第四章工业微生物育种诱变剂课件.ppt

第四章 工业微生物育种 诱变剂,第一节、物理诱变剂,包括紫外线、X射线、r射线、快中子、微波、超声波、电磁波、激光射线和宇宙线等。其中对微生物诱变效果较好,应用较广泛的是紫外线、X射线、r射线和快中子。物理辐射可分为电离辐射和非电离辐射。,一、物理诱变剂的生物学效应 1、 物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。,2、辐射引起的生物效应，根据辐射种类和微生物种类不同有所差异。3、同一种辐射线对不同微生物的效应不一样，这与每种微生物修复系统的强弱有关。,二、辐射引起生物效应的影响因素1微生物的遗传背景 ：G+C%2微生物的生理状态3可见光4细胞水分5温度尤其对于电离辐射，较高温度能促进氧与自由基之间的相互作用、加速与DNA发生的化学反应。在氧气充足的条件下要比在缺氧条件下的电离辐射的生物学效应显著。,三、非电离辐射紫外线（一）紫外线的诱变机制和DNA损伤修复 1紫外线的诱变机制 有的是DNA与蛋白质的交联有的是胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用，有的是DNA链的断裂，还有的是形成嘧啶二聚体。形成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因。 2DNA损伤修复光复活 切除修复,（二）紫外线诱变 1紫外线有效光谱 最有效的波长为253.7nm，而15w紫外灯管放射出来的紫外线大约有80波长集中在253.7nm。 2紫外线的辐射剂量 分绝对剂量erg-1/mm2和相对剂量照射时间或者杀菌率表示 。 一般认为杀菌率以90-99.9效果较好。但也有报道，认为较低的杀菌率7080%有利于正突变菌株的产生。,（三）紫外线诱变的步骤与方法：（1）出发菌株 细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子刚成熟。（2）前培养 对细菌类以肉汤为主，适量加人核酸类物质或酵母膏等制成营养丰富的培养基，还可加人抑制修复的物质，如咖啡碱或异烟肼等。,（3）制备菌悬液 单细胞：细菌约108 ml-1；放线菌约107108ml-1，霉菌约106 ml-1。（4）紫外线照射 3-5ml，搅拌；避光，提前20min预热紫外灯。结束时冰浴1-2h。,（5）后培养 冰浴后的菌悬液加人到适合于正突变体增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.52h。有些在增殖培养基中加人适量的酪素水解物、色氨酸或异烟肼等物质，可以抑制修复，有利于突变体繁殖和减少细胞悬液在贮存过程中的死亡。,3电离辐射的照射方法菌悬液较好，不宜过多。照射后冰浴2-3h低温可降低或抑制修复酶的活性。,四、电离辐射1常用于诱发突变：快中子、X射线线和r射线等。2电离辐射剂量拉德（rad）也可以转成伦琴（R）；不同种类菌种最适的剂量范围不同；对不同的射线的敏感度也不同；不宜反复照射。杀菌率90-99.9为宜 。,五、近年的新型诱变剂1微波2红外射线3激光4高能电子流5离子注入,第二节 化学诱变剂,化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，不能直接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防上污染环境，造成公害。,化学诱变剂是一类能对DNA起作用、改变其结构、并能引起遗传变异的化学物质。,一、碱基类似物 用于诱发突变的碱基类似物有5-BU、5-FU、BUdr、5IU等他们是胸腺嘧啶的结构类似物，AP、6-MP是腺嘌呤的结构类似物。最常用是5BU和AP。 当将这类物质加人到培养基中，在繁殖过程中可以掺人到细菌DNA分子中，不影响DNA的复制。它们的诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，因此，也叫掺人诱变剂。显然这一类诱变剂要求微生物细胞必需处在代谢的旺盛期，才能获得最佳的诱变效果。,（一）碱基类似物的诱变机制 正常的碱基存在着同分异构体，互变异构现象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出现，而嘌呤分子中以氨基和亚氨基互为变构的形式出现、一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA碱基中频率更高。,5-BU导致AT碱基对转换为GC碱基 2-氨基嘌呤也可以诱发DNA分子中ATGC或GCAT的转换。,（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）1单独处理 将微生物液体培养到对数期，离心除去培养液，加入生理盐水或缓冲液，饥饿培养8-10h，消耗其体内的贮存物质，将5-BU加入到经饥饿培养的培养液中，处理浓度为25-40ugml，混合均匀取0.1-0.2ml菌悬液加人到琼脂培养基上涂布培养。在适宜温度下，使之在生长过程中诱变处理。培养后挑取单菌落，进行筛选。如果是处理真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度，常处理浓度为0.1mgml。,2与辐射线复合处理 据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理，使它们首先渗人到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变效果会比单独使用射线要好。因此碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂，从而提高突变率。,二、烷化剂（一）烷化剂的作用机制 烷化剂分单功能烷化剂和双功能或多功能烷化剂两大类。前者仅一个烷化基团，对生物毒性小，诱变效应大。后者具有两个或多个烷化基团，毒性大，致死率高，诱变效应较差。主要原因是双功能烷化剂有硫芥、氮芥。,烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变，碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟嘌呤N7是最易起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂起烷化作用；此外，DNA分子中比较多的烷化位点是鸟嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，这些可能都是引起突变的主要位点。其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2，腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占烷化作用的10左右。因此，由这些位点改变所引起的突变仅是少数。 烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂，而造成突变。,（二）烷化剂的性质 溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生分解。它们大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液PH关系很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。配制烷化剂时，要采用合适的缓冲液。 有毒！,（三）常用的烷化剂1、亚硝基胍（NTG） 黄色晶体物质，性质不稳定，容易光解，黄色变为绿色时，诱变效应际低。 有超诱变剂之称，常用缓冲溶液有磷酸缓冲液和Tri缓冲液。,诱变处理方法： 用一定值的磷酸缓冲液或Tri缓冲液洗制成菌悬液。NTG母液：配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许，然后加缓冲液，其比例为缓冲液9ml：NTG丙酮溶液lml，浓度为NTG 1mg/ml；使用时取母液0.2ml +菌悬液1.8ml，NTG终浓度为100ug/ ml。一般随菌种不同而异，细菌一般为100-1000 ug/ ml，放线菌、真菌为l000-3000 ug/ ml。放线菌在生长适宜的温度下培养，（细菌30-35、真菌25-28、放线菌30-32）处理若干时间，一般细菌20-60min,孢子90-120 min终止反应。冷的生理盐水50倍稀释处理，或经过离心洗涤处理，作一定稀释度分离于平皿。如果是细菌，把培养基按一定浓度加入到菌体沉淀物中，振荡培养1.5-2h，经2-3次细胞分裂，再涂平皿。,处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH浸泡处理。 NTG除以上直接以溶液处理外，还可以按以下方法诱变处理，摇瓶振荡处理：在接菌后的培养基中加人5-10 ug/ ml NTG并加几滴吐温60或吐温80，使成乳化状（注意吐温对该菌生长是否有影响）；在平皿上生长过程处理：如果将NTG、琼脂和菌体混合制成平板，NTG浓度为10-50 ug/ ml。或将琼脂培养基制成平板然后将NTG和菌体混合涂抹平板，此时NTG浓度为10-20 ug/ ml。,经后培养的培养液除部分进行平皿分离外。剩余的培养液可以加人适量的药物，保存于冰箱内数天。如日本有人把经过NTG处理后的大肠杆菌培养液，用50甘油（最终浓度为12.5）于-40、-80保存。在以后数天内随时可取出融化，稀释分离，突变体死亡很少。 据报道，无论是用辐射处理，还是用化学诱变剂处理后的菌悬液或培养液，浸在冰浴中2-3h，试验的重复性很好。认为在大肠杆菌、枯草杆菌和放线菌等可以采取这一措施来提高诱变效果。 NTG是一种强烈致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，利用自来水大量冲洗或用1-2N的NaOH浸泡过夜，洗净。,2甲基磺酸乙酯（简称EMS） 甲基磺酸乙酯是磺酸酯类中诱变效果较好的一种烷基化合物，外观呈粉末状或无色液体，难溶于水，不稳定，易水解成无活性物质。 EMS的诱变处理方法：EMS母液的配制：为了安全和防上失效，配制前将需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配制。取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸缓冲液中，加盖，并轻轻转动试管。由于在水溶液中易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。,取新鲜的菌体，经前培养至对数期离心洗涤，用缓冲液制成8 ml菌悬液（107-108ml-1）。对于丝状菌孢子，则前培养至萌动期，悬液含106 ml-1。取EMS母液2ml，加人到以8ml的菌悬液中。在适宜温度下处理一定时间（根据预实验结果确定）。处理的最终浓度为0.lmolL。对于真菌孢子，则为0.2-0.5molL。EMS处理一定时间后，用50倍生理盐水稀释或加入一定量的2%NaS2O3溶液或多次离心、洗涤，以终止反应。EMS是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用10NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。,三、脱氨剂 亚硝酸是一稀常用的诱变剂，毒性小不稳定，易挥发其钠盐易在酸性缓冲液中产生NO和NO2（一）亚硝酸的诱变机制 脱去碱基中的氨基变成酮基，引起转换而发生变异。AH，CU，GX。A：TG：C和G：CA：T。亚硝酸的诱变也可以发坐回复突变。 亚硝酸除了脱氨基作用外，还可引起DNA交联作用，DNA复制，从而导致奕变。,（二）亚硝酸的处理方法1试剂的配制 （1）1molL pH4.5醋酸缓冲液 （2）0.1molL亚硝酸钠溶液 （3）0.07molL pH8.6磷酸氢二钠溶液 以上试剂用前均要灭菌。,2处理方法 取孢子悬液1 ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及硝酸钠溶液lml，最后处理浓度为0.025 molL；25-26保温10-20min，加入的磷酸氢二钠溶液20 ml，使pH下降至pH 6.8左右，以终止反应。稀释分离于平板。 如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05 molL。 在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度，否则会影响诱变效果。,四、移码诱变剂 移码诱变剂与DNA相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。它们主要包括吖啶黄、吖啶橙、ICR171、ICR-191等。移码诱变剂对噬菌体有强烈的诱变作用，诱发细菌、放线菌的质粒脱落比其他诱变剂效果更为显著。如某些产生抗生素的放线菌。用处理后，发现产量明显下降，主要就是由于控制抗生素合成的质粒脱落造成的。,吖啶黄的性质和使用方法： 淡黄色晶体，微溶于热水，溶于乙醇和乙醚，不稳定，见光易分解。 使用时，先用少许乙醇溶解，配成一定浓度的母液。通常处理方法是特将它们加入培养基中，使最后浓度为10-50ug/ml，混合后制成平板，适温培养，在生长过程中处理。另外还可将吖啶黄加人到培养液中，浓度为10-20 ug/ml，在适温条件下，振荡培养过程中处理。,五、羟化剂【以羟胺为例】 羟胺的简称HA，常以盐酸羟胺形式存在，为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性。1.羟胺的诱变机制 当羟胺浓度为0.1-1.0molL pH6.0时，主要与胞嘧啶反应，使羟化的C与A配对，在0.1-1.0molL pH9.0，羟胺可以与鸟嘧啶反应，10-3 molL时，羟胺可以与胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶起反应。但据分析，羟胺与T、G反应的是它的产物，而不是它本身。此外，羟胺有时还能和细胞中其他物质作用产生过氧化物，也具有诱变作用。,2羟胺的处理方法 常用浓度为0.1-5，可直接在溶液中处理，时间1-2h，然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中。然后接入孢子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理所用浓度比直接处理时低些。,六、金属盐类 用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等。其中氯化理比较常用，与其他诱变剂复合处理，效果相当显著。 氯化锂称之为助诱变剂，氯化锂是白色粉末，易溶于水，使用时通常加到培养基中。 为了速免受破坏，倒平板时，当培养基温度冷却到50-60时才加入制成平板，然后把细菌或孢子涂布分离，处理终浓度为0.3-1.5%。,七、其他化学诱变剂1秋水仙素 秋水仙碱是诱发细胞染色休多倍体的诱变剂。秋水仙碱的主要作用是破坏细胞有丝分裂过程中纺锤丝的形成。导致多倍体的产生。,2抗生素 作为诱变剂的抗生素主要有链黑霉素、争光霉素、丝裂霉素、放线菌素、光辉霉素和阿霉素等。这些抗生素都是抗癌药物，它们在微生物育种中虽有应用，但效果不如烷化剂等诱变剂显著，应用并不广泛。一般不单独使用，常与其他诱变剂一起复合使用。,八、直视化学诱变剂的操作安全 化学诱变剂多数是极毒的致癌药品，在进行诱变操作后的处置以及诱变剂的保藏等方面的安全防护都是极其重要的。如有疏忽，就可能对健康和环境带来恶果，万万不可麻痹。,第三节 生物诱变剂,一 噬菌体 人们在使用某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时，发现常伴随着出现抗生素产量明显提高的抗性变株，因此，可以认为这种溶源性噬菌体就是一种诱变剂。在后来选育放线菌抗噬菌体菌种时，同样显示出噬菌体具有明显的诱变效应。,二 基因诱变剂 基因点突变技术。 基因诱变应用于点突变技术中，目前有其相当的局限性，它只能对天然蛋白质中某些氨基酸进行替换，而高级结构基本不变，因此对酶的功能改造非常有限。 目前认为生物诱变剂按诱变方式可分为以下三大类； 1）转导诱发突变 2）转化诱发突变 3）转座诱发突变,