进培养组织的延伸生长。细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂和分化，诱导胚状体和不定芽的形成，延迟组织的衰老并增强蛋白质的合成。细胞分裂还能显著地改变其他激素的作用。,培养基的成分（三）- 有机化合物（3）（4）肌醇：使用浓度一般为100mg/l。它对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用，还可增强愈伤组织的生长。（5）氨基酸：在组织培养中，常用的氨基酸有甘氨酸以及酰胺类物质如谷酰胺、天门冬酰胺和多种胺基酸的混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。还有谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、精氨酸以及酪氨酸等。氨基酸对培养体的生长、分化起重要作用，但单独添加时，往往起阻碍作用，只有几种混合时才有好的作用。,培养基的成分（四）-天然复合物和琼脂4天然复合物：在植物组织培养的早期，人们发现天然提取物对愈伤组织的诱导和维持是很有益的。常用的有浓度为1020%的椰乳（即椰子汁，CM）、0.010.05%的酵母提取液（YE），有时也用麦芽汁、番茄汁等来代替。现在发现，天然复合物并不是一切组织培养所必需的，但加入以后，可以起到一定的促进作用。5琼脂；琼脂是常用的凝固剂，加入琼脂后可使液体培养基成为固体培养基。通常的用量为0.51%，加得太多，则培养基过硬，使培养材料不能很好接触，易使材料干燥枯死；用量太少，则培养基太软，使材料在培养基中不稳定，甚至下沉。选用琼脂以色白、洁净的为佳，必要时，可以对琼脂进行预先浸洗，以减少其中的无机盐和可溶性有机物的含量。,（二）培养基的种类长期以来，根据组织培养的不同目的和选用的不同材料，科学工作者们设计了不同种类的培养基。下面介绍几种培养基的应用情况：1MS培养基：林木组织培养中应用最为广泛的MS培养基。2LS培养基：基成分是大量元素、微量元素及铁盐同MS，曾用LS培养基培养杨树，欧洲云杉等。3BL培养基：曾用此培养基培养花旗松。4ER培养基：曾用此培养基培养大叶相思，但多用于豆科作物的培养。5N6培养基：在我国广泛采用N6培养基进行禾谷类作物的花药培养。有些林木组织培养也曾采用此种培养基，如柑桔的花药培养和楸树的组织培养。6MH培养基：该培养基曾用于油棕的胚培养、柚的胚乳培养以及桉属等树木的生根培养。,（三）培养基的制备步骤1 母液的配制和保存11 试剂的称量： 培养基的组成成分应是纯净的化学药品，一般应尽可能采用分析纯药品。为了保证培养基成分能够长期保持不变，一些标准成分应有适当数量的贮备。每次称量药品时，应特别注意防止药匙污脏而引起的药物交叉感染。称量时应特别细小，最好由两人校正，尤其是生长调节物质和微量元素，因其用量甚微，称量要非常精确。稍有差错，会给培养带来严重的影响。,1 母液的配制和保存（二）12 母液的配制和保存：经常使用的培养基，可先将各种药品配成10倍或100倍的母液，贴好标签，放入冰箱保存，用时再按比例稀释。一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素、按基酸等母液，其中维生素和氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。现以MS培养基为例加以说明（见表12）。配制母液一般用重蒸馏水或蒸馏水。13 植物生长调节物质的配制：配制的浓度一般为0.10.5毫克/毫升。吲哚乙酸（IAA）先用少量95%的酒精溶解后加水定容。萘乙酸（NAA）先用95%的少量酒精或热水溶解后加水定容。吲哚丁酸（IBA）用50%的酒精溶解后加水定容。2,4二氯苯氧乙酸（2,4D）用1N（N表示当量浓度）的NaOH溶解后加水定容。激动素（KIN）和苄基嘌呤（BA）先溶于少量1N的盐酸中，再加水定容。玉米素（ZT）先用少量95%的酒精溶解，再加水定容。,2 培养基的制备：2-1 做好各种准备。 第一 将贮藏母液按顺序排好。 第二 准备好所需用的各种玻璃器皿，如量筒、烧杯、 吸管、玻璃棒、漏斗等，放在指定的位置。 第三 称好所需的琼脂、蔗糖，配好所需用的生长调节物质。 第四 准备好重蒸馏水及盖瓶用的棉塞、橡皮筋等。 第五 慢慢熔化琼脂 由于琼脂比较难溶解，所以要及早放在水浴锅上，让其慢慢熔化。,2-2 在琼脂中加入药品 2-2-1 在量筒内放一定量的重蒸馏水，以免加入药液时溅开。再按母液顺序，依母液的浓度量取规定的量加入量筒中。母液加完后， 再在量筒中加入一定量的生长调节物质。加完后可倒入溶化的琼脂中。 注意： 加入母液或生长调节物质时，应事先检查这些药品是否已变色或产生沉淀，已失效的就不要再用。2-2-2 在量筒内再放入蔗糖，定容到所需的体积，倒入溶化的琼脂中。2-3-3 继续加温，不断搅拌，直至使琼脂完全溶解。注意： 琼脂必须要充分熔化，以免造成浓度不匀；培养基培养基太软，无法固定材料。,3 pH值的调整：培养基配好后，再用0.11Nr H-Cl（或NaOH）对培养基的pH值进行调整，一般保持在5.46.0左右为好。可用pH试纸或酸度计进行测试。经高压灭菌后pH值又会下降0.10.3左右。pH值的调整有的在灭菌前进行，也有的在灭菌后进行。4 培养基的分装；配制好的培养基要趁热分装。分装时要掌握好分装量。太多既浪费培养基，又缩小了培养材料的生长空间；太少则又影响生长，一般是占试管、三解瓶等培养容器的1/31/4左右为宜。分装时注意不要把培养基沾到管壁上，以免招致杂菌的危害，分装后立即塞上棉塞或加上盖子。有不同处理的还要及时做好标记。,4 灭菌：培养基的灭菌采用高压气锅进行，在压力达1.1千克/平方厘米左右，保持10-20分钟即可。温度太高，时间太长，培养基会受破坏，激素及糖会分解。在培养基灭菌后取出放在桌子上，使其凝固，以后放到培养室中进行三天预培养，若没有污染反应，即证明是可靠的，可以使用，但配好的培养基也不要放置时间太长，以免干燥变质，一般至多保存2周左右。,三 植物材料（一）材料的采集和保藏 1 采集组织培养的取材要考虑材料的分生和生长能力。一般植物，可取茎尖和根尖的分生组织处，节间和嫩叶基部的分生组织及形成层等部位的幼嫩组织。树木，一般是在春季，取其基部刚萌生的嫩枝、茎尖、腋芽、顶芽及形成层等。由于根尖不易灭菌很少采用。经过多年来的培养实践证明，幼树比成年树易成苗，尤其用种子或离体胚培养成无菌苗，取其子叶、叶、茎、胚轴等作为培养材料，更易分化出苗而获得植株。 2)保藏 随采随用最好，如需远运，要注意保湿、通气和保持适宜的温度，如贮藏，应置于低温冰箱内。,（二）材料的切取植物材料可先切取约3长，把带泥土和杂菌多、易污染的部位削掉，以便进一步冲洗消毒，然后根据组织培养的目的和要求，进一步切取所需的部位。1茎尖的切取：芽先端生长点附近的形态，依植物种类其形态大小各不相同，有的比较大，容易分离；有的则比较小或叶原基着生直到生长点附近或茎随生长点进入先端渐次凹陷，致使生长点被包埋起来，就不容易分离。消毒后的材料，在解剖镜下操作。左手拿解剖针，将材料由茎的切口处刺在上面，保持于空中，在解剖镜下观察，用右手拿解剖刀，将幼叶或叶原基一一切除，使生长点部分露出。为了防止病毒污染，需换用消毒过的工具，按顺序大小切取分离生长点附近组织。还有一个方法以是将材料放在灭过菌的载玻片或滤纸上，两手持解剖针、小刀、镊子等照上述方法除掉叶原基。分离的生长点组织，切口朝下接种在培养基上，分离时注意不要使茎尖受伤，操作要快，组织过小成活率低，生长慢，很难得到植株。,2较大材料的切取；组织培养中较大材料的切取比较简便，用肉眼就可进行。材料消毒后滤纸吸干，在无菌条件下，用解剖刀切取所需大小的叶片、茎等。注意工具用一次要消毒一次，滤纸也要及时更换，防止交叉感染。植物体表面带菌较多，而内部是无菌的。有的材料很大，则可用打孔器从中取一部分就比较安全。3树木形成层的切取：粗的树枝和树干表面进行灭菌是不可能的，可剥去树皮露出内部组织。再用消毒过的小刀削一下，留下一些韧皮部，就达到形成层处了。用尖刀或尖头镊子在上面划12间隔的棋盘格，再用镊子把它一块块取下来，然后把这种带韧皮部和形成层的组织接种在培养基上。4从无菌种子发芽得到的材料：对种子进行消毒处理，播种在消过毒的沙子等基质上，这样从长出的幼苗切取材料被污染的机会少，有利于进行培养。根、子叶、幼芽、上胚轴等部分皆可切取培养。5外植体的大小：组织培养所用外植体的大小，大多由植物材料的形状所决定，小到数毫克，通常在10100毫克,（三）材料的消毒1消毒的目的和作用：植物组织培养用的材料大部分取自田间，有的是地上部，而有的是地下部，埋藏于土中，带有大量的细菌和霉菌，这是无菌组织培养的一大障碍，因为组织培养要求绝对的无菌，否则就无法确立最基本的工作。杂菌的发生与培养用的组织大小、植物种类、分离季节及操作者的技术有关。消毒是为了消灭杂菌，保证无菌组织培养的顺利进行。但不同植物及不同部位的组织有其不同的特点，所以开始都要进行摸索试验，以达到最佳的消毒效果，即消灭培养材料上的病菌，而不损伤或只轻微损伤组织材料，不影响其生长。,2几种常用的消毒剂：消毒剂既要有良好的作用，又要易被蒸馏水冲洗掉或自行分解的物质，而且不会损伤材料，影响生长。常用的消毒剂的使用效果。次氯酸钠能分解产生具有杀菌能力的氯气而挥发掉。过氧化氢也会分解成无害的化合物。硝酸银在加入氯化钠后就成不活泼物质。氯化汞消毒效果很好，只是难以除去。开始消毒时，材料先放入70%酒精中数秒钟，酒精有很好的灭菌作用，又利于材料的湿润，从而易使消毒剂渗入，以杀死病菌。3消毒的方法：消毒前材料先要用自来水冲洗10分钟，有的材料较脏要用洗衣粉等洗涤，把泥土等洗净。有的地下部等组织，带须杈多的还要用小刀削光滑，以利于彻底灭菌。有的材料表面着生较多的茸毛，阻止了消毒剂的沾着，影响消毒效果，则可采用湿润剂，如加入洗衣粉等，这样可大大提高消毒刘的消毒效果，植物不同器官的消毒顺序。,四 、接种材料的接种必须在无菌条件下进行。经过切取消毒的材料，用消过毒的器械放置在消过毒的制备好的培养基上。接种材料于培养基上不能过分密集，以免杂菌感染时互相影响。,五、培养 接种好的材料通常放置于温度262的恒温培养室中培养。对木本植物来说，接种1015天左右可形成肉眼可见的愈伤组织，之后转入分化培养基。分化芽和根所需的时间，各树种有差异，一般需半个月到一个月，基至更长时间。 在培养过程中，如发现培养基不适宜于愈伤组织的生长和分化，则把愈伤组织切成小块，转到新鲜的培养基中，或放到各种不同成分、不同浓度激素组合培养基上筛选试验。一般需要2030天转移培养一次。 愈伤组织如先分化芽，则容易诱导根而形成完整植株；如先诱导出根，则很难诱导出芽。但在有的树种中（如杨树），也可先诱导出根，然后根出芽形成苗木。 一般树木接种长出愈伤组织后，先转接到发芽培养基上，诱导出无根苗，当无根试管苗木长到35时，就可在无菌条件下，从苗的基部切下，进行芽体转移，转接到发根培养基上诱导根的发生，一般需加强光照（15002000勒克斯）或放于自然光下，经3周左右可以长出根而逐步形成完整的根系。,