第二章紫外可见分光光度法课件.ppt
紫外-可见分光光度法,第二章,“十一五”国家规划教材,学习目标,1. 掌握紫外-可见可见分光光度法的原理；,2. 熟悉紫外-可见可见分光光度计的结构及各部分作用，了解不同类型分光光度计的结构；,3. 了解紫外-可见分光光度法实验条件的选择；,4. 掌握紫外-可见分光光度计的定性定量方法。,补充内容 - 光的性质,那么光的本质是什么？ 光具有波动性，用波长()和频率()表示；光具有粒子性，用能量(E)表示不同波长的光具有不同的能量。,互补色光示意图,为什么我们看到的物质具有不同的颜色？这是因为物质选择性吸收了某种颜色的光，而呈显出被吸收光的互补光的颜色。,如: CuSO4溶液选择性地吸收白光中间的黄色光，故CuSO4溶液呈蓝色。 Fe(SCN)63-呈血红色，说明其溶液选择性地吸收白光中的青色光。 如果溶液不吸收白色光，则溶液表现为无色透明；如溶液对所有颜色的光全部吸收，则溶液呈黑色。,物质对光的选择性吸收,3、互补色光：若两种光按适当的强度比 例混合而成白光，则这两种光称为互 补色光,1、单色光：同一波长的光,2、复合光：不同波长组成的光,引言：什么是紫外-可见分光光度法？,是根据溶液中物质分子或离子对波长为200-760nm这一范围的电磁波（紫外和可见光谱）的吸收特特点建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。,主要内容,2.1 基本原理2.2 紫外-可见分光光度计2.3 分析条件的选择2.1 紫外-可见分光光度法的应用,4.1 基本原理,基本原理,透光率和吸光度,Lambert-Beer定律,吸光系数,吸收光谱,光的吸收定律,偏离朗伯-比尔定律的因素,百分吸光系数,摩尔吸光系数,当一束单色光通过均匀的溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，还有一部分被器皿表面反射。设入射光强度为I0,吸收光强度为Ia，透射光强度为It，则：,一、透光率和吸光度,1. 透光率,透射光(It)占入射光（I0）的比例的大小称为透光率，用T表示：,透光率越大，溶液对光的吸收越少；反之，透光率越小，溶液对光的吸收越多。,吸光度A,透光率的负对数称为吸光度，用A表示。A越大，表示物质的吸光能力越强。,表示物质对光的吸收程度。,吸光度A公式：,二、朗伯-比尔定律 分光光度法定量的依据,（一） 光的吸收定律 当一束平行的单色光通过某一均匀、无散射的含有吸光物质的溶液时，在入射光的波长、强度以及溶液的温度等因素保持不变的情况下，该溶液的吸光度A与溶液的浓度C及溶液的厚度b的乘积成正比关系，称为朗伯-比尔定律：,A b c,适用条件：仅适用于单色光,稀溶液,吸光度的加合性,溶液中含有多种吸光物质时，若吸光物质之间没有相互作用，则溶液吸光度等于各吸光物质的吸光度之和。,二、Lambert-Beer定律,（二） 偏离朗伯-比尔定律的因素 根据朗伯比尔定律 A=kbc ，如固定液层厚度b,以吸光度对浓度作图时，应得到一条通过原点的直线。,A,c,0,正偏离,负偏离,但在实际工作中，吸光度与浓度之间的线性关系常常发生偏离,（二）偏离Lambert-Beer定律的原因,1. 非单色光的影响 在紫外-可见分光光度计中，由于仪器性能的限制，得不到单纯的单色光。2. 非均相体系的影响 当样品溶液中含有颗粒等悬浮杂质时，样品为不均匀的体系，光线会出现散射。3. 非平行入射光引起的偏离,4. 溶液本身发生化学变化的影响 溶液中待测组分发生了解离、缔合等作用，造成物质光化学性质改变，偏离了偏离朗伯-比尔定律。例如，铬酸盐在溶液中有如下平衡： 呈橙色，而 CrO42- 呈黄色，二者对不同波长 的光线的吸收性能完全不同。,（二）偏离Lambert-Beer定律的原因,Cr2O72-,离解、缔合、异构等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H+2CrO42-,橙色 黄色,lnm=350nm,lnm=375nm,5. 浓度的限制 朗伯-比尔定律假定物质分子之间不发生相互作用，因此只有稀溶液时才基本符合。 浓度较高时，物质分子间会互相影响对方的电荷分布，吸光性能发生改变，必然导致偏离。朗伯-比尔定律,（二）偏离Lambert-Beer定律的原因,三 吸光系数,吸光系数K物理意义：液层厚度为1cm的单位浓度溶液的吸光度，它表示物质对特定波长光的吸收能力。一个物质在一定条件下的吸光系数为定值。通常有两种表示方法：,吸光系数,百分吸光系数,摩尔吸光系数,K值的大小取决于吸光物质的性质、入射光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓度大小和液层厚度无关。但K值大小因溶液浓度所采用的单位的不同而异。,摩尔吸光系数,当溶液的浓度以物质的量浓度（molL-1）表示，液层厚度以厘米（cm）表示时，相应的比例常数K称为摩尔吸光系数。以表示，其单位为Lmol-1cm-1。这样，比尔定律可以改写成 A=bc 物理意义：将样品浓度为1molL-1的溶液置于1cm样品池中在一定波长下测得的吸光度值。,摩尔吸光系数是吸光物质的重要参数之一，它表示物质对某一特定波长光的吸收能力。愈大，表示该物质对某波长光的吸收能力愈强，测定的灵敏度也就愈高。因此，测定时，为了提高分析的灵敏度，通常选择摩尔吸光系数大的有色化合物进行测定，选择具有最大值的波长作入射光。,（2）百分吸光系数,一定波长下，吸光物质的溶液浓度为1g/100ml(1%)，液层厚度为1cm时， 溶液的吸光度。设吸光物质的摩尔质量为 M g/mol ，则： 1mol/LM g/1000mlM/101g/100ml ,例：将 1.00mg 维生素 B12（摩尔质量 为 1355）溶于 25.00ml 蒸馏水中，用 1.0cm 比色杯，在 361nm 波长下，测 得吸光度为 0.400，计算百分吸光系数。,三 吸光系数,例：用氯霉素（分子量为323.15）纯品配制100mL含2.00mg的溶液，使用1.00cm的吸收池，在波长为278nm处测得其透射率为24.3%，试计算氯霉素278nm波长处的摩尔吸光系数和百分吸光系数。 解：已知： M=323.15g/mol c=2.0010-3% T=24.3%,例：已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇作溶剂配制成浓度为0.150mmolL1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数解：由Lambert-Beer定律可得 已知c=0.15010-3molL1， b=2.00cm，T=0.398代入,吸收光谱曲线又称吸收曲线或吸收光谱，即逐渐改变通过某一溶液的入射光的波长，并记下该溶液对每一种波长光的吸收程度（即吸光度A），然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，所得曲线即称为该溶液的吸收光谱曲线。,四 吸收光谱,四 吸收光谱,由高锰酸钾溶液吸收光谱曲线，我们可得到如下信息： 高锰酸钾溶液对不同波长的光的吸收程度是不同的，对波长为525nm的绿色光吸收最多，在吸收曲线上有一高峰（称为吸收峰），而对红色光和紫色光吸收很少，几乎能完全透过，因此KMnO4溶液呈紫红色。光吸收程度最大处的波长称为最大吸收波长（常以max表示）。在进行光度测定时，通常都是选取在max的波长处来测量，因为这时可得到最大的测得灵敏度。,不同浓度的高锰酸钾溶液，其吸收曲线的形状相似，最大吸收波长也一样，不过峰高不相同。不同物质的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同。因此，可利用吸收曲线来作为物质定性分析的依据。 不同浓度的同一种物质的溶液，若在相同的波长处测量，其所测得的吸光度随浓度的增加而增大，吸收峰也随之增高。这便是物质定量分析的理论依据。,吸光度与被测物质浓度的关系符合朗伯-比尔定律，那么如何测量吸光物质的吸光度？应该使用紫外-可见分光光度计来进行测量，其基本结构有五部分组成： 分别为：光源 单色器 吸收池 接受器 显示系统,第二节 紫外-可见分光光度计,常用光源,光源：提供入射光,单色器作用:产生单色光常用的单色器：棱镜和光栅,样品池（吸收池、比色皿） 厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5cm 材质：玻璃比色皿可见光区 石英比色皿可见、紫外光区,检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器： 光电管 光电倍增管 光二极管阵列,检流计、微安表，电位计、数字电压表、记录仪、示波器及计算机等进行仪器自动控制和结果处理。,结果显示记录系统,第三节 分析条件的选择,1、显色反应及其条件2、测定波长的选择3、吸光度范围的选择4、参比溶液的选择,微量Fe3+、Cu2+的溶液，如何用可见分光光度法进行测量？通过显色反应，使无色或浅色的溶液转化成有色的溶液，借此进行测量。,1、显色反应及其条件,可见光区的吸光光度法只能用于测定有色 溶液。对无色溶液和颜色较浅的溶液进行测定时，必须将被测组分转变成有色化合物(显色反应)。能与被测组分反应使之生成有色化合物的试剂称为显色剂。,显色剂必须满足下述条件： （1）灵敏度要高：要求选择的显色剂能与待测组分生 成摩尔吸收系数较大的有色化合物。（2）选择性要好。（3）有色化合物稳定性好 。（4）反应定量完成，否则再现性就较差。（5）有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要足 够大，一般要求相差 60 nm 以上。,显色条件的选择,1. 显色剂的用量 2. 溶液的酸度 3. 显色温度 4. 显色时间,1）显色剂的用量,吸光度A与显色剂用量cR的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。,2）溶液酸度,在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。,3) 显色温度及显色时间,(CM、 CR 、 pH一定)作 A T 曲线，寻找适宜反应温度。,反应时间的选择:作 A t 曲线，寻找适宜反应时间。,显色反应的干扰及消除,二、测定波长的选择,选择原则：“吸收最大，干扰最小”,灵敏度,选择最大吸收波长（max ）作为入射波长。 若干扰物质在max处也有强烈吸收时，可选用非最大吸收处的波长，但应尽可能选择A 随波长改变而变化不大的区域内的波长。,选择性,3、吸光度范围的选择,控制浓度 吸光度A：0.20.8,4. 参比液的选择,原则：,扣除比色皿、样品基体（非待测组分）和显色剂的吸收,以显色反应为例进行讨论,M + R = M-R,max,试样 显色剂 溶剂 吸光物质 参比液组成,无吸收,无吸收,光学透明,溶剂,基体吸收,无吸收,吸收,不加显色剂的试液,无吸收,吸收,吸收,显色剂+溶剂,基体吸收,吸收,吸收,吸收,显色剂 + 试液 + 待测组分的掩蔽剂,若欲测 M-R 的吸收,max,A （样） = A （待测吸光物质） + A （干扰）+ A （池）,A （参比） = A （干扰）+ A （池）,第四节 紫外-可见分光吸收光谱法的应用,1. 定量分析,定量依据：朗伯-比耳定律， 吸光度 A= b c灵敏度高： max在104105 之间吸光度在0.2-0.8之间，误差较小，测定较准确。,1.标准曲线法,取系列浓度标准溶液，测定吸光度A，作吸光度A对溶液浓度c的图，得过坐标原点的直线。在相同条件下，测量被测溶液的吸光度，在标准曲线上查得溶液浓度。,c = 0.0ug/ml 110-4 210-4 310-4 510-4 710-4 X= 410-4 A = 0.0ug/ml 0.00 0.100 0.196 0.290 0.487 0.682,预先配制一个与待测液浓度相接近的标准溶液(其浓度用cs表示)，测得其吸光度为 As，再测定待测液的吸光度Ax，则待测液浓度cs可从下式求得,2、比较法（标准对照法）,二、多组分的测定,对于含有多种被测组分的试液，如果吸光物质之间没有相互作用，且服从 Lambert-Beer定律，此时系统的吸光度等于各组分的吸光度之和。 吸收光谱通常有以下两种情况。 （1）吸收峰互不重叠： （2）吸收峰重叠：,吸收峰不重叠 吸收峰重叠,2.多组分定量方法,1) 解联立方程组,
