第四章 内酰胺类抗生素课件.ppt
第四章 -内酰胺类抗生素,青霉素,2,概述,1,4.1 概述,发展概况,2,临床应用的主要-内酰胺类抗生素及其生物活性,3,-内酰胺类抗生素的特性和作用机制,1,4.1.1 -内酰胺类抗生素的特性和作用机制,1.结构特性,4.1.1 -内酰胺类抗生素的特性和作用机制,青霉素与头孢菌素结构这类抗生素都含有一个四元内酰胺环，并通过氮原子和相邻的碳原子与另一个杂环相稠合，这两个杂环可以是五元环也可以是六元环。它们结构上的共同特点是：与内酰胺环中氮原子相邻的碳原子上有一氨基；与内酰胺环中氮原子相对的碳原子上有一氨基。按一种简化的方法可将未取代的两个稠环系统，分别称为青核(penam)与头核(cepham)，于是青霉素可称为6-酰胺-2-二甲基青核-3-羧酸。头孢菌素可称为3-乙酰氧甲基-7-酰胺头核-4-羧酸。,4.1.1 -内酰胺类抗生素的特性和作用机制,2.物理性质,4.1.1-内酰胺类抗生素的特性和作用机制,4.作用机制-内酰胺类抗生素的作用机制是通过抑制肽聚糖转肽酶及D-丙氨酸羧肽酶的活性抑制肽聚糖合成，从而干扰细胞壁合成。这种干扰是不可逆的，且杀菌浓度和抑菌浓度很接近。由于动物细胞没有细胞壁，更不含肽聚糖结构，因而对动物细胞的合成没有影响。这种优良的选择性毒性，使-内酰胺类抗生素成为一类高效、安全的抗细菌感染药物。,4.1.1 -内酰胺类抗生素的特性和作用机制,3.化学性质-内酰胺类抗生素通常很活泼，它们的化学性质大都和-内酰胺环有关，由于为稠环系统，故环的应力增加，因而反应性能更强。在很多情况下，内酰胺环中羰基的反应性能和羧酸酐相似，很易被亲核试剂和亲电试剂作用，使内酰胺环打开而失去活性。与青霉素相比头孢菌素较不易发生开环反应，故可以把甲醇作为重结晶的溶剂。头孢菌素对酸也较稳定。,4.1.2 发展概况,4.1.2 发展概况,4.1.3 临床应用的主要-内酰胺类抗生素及其生物活性,临床应用的-内酰胺抗生素分为青霉素、头孢菌素和新型-内酰胺三类，它们绝大多数都是由天然-内酰胺抗生素半合成得到的。苄青霉素(青霉素G)和青霉素V(苯氧甲基青霉素)是仅有的直接用于临床的天然-内酰胺抗生素。它们对革兰阳性细菌有很强的抗菌活性，而对革兰阴性细菌无活性，容易受-内酰胺酶作用而失活，因而对耐药菌株无效。通过侧链的化学改造，可获得一系列广谱甚至对绿脓杆菌有效或耐-内酰胺酶的半合成青霉素。目前在临床上应用的主要有氨苄西林(广谱)、替卡西林(抗绿脓杆菌)、甲氧西林(耐青霉素酶)、氯唑西林(耐青霉素酶)等。,4.1.3 临床应用的主要-内酰胺类抗生素及其生物活性,典型的天然头孢菌素为头孢菌素C和7-甲氧头孢菌素C(头霉素C)。它们都具有广谱抗细菌作用，且对青霉素酶稳定；后者还能耐受头孢菌素酶。由于天然物的抗菌活性不高，或抗菌谱不够理想，故临床上应用的都是它们的半合成衍生物，如头孢力行(口服)、头孢克洛(口服)、头孢唑啉(注射)、头孢西丁(注射，耐-内酰胺酶)、头孢他啶(注射，耐-内酰胺酶，抗绿脓杆菌)等。,4.1.3 临床应用的主要-内酰胺类抗生素及其生物活性,许多天然存在的碳青霉烯对革兰阳性和阴性细菌有广谱抗菌活性，并对-内酰胺酶高度稳定。但和其他-内酰胺不同，它们易被哺乳动物肾脏中的二肽酶水解失活。硫霉素是这类抗生素的最优秀代表，它具有极强及极广泛的抗菌活性。它的亚氨基衍生物亚氨青霉烯(imipenem)与二肽酶抑制剂(cilastatin)的复合制剂已广泛用于重症细菌感染的临床治疗中。,4.1.3临床应用的主要-内酰胺类抗生素及其生物活性,克拉维酸是链霉菌的代谢产物，它本身的抗菌活性很弱，但有很强的-内酰胺酶抑制活性，与对-内酰胺酶敏感的-内酰胺抗生素合用有很好的协同作用。克拉维酸与阿莫西林(羟氨苄青霉素)或替卡西林(羧噻吩青霉素)的复合制剂已被广泛用于临床。,4.1.3 临床应用的主要-内酰胺类抗生素及其生物活性,单菌胺(monobactam)是由细菌产生的单环-内酰胺抗生素的总称。所有天然存在的单菌胺都是3-氨基2-氧1-氮杂环丁烷磺酸的N酰基衍生物，一般抗菌活性不强，通过侧链改造可以使活性显著增强。第一个临床应用的单菌胺衍生物是注射用氨曲南(aztreonam)，它对革兰阴性细菌有很强的活性，对-内酰胺酶高度稳定，但对革兰阳性细菌和厌氧菌的活性较弱。单菌胺一般由氨基酸合成得到。,4.2 青霉素,青霉素的理化性质,2,青霉素的发酵生产,3,青霉素的生物合成与理论产量,4,青霉素的提取和精制,5,质量检定,6,天然存在的青霉素,1,4.2.2 青霉素的理化性质,1.稳定性,4.2.1 天然存在的青霉素,青霉素是一族抗生素的总称，当发酵培养基中不加侧链前时，会产生多种N酰基取代的青霉素混合物，它们合称为青霉素族抗生素。,4.2.2 青霉素的理化性质,2.溶解度,4.2.2 青霉素的理化性质,3.降解反应,4.2.2 青霉素的理化性质,青霉噻唑酸或其酯在醇溶液中或有HgCl2存在时，会异构化成为青霉胺缩醛酸()或其相应的酯。,4.2.2 青霉素的理化性质,青霉素的碱性降解产物青霉噻唑酸能和4分子碘起作用。,4.2.2 青霉素的理化性质,青霉烯酸在室温下，在95%乙醇溶液中会转变成青霉酸。,4.2.2 青霉素的理化性质,根据上述反应，显然如果6-酰基位上有吸电子基团则会阻碍降解反应，因而青霉素V和氨苄西林对酸较稳定，宜于口服。,4.2.2 青霉素的理化性质,在激烈的水解条件下，例如在稀酸溶液中，加热至100，则青霉素最终分解为青霉胺(，penicillamine)和青霉醛酸(，penaldic acid)，后者失去CO2变成青霉醛(，penilloaldehyde)。,4.2.2 青霉素的理化性质,青霉素水溶液在贮存过程中会形成青霉烯酸。,4.2.2 青霉素的理化性质,4.2.2 青霉素的理化性质,4.紫外吸收光谱,4.2.2 青霉素的理化性质,5.过敏反应 引起青霉素过敏的物质现在还不十分明了，可能是由于青霉素的降解产物(如青霉烯酸、青霉噻唑酸等)或它们与蛋白质结合的产物(即毒霉噻唑蛋白)，也可能是青霉素分子本身的聚合物。曾用葡萄糖凝胶从青霉素钾盐成品中分离出青霉噻唑蛋白等聚合物。对于青霉素致敏原因目前正大力开展研究，以期采取措施，消除过敏。,4.2.3 青霉素的发酵生产,1.青霉素生产菌种最早发现产生青霉素的原始菌种是Fleming分离的点青霉(Penicillium notatum)。后来找到另一种适合深层培养的产黄青霉菌(P.chrysogenum)MinnR-B(生产能力120U/mL)及NRRL1951(生产能力100U/mL)，后者经X射线、紫外线诱变处理得到生产能力较高的变种，如NRR1951变异系谱的Q-176菌株。目前青霉素生产菌种有形成绿色孢子和黄色孢子两种产黄青霉菌株。,4.2.3 青霉素的发酵生产,2.菌种保存 青霉素生产菌种一般在真空冷冻干燥状态下，保存其分生孢子。也可以用甘油或乳糖溶液作悬浮剂，在-70冰箱或液氮中保存孢子悬浮液或营养菌丝体。对冷冻营养菌丝体进行保存可避免分生孢子传代时可能造成的变异，一般来说，分生孢子传代比菌丝传代更容易发生变异。,4.2.3 青霉素的发酵生产,3.青霉素的发酵生产（1）发酵生产流程,4.2.3 青霉素的发酵生产,在沉没培养条件下，青霉素产生菌在生长发育过程中，其细胞会明显的变化，按其生长特征可以划分为六个生长期：第期分生孢子发芽，孢子先膨胀，再形成小的芽管，原生质未分化，有小空胞；第期菌丝增殖，原生质的嗜碱性很强，在期末有类脂肪小颗粒；第期形成脂肪粒，积累贮藏物，没有空胞，原生质嗜碱性仍强；第期脂肪粒减少，形成中小空胞，原生质嗜碱性减弱；第期形成大的空胞，其中含有一个或数个中性红染色的大颗粒，脂肪粒消失；第期细胞内看不到颗粒，并出现个别自溶的细胞。,4.2.3 青霉素的发酵生产,（2）工艺要点生产孢子的制备：将砂土孢子用甘油、葡萄糖和蛋白胨组成的培养基进行斜面培养后，移到大米或小米固体培养基上，于25培养7天，孢子成熟后进行真空干燥，并以这种形式低温保存备用。,4.2.3 青霉素的发酵生产,生产种子的制备：种子制备时以每吨培养基不少于200亿孢子的接种量，接种到以葡萄糖、乳糖和玉米浆等为培养基的一级种子罐内，于(271)培养40h左右，控制通气量为13m3/(m3min)，搅拌转速为300350r/min。一级种子长好以后，按10%接种量移种到以葡萄糖、玉米浆等为培养基的二级种子罐内，于（251)培养1014h，便可作为发酵罐的种子。培养二级种子时，通风比为（11）（15）m3/(m3min)，搅拌转速为250280r/min。,4.2.3 青霉素的发酵生产,种子质量要求：菌丝稠密，菌丝团很少，菌丝粗壮，有中小空胞，处在第期。在最适生长条件下，到达对数生长期时菌体量的倍增时间约为67h。菌种保存时间过长、上一级种子生长不良、原材料质量发生波动等，都将影响菌体生长速度，使倍增时间延长。在工业生产中，培养条件及原材料质量均应严格控制，以保持种子质量的稳定性。,4.2.3 青霉素的发酵生产,发酵生产,4.2.3 青霉素的发酵生产,（3）影响发酵产率的因素及发酵过程控制 基质浓度的影响 目前，糖浓度的检测尚难在线进行，故葡萄糖的流加不是根据糖浓度控制，而是间接根据pH值、溶氧或CO2释放率予以调节。,4.2.3 青霉素的发酵生产,前体的影响及控制苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作为青霉素G的侧链前体。青霉菌可将前体直接结合到产物分子中，也可作为养料和能源利用，即氧化为二氧化碳和水。,4.2.3 青霉素的发酵生产,H值的影响及控制 青霉素发酵的最适pH值，一般认为是6.56.9，应尽量避免超过7.0，因为青霉素在碱性条件下不稳定，容易加速水解。,4.2.3 青霉素的发酵生产,温度的影响及控制青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差异，对菌丝生长和青霉素合成来说，最适温度是不一样的。一般生长的适宜温度为27，而分泌青霉素的适宜温度是在20左右。生产上采用变温控制法，使之适合不同发酵阶段的需要。康斯坦丁尼德斯(Constantinides)等对青霉素分批发酵进行了研究和计算，并以所得数据进行发酵试验：开始56h维持在272，然后直线下降到187维持到184h，最后24h回复到272培养。采用这种变温培养方法比常温25培养，可增加16%产量。,4.2.3 青霉素的发酵生产,溶氧的在线控制对于青霉素发酵来说，溶氧浓度是影响发酵过程的重要因素。当溶氧浓度降到30%饱和度以下时，青霉素产量急剧下降；低于10%饱和度时，则造成不可逆转的损失。发酵液中溶氧浓度过高，说明菌丝生长不良或加糖率过低，使呼吸强度下降同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递与氧消耗的动态平衡点，而氧消耗与糖消耗成正比，故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的参考指标之一。,4.2.3 青霉素的发酵生产,补料的影响及控制发酵过程中除以中间补糖控制糖浓度及pH值外，补加氮源亦可提高发酵单位。在基础料中加入0.05%尿素，并在补糖时再补加二次尿素，可以扭转发酵液浓度转稀、pH值低和单位增长慢的情况。在发酵过程中与料液一起补入表面活性剂如新洁尔灭5010-6，或聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯和三油酸酯等非离子表面活性剂也能增加青霉素的产量。,4.2.3 青霉素的发酵生产,在青霉素发酵过程中加入少量可溶性高分子化合物如4010-6聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚二乙胺或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)能使青霉素产率增加38%。这些物质能够提高产量的原因是：当发酵罐使用较大的搅拌功率和较快的搅拌速度时，这些高分子化合物能使邻近搅拌液的液体速度梯度降低，避免打断菌丝，而且在促进氧在培养基中充分溶解的同时还有利于除去二氧化碳；菌丝生长时，由于高分子化合物起分散剂的作用，菌丝不致成团，比表面积得以增加，因而增加了氧、基质传递到菌丝体内的总速度。,4.2.3 青霉素的发酵生产,铁离子的影响及控制,4.2.4 青霉素的生物合成与理论产量,1.前体氨基酸的生物合成(1)-氨基己二酸的生物合成-氨基己二酸生物合成的化学计量式：,（I）,4.2.4 青霉素的生物合成与理论产量,（2）缬氨酸的生物合成 由缬氨酸生物合成途径得到其化学计量式为： 葡萄糖+NH3+05ATP缬氨酸+CO2+0.5ADP+0.5Pi ()（3）半胱氨酸的生物合成 由半胱氨酸生物合成途径得出如下化学计量式：,(),4.2.4 青霉素的生物合成与理论产量,2.青霉素的合成,4.2.4 青霉素的生物合成与理论产量,由1mol NADH合成1mol NADPH，要消耗1mol ATP，则式()变为:,(),4.2.4 青霉素的生物合成与理论产量,将式()、()、()、()相加，得青霉素G生物合成的总化学式：,(),4.2.4 青霉素的生物合成与理论产量,3.青霉素的理论生产得率,4.2.4 青霉素的生物合成与理论产量,4.2.5 青霉素的提取和精制,1.发酵液的过滤和预处理 从鼓式过滤机得到的滤液，其pH值在6.27.2之间，略发浑，棕黄色或棕绿色(用三氯醋酸法测定)。蛋白质含量一般在0.52.0mg/mL(个别情况下可达到7.0mg/mL)，这些蛋白质的存在对后续各步提取有很大影响，必须去除。通常用硫酸调pH=4.55.0，加入0.07%(质量体积分数)的溴代十五烷吡啶PPB(配成5%的溶液)，同时再加入硅藻土(0.07%，质量体积分数)作为助滤剂，通过板框过滤机过滤，得二次滤液。二次滤液一般澄清透明，可进行提取。发酵液和滤液应冷至10以下，贮罐、管道和滤布等应定期用蒸汽消毒。,4.2.5 青霉素的提取和精制,2.萃取和精制,4.2.5 青霉素的提取和精制,4.2.5 青霉素的提取和精制,图4-15萃取时醋酸丁酯的相对用量对萃取液选择性的影响 Ac萃取液单位干渣中青霉素含量，U/mL；D萃取液色级；A萃取液中青霉素浓度；D/A10000萃取液浓度缩小10000倍的比消光系数。,4.2.5 青霉素的提取和精制,图4-16色素转移到反萃取液与萃取时pH值的关系1，2，3，4反萃取时pH值分别为60，70，80，85；反萃取时水有机相=13,4.2.5 青霉素的提取和精制,图4-17反萃取时，缓冲液的相对用量对萃取选择性的影响符号同图4-15、图4-16,4.2.5 青霉素的提取和精制,4.2.5 青霉素的提取和精制,3.结晶(1)青霉素钾盐结晶青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小，利用此性质，在二次丁酯萃取液中加入醋酸钾乙醇溶液，青霉素钾盐就结晶析出，反应如下：,4.2.5 青霉素的提取和精制,(2)青霉素普鲁卡因盐结晶普鲁卡因青霉素在水中溶解度很小，因此在青霉素钾盐的水溶液中(pH值中性的磷酸盐缓冲液)加盐酸普鲁卡因溶液，普鲁卡因青霉素就结晶析出。(3)青霉素钠盐结晶青霉素钾盐在使用过程中，病人反映很痛。研究表明，其致痛原因是药品中的钾离子。而青霉素钠盐并不引起疼痛。,
