组织培养的知识基础课件.ppt

第二章 组织培养技术的知识基础,一、组织培养的概念及评价,1.概念：Tissue culture P5 广义：器官培养：器官原基或部分器官在离体条件下，使之生 存生长保持一定功能的方法。组织培养：取自生物体的组织块，切碎后离体培养。细胞培养：用一定方法，使组织解离成分散游离的细 胞，离体培养。 狭义：即指细胞培养，指人工模拟体内环境，使离体细胞生存，增殖，并维持一定的结构和功能的方法。,2、对组织培养技术的评价在生命科学中广泛应用，经久不衰从德国人Roux(1885)至今已有一百多年的历史在生命科学各领域是一项最基础的实验技术，已经形成自己的理论体系。应用范围： 生物基础：细胞代谢与生理机能，细胞增殖， 细胞遗传，细胞凋亡，细胞信号传导。 医学基础：生理、药理、病理、免疫、肿瘤、 血液学、遗传病。 应用研究：育种，药物研发，生物制品，细胞 工程，基因工程等。,组织培养技术的优点可长期提供生活细胞材料实验观察，甚至生物母体已经死亡之后（细胞冻存）可供培养的细胞种类十分广泛，所有细胞生物的体细胞，从胚细胞-成体细胞（正常与疾病）便于配合使用各种实验技术，如：各种光镜、电镜、组织化学、同位素标记。各种物、化、生物因子作用等。增殖迅速，可人为杂交，甚至远缘杂交。可同时提供大量生物性状相似的研究对象，离体细胞某些遗传性状保持相对稳定，仍保持完整的基因组。,组织培养的局限性细胞离体培养，模拟体内环境的局限性（神经体液调节、免疫调节、细胞间的互作）。离体细胞发生变异不可避免，其生命活动规律不能与体内细胞等同，所以实验结果不可等同于体内实验。细胞实验模型不能取代动物模型和临床实验。,二、离体培养细胞的生物学特点,（一）、离体细胞的差异和分化1.差异：离体培养细胞细胞在体内时的分化特征减弱，形态、机能趋单一化，如腺细胞分泌功能丧失；肾、肌、血管细胞均成纤维细胞化。需进入持续增殖状态才能长期生存，所以衰退死亡加速。某些细胞可能转化成不死细胞系，在适宜条件下获永生性。,2.分化：呈去分化趋势，表现为原体内细胞的特化功能丧失，形态归一，胚样细胞转化。（分化特征的暂时性丧失和永久性丧失）有潜在的诱导新的分化方向的能力 条件 如：白细胞 转化成可合成Hb的细胞 微生素A酸某白血病细胞株 向正常白细胞状态转化据此可进行细胞分化的条件和控制机制的研究,仍保留体内细胞在寿命上的分化状态胚细胞 可传代50代以上（300cycles）成人细胞 可传代30代以上（150cycles）老年人细胞 相应缩短病危人细胞 ？某些细胞离体条件下可获永生性,（二）、离体培养细胞的形态学分类 离体培养细胞的分类不同于体内，首先据其在培养器中的生长特征分成两大类：P71.悬浮型细胞：离体培养时，细胞不贴附于支持物上生长增殖，而是悬浮于培养液中，呈球形2.贴附型细胞：细胞离体培养时，依赖于贴附培养器底壁才能增殖，依据形态特征又可分为：,1）成纤维型：细胞贴壁后与体内成纤维细胞形态相似的一类细胞。 形态:呈棱形或不规则三角形，细胞间隔不定，细胞质外伸突起，细胞核卵圆形，细胞增殖达一定密度后呈火焰状单层生长 起源：由中胚层分化起源的组织细胞，体内时形态各异，离体后形态归一。如：心肌细胞，平滑肌细胞，成骨细胞，血管细胞，肾细胞，输尿管细胞，生殖系细胞等,2）上皮型细胞 P7 图2-1 形态：贴壁后，细胞呈扁平，不规则多角形，圆形细胞核居中，细胞间排列紧密，间隔均匀。 起源：由内外胚层分化的组织细胞。如：消化道上皮细胞，肝、胰腺、肺气管上皮细胞、尿道和膀胱上皮细胞等。,肺泡型上皮细胞,3）游走型细胞：散在生长，活跃游动，变形。贴壁后不成片，在一定条件下，可类似成纤维细胞形，也可呈多角形，类上皮型细胞。4）多形型细胞：指某些无规律性的形态特征的细胞。如：神经组织细胞。,游走型细胞 多形型细胞,（三）不同生长状态培养细胞的形态学鉴定 健康生长 生长不良 恶性转化光镜下：伸展好 折光性弱 细胞皱缩折光性强 伸展差 折光性强 均质透明 细胞轮廓明显 核膜核仁轮廓明显 结构轮廓不明显 细胞质中有空泡 核糖体颗粒丰富 核质比例小 颗粒 核质比例增大 核仁小而少 2n体 核仁增多 单层生长 细胞可重叠生长 2n体 异倍体常见电镜下：细胞表面微绒毛少 微绒毛增多 细胞质中微管微丝规则 微管微丝紊乱,（四）离体细胞的生长增殖规律 细胞离体培养时，表现出不同于体内的生长、增殖规律1.离体培养细胞的生命期特点 p9离体细胞的生命期:指从组织取材，细胞接种培养，经原代培养期、传代期，持续生长增殖，直至细胞增殖停滞、死亡经历的时间。大多2n体离体细胞可传代30-50代。细胞传代：细胞在培养液中增殖达一定密度后，需进行分瓶再接种，更换培养液，再培养。这一过程叫细胞传代。细胞周期：概念同体内细胞，传一代一般增殖3-6个细胞周期。,离体培养细胞的生命周期曲线（见P9图2-2） （图略）原代培养期：从体内组织取材，细胞接种，到第一次传代止。 历时：1-4周（不同类型细胞，不一） 特点：细胞异质性强，活跃迁移，细胞暂时不分 裂，贴壁后才开始分裂，与体内组织相似性 大，适于药物研究。,传代培养期:原代细胞一经传代则进入持续增殖，定期传代过程，直至增殖缓慢以致完全停止。 历时：2n体细胞一般可传30-50代，一般每周传 1-2代。 特点：细胞增殖旺盛，需及时传代。建立细胞系 一 般在10代内冻存，持续传代可能发变 异，有的可产生永生细胞系。衰退期： 从细胞增殖缓慢 停止 死亡 特点：细胞仍然生存，但在换液后，优越环境下 也不再增殖，细胞死亡。,2.传代期细胞的一代生长过程（见P10图2-3）1）潜伏期：概念：细胞接种后，先呈悬浮状态游离于培养液中 细胞贴壁过程 细胞贴壁后，有一个暂不增殖的潜伏阶段。细胞贴壁过程：促贴附物质被吸附于支持物表面 c膜表面阴电荷与支持物表面阳电荷互作 c膜蛋白参与贴附过程 ，c牢固贴壁。影响贴壁的因素：支持物表面质量和清洁度 促贴壁物质，纤维连接素 c膜表面蛋白特性,2）指数增殖期：是一代细胞增殖旺盛阶段直至细胞培养器生长面被细胞铺满一层。细胞增殖率：指某一刻，增殖细胞占c总数的比例细胞增殖率的极限点和细胞数增大极限点指数增长期：一代细胞活力最佳期，是用于各种实验的最佳期。3）平顶期：又称停滞期，细胞培养的生长面达饱和密度，产生接触抑制作用，增殖近停止，或可认为增殖细胞数与死亡细胞数达成平衡。 特点：细胞增殖停止，代谢继续，营养枯竭，产 物堆积，PH下降，如不及时传代，则细胞 产生毒化效应而死亡。,3.细胞周期和细胞增殖动力学1）50年代以来传统的细胞周期概念2）新细胞增殖动力学理论 （板图示之略）体内外细胞都存在的两种基本状态：增殖态 功能态增殖态细胞进行：细胞质复制、细胞核复制、细胞分裂三个连续过程，完成一次称1个细胞周期。G1 S G2 M共同构成细胞增殖期，不可分割。,功能态细胞：指细胞完成某次分裂后，进行特定功能活动（如分泌、搜索、吞噬），是细胞一种分化态。命名为G0期细胞。新理论认为其不属于G1期，G0期处于两个增殖期中间，是真正意义的间期。存在三种不同属性的G0期细胞： G0i(G0 of interphase):是以增殖为主的细胞频繁分裂， G0期甚短，体内的某些干细胞，肿瘤细胞，离体培养细胞属于此种。 G0f1(G0 of function 1)是以功能活性为主的细胞， G0期细胞进行分化后的功能活动，但一定条件下，可重返增殖状态。如体内腺细胞，肝细胞。,G0f2(G0 of function 2)：是终末分化细胞，长期处于G0期，始终完成分化功能。如：神经细胞、骨骼肌细胞等。在体外难培养成功。细胞脱离了增殖态，经功能态，再一次进入增殖态后称为一个细胞增殖周期，这不同于传统的细胞周期概念离体培养细胞，必须进入持续增殖状态才能生存，G0i时间很短，但营养不良，生长因子缺乏，可停留于G0i状态，如及时补加营养因子，可进入增殖状态，否则细胞会因长期滞留在G0i态而死亡。,三、离体培养细胞的生存条件 p11,（一）无污染环境无毒害物：化学毒物、强酸碱等。 措施：浸泡、刷洗、浸酸、水洗、晾干。无微生物污染：细菌、支原体、病毒。 措施：物理灭菌：紫外照射 干热灭菌 （范围见p28表2-6） 高压灭菌 抽滤灭菌 化学灭菌： 来苏尔、新洁尔灭等 操作防菌：无菌间、无菌服、超净工作台 抗生素： 加入培养液 抑菌生长,（二）、温度：人和哺乳类细胞最适温度：36.5 0.5 偏高温度：37-39 ， 代谢强度过大呈正比 39-40 ，1h 细胞受损 但仍可恢复 41-42 ， 1h细胞严重损伤 少量可复活 43 以上，1h细胞全部死亡偏低温度：35-25 ， 细胞仍可生存，生长不良 4 左右 ，几小时，回到37 仍可继续生长 0 以下，细胞死亡加保护剂，-196 液氮中，可长期冻存，复苏后细胞有较高成活率。,（三）气体环境和PH值最适PH值：7.2-7.4（ 培养液中含指示剂） PH7.2 橙红色 变碱 紫色 变酸 黄色 需主要气体：氧气：细胞缺氧，不能生存， 封闭培养瓶培养（短期原代培养） 开放培养器皿持续传代培养（CO2培养箱）CO2： CO2培养箱可保持细胞培养环境CO2分压恒 定，PH相对稳定。,（四）基本营养需求 1.碳水化合物 2.氨基酸类 3.维生素类 4.激素类 5.微量元素 6.促细胞生长因子 天然培养基：血清、血浆、胎汁等 人工合成培养基：+血清 （P16血清的作用）,（五）针对不同细胞培养物，培养条件的多样性1.培养条件因培养对象不同而异 培养基：广普培养基和特殊针对性培养基。P17-18 血清：小牛血清、胎牛血清、无血清培养基+ 纯化促细胞生长因子 各种特殊添加剂：针对不同培养物和不同实验目的 如：外周血淋巴细胞：多种广谱性培地均可（1640） +小牛血清（20%） +植物血凝素（PHA）,2.细胞贴附底物需求的差异1）一般贴壁细胞培养：高质量瓶壁支持面+促 细胞贴附物质（血清）2）表皮细胞培养：在瓶壁支持面上涂胶原蛋白3）肿瘤细胞克隆培养： 饲细胞层培养技术：是用一层经射线照射的培养细胞层，作为克隆细胞培养的附着底物，这种细胞层失去分裂增殖能力，但仍然生存代谢，起到同化培养液的作用，称为饲细胞层。,3.细胞培养技术方法的多样性1）消化方法： 胶原纤维多的组织，癌组织-用胶原蛋白酶消化上皮组织，间质少的组织-用胰蛋白酶消化不同组织细胞对酶的浓度和作用时间要求不同2）细胞传代间隔时间：与培养细胞的特性和接种密 度、血清质量均有关。3）细胞冻存方法：原代培养细胞：用DMSO 一般传代细胞：用甘油,四、建立细胞系,（一）细胞培养物的分类1.原代培养细胞2.细胞系（cell line）：经传代培养的细胞群 已鉴定的细胞系：经培养获得的，形态相对均一，生长增殖稳定，生物性状清楚的细胞系。经有关专家鉴定，可纳入有关细胞库，贮存。供研究使用，可作为商品选用。 有限细胞系 无限细胞系：一般转化细胞系 恶性转化细胞系：在一定条件下可以 无限传代，且具有肿瘤细胞的特性。,3.克隆细胞株（cloned cell strain）:用单细胞培养法增殖获得的性状完全一致的细胞群。4.突变细胞系:以突变供体取材培养的细胞系或由人工诱导分离筛选获得的具有某一共同突变类型的细胞系。营养缺陷细胞系是突变细胞系的一类。5.肿瘤细胞系：由供体肿瘤组织建立的细胞系，具恶性细胞转化的特征。,（二）建立细胞系的技术要求1.组织来源：供体种属，性别，年龄 取材部位，时间，已传代数 病灶组织，临床诊断，病例检索2.细胞生物学检测项目 正常细胞系：细胞的一般形态，特异结构，特定分化特性，细胞生长曲线，分裂指数。肿瘤细胞系：除上述项目外，需证明具肿瘤细胞的恶性转化特征。 接触抑制消失，重叠生长软琼脂培养仍可增殖异体动物接种具致瘤性用正常组织培养具浸润性。,3.培养条件方法记录 最适培养基，血清种类用量，特殊添加剂需求，最适PH值，温度，消化液，冻存剂，接种量，传代间隔，培养简历等。,五、组织培养技术的实验室建设,（一）细胞培养实验室设计格局（图2-5 P21略） 分区：无菌操作区 清洗、消毒工作区 实验材料物品储备区 观察、研究工作区（二）基本仪器设备要求和注意事项 超净工作台、电热恒温箱、电热干燥箱、冰箱、显微镜、蒸馏水发生器、抽滤装置、洗刷装置、细胞冷冻器、离心机、高压灭菌器、精密PH试纸和酸度计、可调式加样器等。,（三）细胞培养的技术准备工作1.各种常规仪器设备的调试和使用技术（p21-25)2.各种细胞培养用器皿、器械的筹备和刷洗、灭菌处理(P25-31)3.各种细胞培养用液的配制、处理技术(P31-37)4.细胞培养物的显微镜观察和拍照技术p68-755.细胞培养具体技术流程设计和操作技术p37-56 （作业）,细胞培养常用仪器的使用注意事项1)超净工作台:环境净化处理;禁放物品于工作台滤口；定期检查2）电热恒温箱：设定温度和气体分压，不要乱调动；co2气瓶阀的常检查小心使用；培养后开门排净箱内水汽，擦净箱内壁。3）电热烘干箱：鼓风与加热同时启动，达100后再停鼓风；金属、塑料、橡胶品、不可高热烘干；降温冷至50 以下后再开箱门。4）冰箱：安置在通风干燥远离加热之处，不可贮存有毒挥发物品；定期除霜处理，贮品加强管理，有序淘汰。,5）显微镜：标本有挥发性液体或未干不得置于 镜下；观察后及时认真擦镜；规范操作6）蒸馏水发生器：运行时有专人看护，保证冷 却水循环和避免加热水烧干；冷却后方可再 加蒸馏水，以免炸裂蒸馏管；定期除水垢。10）离心机：平稳安置；认真配平；由低到高启 速，静止后再开盖。11)加样器：使用时避免摔震，加样器调试不可超出刻度范围，不可倒置呛水。,13）高压消毒器: 被消毒物品不可挤压过满，朔料制品不可放入，液体应扎紧瓶口插针排气。 消毒不同物品设不同压力，温度，时间（P29表2-7）。启动时打开排气阀3min排气，然后关闭。 达设定压力后，仪器自动断电排气，压力复原后再开盖门取物品，烘干保存,*细胞培养常用器皿的清洁,玻璃器皿的清洁：一般操作程序如下：1.浸泡：清水中软化和溶解附着物，用过的器 皿应及时浸泡。2.刷洗：洗涤剂刷洗，去除易溶物，不留死角。3.浸酸：刷洗后的器皿浸没于特制的清洁液中不少于6h，去除有机难溶污垢。清洁液配方见表2-5.配制时注意方法和安全。4.冲洗：每件器皿反复冲洗自来水15次，蒸馏水3次。烘干后包装备用（p28)。 *其他器皿的清洗方法略不同，见p27-28.,细胞培养常用器皿的消毒,在细胞培养条件下，细菌的生长优势远大于真核细胞，消毒防菌是培养成功的关键。见表2-6常用消毒方法及选择p28细胞培养液的过滤灭菌方法见p30,p33抗菌素液的配制及用量。p37,