第四章 微生物杂交育种课件.ppt

微生物杂交育种,王 陶,2012年2月,（1）理解杂交育种的意义及其遗传学原理； （2）掌握亲本选配、杂交技术方法、杂 种后代的处理和早代测验的基本理论和基本方法； （3）掌握熟悉杂交育种的程序。,教学的基本要求,教学基本内容,杂交育种的概念、意义放线菌的杂交育种霉菌的杂交育种酵母菌的杂交育种教学重点及难点：真菌的杂交育种及方法,发酵工业的优良菌种的选育主要采用诱变育种方法。但是，一个菌种长期使用诱变剂处理之后，其生活能力一般要逐渐下降，例如生长周期延长，孢子量减少，代谢减慢，产量增加缓慢，诱变因素对产量基因影响的有效性降低等。因此，有必要利用杂交育种方法。,一、微生物杂交,1、杂交育种的定义,杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。,杂交育种（breeding by hybridization) 是国内外广泛应用并卓有成效的育种方法。目前在生产上大面积推广种植的农作物的品种绝大多数都是用杂交育种的方法育成的。,定义的拓展,杂交育种(Hybridization breeding)一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F因子转导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。这也是一类重要的微生物育种手段，比起诱变育种，它具有更强的方向性和目的性。,甲生长快，产量低,乙生长慢，产量高,以杂交方法培育优良品种或利用杂种优势称为杂交育种。,2、杂交育种的目的在于：,1）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体）；2）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；3）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种；4）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传学理论的发展。,3、微生物杂交育种基本程序,选择原始亲本,诱变筛选直接亲本,亲和力鉴定,杂交,分离到基本培养基和选择培养基上培养,筛选重组体,鉴定,4、亲本菌株的选择,原始亲本是微生物杂交育种中具有不同遗传背景的优质出发菌株,主要根据杂交的目的来选择.从育种角度出发.通常选择具有优良性状如产量高,代谢快,产孢子能力强,无色素,泡沫少,粘性小等发酵性能好的菌株为原始亲本. 它们可以来自生产用菌或诱变过程中的某些符合要求的菌株,也可以是自然分离的野生型菌株.原始亲本还应该具有野生型遗传标记,如具有一定的孢子颜色,可溶性色素或抗性标记等明显不同的性状.,直接亲本,微生物杂交育种所使用的配对菌株称为直接亲本。特点：经原始亲本菌株诱变而来； 具有营养缺陷型标记或其他标记研究表明：若要获得高产的重组体，最好采用具有明显遗传性状差异的近亲菌株为直接亲本,5、培养基,完全培养基（CM）：各种微生物菌株基本培养基（MM）：野生型，原养型有限培养基（LM）：异核体菌株补充培养基（SM）：鉴别，选择发酵培养基,6、标记亲本菌株,由于杂交育种重组频率极低为10-7左右.杂交后的混合体系中除了极少数重组体外.还存在大量的未杂交亲本及无效杂交后代,增加重组体筛选难度.为了提高效率,加快重组体筛选和检出,让杂交亲本带上不同的遗传标记是十分重要的.但实际工作中大多数亲本无野生型遗传标记,一般是由原始亲本菌株经诱变剂处理后选出的具遗传标记,又通过亲和力测定的直接用于杂交的菌株.一般杂交亲本用营养缺陷型或抗药性突变型等遗传标记,作为选择重组体的标准和依据.,由于多数微生物尚未发现其有性世代，因此，直接亲本菌株应带有适当的遗传标记。常用的遗传标记有颜色、营养要求和抗药性等。 营养标记菌株（即营养缺陷型菌株）是最常用的遗传标记之一。,所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质后才能生长。,2抗性标记(高温、高盐、高pH) 3温度敏感性标记 4其他性状标记 如孢子颜色、菌落形态结构、可溶性色素舍量、代谢产物产量高低和代谢返速度快慢等，以及利用的碳、氮原种类、杀伤力等其他性状都可以作为重组体检出的辅助性标记。,7.杂交育种方法,常规杂交育种 丝状真核微生物通过接合、染色体交换，然后分离形成重组体。常规杂交主要包括接合、转化、转导、溶原转换和转染等技术。原生质体杂交育种,二、放线菌的杂交育种,放线菌杂交是在细菌杂交研究的基础上发展起来的。放线菌和细菌一样属于原核生物，但它们却像霉菌一样以菌丝形态生长，而且形成分生孢子。所以就本质来讲，虽然放线菌的基因重组过程近似于细菌，但就育种方法来讲它却有许多与霉菌相似的方面。,细菌的一个大类群，为革兰氏阳性。多为腐生，少数为寄生。寄生型放线菌会引起放线菌病和诺卡氏病。能产生大量的、种类繁多的抗生素。世界上绝大多数的抗生素由放线菌产生。,放线菌菌体为单细胞，大多数由分枝发达的菌丝组成。根据放线菌菌丝的形态和功能分为营养菌丝、气生菌丝和孢子丝三种.,形态结构,放线菌与人类生活及生产的关系,又称为初级菌丝体、一级菌丝体或基内菌丝，匍匐生长于培养基内，主要生理功能是吸收营养物。 营养菌丝一般无隔膜；直径0.20.8m；长度差别很大；短的小于100 m，长的可达600 m. 有的产生色素：黄、橙、红、紫、蓝、绿、灰、褐、黑等，包括脂溶性和水溶性，脂溶性色素局限于菌丝，水溶性色素可在培养基中扩散。,营养菌丝,又称为二级菌丝体。营养菌丝体发育到一定时，长出培养基外并伸向空间的菌丝为气生菌丝。,气生菌丝,孢 子 丝 当气生菌丝发育到一定程度，其上分化出可形成孢子的菌丝即为孢子丝，又名产孢丝或繁殖菌丝。,放线菌主要通过形成无性孢子的方式进行繁殖，也可利用菌丝片断进行繁殖。放线菌生长到一定阶段，一部分菌丝形成孢子丝，孢子丝成熟便分化形成许多孢子，称为分生孢子。 孢子呈白、黄、绿、淡紫、粉红、蓝、褐、灰等颜色。,繁殖方式,A 放线菌杂交原理 放线菌属于原核生物，只有一条环状染色体。放线菌染色体结构的特殊性决定其基因重组过程的特殊性。放线菌基因重组过程类似于大肠杆菌，大体上有以下四种遗传体系：（1）异核现象 有些放线菌的营养缺陷型在混合培养或杂交过程中，经菌丝和菌丝间的接触和融合而形成异核体。 所谓异核体即同一条菌丝或细胞中含有不同基因型的细胞核。异核体所形成的菌落在表型上是原养型的，但其基因型分别与亲本之一相同，而无重组体出现。,由此证明，在这些放线菌的同一个细胞质里，存在着两种遗传上不同的细胞核，它们在营养上起着互补作用。在繁殖过程中，它们没有发生遗传信息的交换。 有些链霉菌可以形成异核体，有些则不能。在不同菌株中形成异核体和发生基因重组缺乏明显的相关性。但形成异核体和重组体除与菌株有关外，外界条件也起着一定作用。,（2）接合现象 菌丝间接触和融合后，相同细胞质里不同基因型的细胞核在双方增殖过程中，发生部分染色体的转移或遗传信息的交换。接合现象的结果导致部分合子的形成。 部分合子是由一个供体染色体片段与一个受体染色体的整体相结合而形成的，但亦可能两个亲本染色体都不完整 。,（3）异核系的形成 当部分合子形成后，接着就产生杂合的无性繁殖系（异核系）的细胞核，后者是经过一次单交换而产生的异核系染色体组。它有一个二体区，即染色体的末端具有串联的重复结构。根据交换数目和染色体间的关系而产生单倍重组体或重组异核系。异核系的菌落形态很小，遗传类型各不相同。能在基本培养基上或选择性培养基上生长。但将异核系的分生孢子影印到同样培养基上就不能生长。,（4）重组体的形成 异核系不稳定，在菌落生长过程中，染色体重叠两节段（二体区）的不同位置上发生交换后，能产生重组体孢子。异核系所产生的孢子几乎全部是单倍体，而成为一个单倍的无性繁殖系，能长出各种类型的分离子，但是，重组体也可由部分合子经过双交换而产生。,B 放线菌的杂交技术 现在常用的放线菌杂交方法主要有三种，即混合培养法、平板杂交法和玻璃纸转移法。a 混合培养法（1）选择性平板法 所使用的两亲株必须是互补的营养缺陷型。将用来进行重组的两亲株混合，接种到丰富的完全培养基斜面上，孢子形成后制成单孢子悬浮液，然后在选择性培养基平板上进行分离，长出的菌落即为各种类型的重组体。,（2）异核系分析法,将混合培养后所制得的单孢子悬浮液，分离在基本培养基平板上，其中长成的小而丰富的菌落即为异核系。然后将异核系再分离在完全培养基上，长出的菌落即为分离子。,b 平板杂交法,该方法是先将菌落培养在非选择培养基上，当菌落形成孢子以后，用影印培养法将菌落印至已铺有试验菌孢子的完全培养基平板上，再培养至孢子形成。然后把这上面的孢子影印到一系列选择性培养基上，以便于各种重组体子代的生长。,c 玻璃纸转移法,使用本法必须具备两个条件： 第一，直接亲本必须带有两个遗传标记，即一个直接亲本带有一种营养要求和抗药性（如抗链霉素）；而另一个直接亲本则为对该药物敏感（如对链霉素敏感）和带有另一种营养缺陷型。,第二，选择性培养基是带有抗性药物的补充培养基。 该方法是在选择性培养基上挑选异核系菌落，其原理是：异核体带有链霉素敏感的等位基因，在含有链霉素的选择性培养基上不能生长。敏感性亲本和抗药性亲本因为营养要求得不到满足也不能在该选择性培养基上生长。而不带链霉素敏感等位基因的两直接亲本的局部结合子则能在该选择性培养基上生长、繁殖成为异核系菌丛。,放线菌的杂交育种,基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似放线菌的遗传体系和杂交原理：异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的核。无 重组体出现。接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分 合子。整+部分、部分+部分。异核系的形成：部分合子产生的无性繁殖系。能在基 本或选择培养基上生长。 （单交换，二体区）重组体的形成：异核系不稳定，可经过双交换形成重 组子，产生重组子孢子。,酵母菌 yeast,是一种单细胞真菌，可看作是真菌中的特殊形态。形态和结构 酵母菌是一种适应于在碳水化合物、高糖份偏酸性环境中生存的微生物。工业发酵就是用淀粉、蔬菜、糖作原料，在食品、化工、医药工业中得到广泛应用。酵母菌又分发酵型和氧化型两种。发酵型的多用于发酵工业。氧化型的用于石油加工工业，工艺过程中的脱蜡，降低石油凝固点，对石油炼制废水的去油降酚起积极作用。,大多数以单细胞状存在。在特殊条件下，生成的芽体互相连接形成树枝状，芽体延长像菌丝（假丝），细胞大多数是卵圆形，细胞核有明显的核膜。 酵母菌的细胞结构与细菌相似，但比细菌细胞大得多。一个椭圆形的酵母菌细胞长约7.2um，宽5.6nm(圆形直径15um) 繁殖 分为无性繁殖、有性繁殖。 芽殖 白芽母细胞的一端突起，进行分裂，芽长大，脱落。 裂殖 菌体直接进行分裂繁殖。,有性繁殖 先形成子囊孢子、生子囊孢子及其数目是鉴定酵母菌的依据之一。工业上可利用生子囊孢子进行杂交育种。, 菌落特征 表面湿润、粘稠，大多数是乳白色，少数红色（红酵母），在固体培养基上生长时间长了，颜色变暗，呈绉缩状。 酵母的生理特性发酵工业发酵：食品、酿酒，面包、醋、酱、鱼露等。医药：菌体蛋白、凝血质、核糖核酸、酵母、细胞色素丙、辅酶甲、核苷酸、蛋白酶、维生素。化工：乙醇、甘油、甘露醇、有机酸、丙酮、乙醚、甲醛。环保：厌氧消化、垃圾无害化、堆肥技术。发酵过程主要是利用含糖、淀粉或碳水化合物作原料，不同种类的酵母菌对各种糖类的发酵能力不同，根据这一特性可以鉴别酵母中的不同种类。,三、酵母菌的有性杂交育种,（一）酵母菌的生活史（二）酵母菌有性杂交技术酵母菌有性杂交程序一般为：,亲本的单倍化有性杂交杂交后代的检出筛选优良性状个体,单倍化：将两个不同性状的亲本菌株分别接种到含醋酸钠等产孢子培养基斜面上，使其产生子囊，经过减数分裂后，在每个子囊内会形成4个子囊孢子（单倍体）。用蒸馏水洗下子囊，经机械法（加硅藻土和石蜡油，在匀浆管中研磨）或酶法（用蜗牛酶等处理）破坏子囊，再经离心，然后将获得的子囊孢子涂布平板，就可以得到由单倍体细胞组成的菌落。,有性杂交,两个遗传型不同的生物体通过杂交产生杂种生物体的有性生殖过程。 在真核微生物中，是指通过性细胞间或体细胞间的接合和随之发生的减数分裂与遗传重组，产生不同于亲本遗传型的子代的过程。 凡能产生有性孢子的霉菌或酵母菌，一般都可用有性杂交的方法育种。,1、亲本的单倍化1）杂交亲本单倍体细胞的分离（1）子囊孢子的形成形成子囊的条件一般方法（2）单倍体子囊孢子的分离显微操作器分离单倍体子囊孢子法酶法机械研磨法（3）单倍体菌株的确定单倍体细胞与二倍体细胞在形态方面的区别生孢子能力的测定单倍体细胞结合型的确定2）杂交亲本单倍体细胞遗传标记的制作,酵母菌有性杂交的方法：,2、酵母菌有性杂交孢子杂交法群体交配法单倍体细胞杂交法3、杂交后代的检出4、筛选优良性状个体,S. Cerevisiae 的双倍体和单倍体细胞的比较,项 目双倍体单倍体细 胞大，椭圆形小，球形菌 落大，形态均一小，形态变化较多液体培养繁殖快，细胞较分散繁殖较慢，细胞常聚集成团在产孢子培养基上 形成子囊及子囊孢子不形成子囊,霉菌,是一种真菌能利用无机氮作氮源适于在酸性环境中繁殖的多细胞微生物。它在医药、化学、纺织、食品等工业中都得到广泛应用。在发酵工业用霉菌生产酒精、有机酸（柠檬、葡萄糖酸）、抗生素、酶制剂（淀粉酶、蛋白酶、纤维酶）、维生素及甾体激素等；有些霉菌又是动植物的病源菌，在潮湿的环境中可使棉、毛、丝、麻、皮革、布匹几乎所有的生活用品、工业品等多种物质发霉、腐烂、变质，祸害很大。霉菌能利用多种含N物质如铵盐、硝酸盐、氨基酸、胶胨及蛋白质作氮源；以淀粉、糖类、醇、脂肪、高级石腊等有机物作碳源。Fe、Zn、Cu、Mn、Mo促进霉生长也是必不可少的微量元素，是比较能耐酸、碱的微生物。,形态,绒毛状或疏松的棉花状，孢子具有各种不同颜色。个体形态 霉菌是多细胞真菌的代表，菌体是由许多菌丝组成的菌丝体。其菌丝有两部分：一部分伸入基质内部（即培养基内部）或漫生于培养基表面吸取营养的营养菌丝；另一部分是伸于基质上空称为气生菌丝，它可产生孢子，进行繁殖，包括无性繁殖和准性繁殖。无性繁殖分裂出各种孢子：分生孢子、孢囊孢子、厚生孢子、节孢子准性繁殖两细胞质融合生出各种孢子。,菌落特征,与放线菌相似，菌落由分枝状菌丝组成。菌丝较长形成的菌落为绒毛状。絮状或蜘蛛网状，一般比细菌菌落大几倍到几十倍。孢子可有不同形状的构造和颜色。,工业上常用霉菌的形态及特点, 曲霉 Aspergillus种类很多。目前在发酵工业上应用的霉菌大都是曲霉。 根霉Rhizopus菌丝向四周蔓延，形成密密的棉絮状的蔓丝而充满着整个基础表面，形成葡萄枝状（孢子是梨形），与此派生出与根霉相似的梨头霉用于甾体激素生产。 青霉、稻草霉、盘尼西林 Pcnicillum青霉菌中的蓝青霉和黄青霉素的重要菌种。孢子成扫帚状，青霉十分接近曲霉，在自然界中土壤里广泛存在。 毛霉 Mucor 形态与根霉相似，存在于腐败植物、果实、面包等。 木霉 Trichoderma 分布很广。在腐烂木材、植物残体、种子、土壤、有机肥料均有存在。分解木质素。用以木代粮菌种的培育与生产。,四、霉菌的杂交育种 不产生有性孢子的微生物除了主要进行无性繁殖外，还能进行准性生殖。准性生殖的发现，不仅促进了这类微生物遗传的研究，而且亦为这类微生物的育种提供了一条新的途径。,准性生殖的定义和意义： 类似于有性生殖但更原始的生殖方式，是通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。 为半知菌育种提供了一个重要手段。存在范围：常见于一些真菌尤其是半知菌中，是一群只有无性阶段或有性阶段未发现的真菌。它们当中大多属于子囊菌，有些属于担子菌，只是由于未观察到它们的有性阶段，无法确定分类地位，因此归于半知 菌。,A 准性生殖的过程,准性生殖的整个过程包括三个相互联系的阶段： 异核体的形成； 二倍体的形成； 体细胞重组。,1、异核体的形成,当具有不同性状的两个细胞或两条菌丝相互联结时，导致在一个细胞或一条菌丝中并存有两种或两种以上不同遗传型的核。这样的细胞或菌丝体叫做异核体，这种现象叫异核现象。,异核体：同一菌丝有不同遗传性状的核在同一 细胞质中生长。 同核体：同一菌丝中只有一种核。,异核体的特点：1）具有感受性的两种菌丝间才可形成异核体； 2）具有野生型性状，可在基本培养基上生长 ； （基因互补功能） 3）大多数异核体的分生孢子不能在基本培养基 上生长；如能生长，则为异核体、或为杂合 二倍体（重组子）。,2、杂合双倍体的形成,随着异核体的形成，准性生殖便进入杂合双倍体的形成阶段，就是异核体菌丝在繁殖过程中，偶而发生两种不同遗传型核的融合，形成杂合细胞核。由于组成异核体的两个亲本细胞核各具有一个染色体组，所以杂合核是双倍体。杂合双倍体形成之后，随异核体的繁殖而繁殖，这样就在异核体菌落上形成杂合二倍体的斑点或扇面。将这些斑点或扇面的孢子挑出进行单孢子分离，即可得到杂合双倍体菌株。,体细胞重组,杂合双倍体只具有相对的稳定性，在其繁殖过程中可以发生染色体交换和染色体单倍化，从而形成各种分离子。染色体交换和染色体单倍化是两个相互独立的过程，有人把它们总称为体细胞重组。这就是准性生殖的最后阶段。,染色体交换,由准性生殖第二阶段形成的杂合双倍体并不进行减数分裂，却会发生染色体交换。由于这种交换发生在体细胞的有丝分裂过程中，因此它们被称为体细胞交换。杂合双倍体发生了体细胞交换后所形成的两个子细胞仍然是双倍体细胞。,染色体单倍化,杂合双倍体除了发生染色体交换外，还能发生染色体单倍化。这过程不同于减数分裂。在减数分裂过程中，全部染色体同时有一对减为一个，所以通过一次减数分裂，由一个双倍体细胞产生四个单倍体细胞。而染色体单倍化则不同，它是通过每一次细胞分裂后，往往只有一对染色体变为一个，而其余染色体则仍然都是成双的。这样维过多次细胞分裂，才使一个双倍体细胞转变为单倍体细胞。通过单倍化过程，形成了各种类型的分离子，它包括非整倍体、双倍体和单倍体。,体细胞交换和单倍体化,杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂的过程中，能发生体细胞染色体间的交换、分离（单倍体化）而产生具有新性状的单倍体杂合子、双倍体及非整倍体。,A,B,A+B,（同核体）,（异核体）,A,A,B,B,AB,A,A,B,B,（杂合二倍体）,单倍体杂合子,B 霉菌的杂交技术,（1）选择直接亲本 用来进行杂交的两个野生型菌株叫做原始亲本。原始亲本经过诱变以后得到各种突变型菌株。假设这种菌株是用来作为形成异核体的亲本，就叫直接亲本。 作为直接亲本的遗传标记有多种多样。如营养突变型，抗药性突变型，形态突变型等。,（2）异核体的形成,在基本培养基上，强迫两株营养缺陷型互补营养，则这两个菌株经过菌丝细胞间的吻合形成异核体。由直接亲本形成异核体的方法有：,1）完全培养基液体混合培养法；2）完全培养基斜面混合培养法；3）液体有限培养基混合培养法；4）有限培养基平板异核丛形成法；5）基本培养基斜面衔接接种法6）基本培养基平板穿刺法等。,（3）双倍体的检出,检出双倍体的方法有三种： l）用扩大镜观察异核体菌落的表面，如果发现有野生型颜色的斑点和扇面，即可用接种针将其孢子挑出，进行分离纯化，即得杂合双倍体。 2）将异核体菌丝打碎，于基本培养基和完全培养基平板上进行分离，经培养挑出异核菌落。在个别异核菌落上长出野生型原养性的斑点和扇面，将其挑出进行分离纯化即可。 上述两种方法只能从每个异核体菌落（丛）上挑取一个斑点或扇面，以排除无性繁殖的干扰。,3）将大量异核体孢子分离于基本培养基平板上从中长出野生型原养性菌落，将其挑出分离纯化，即得杂合双倍体。,（4）分离子的检出,1）将杂合双倍体单孢子分离于完全培养基平板上，培养至菌落成熟，从每个菌落挑出一个斑点或扇面的孢子于完全培养基斜面上，培养后经过纯化和鉴别即得分离子。 2）用选择性培养基筛选分离子 我国进行了不少霉菌杂交育种方面的工作。60年代青霉素产生菌产黄,准性生殖的过程：,菌丝联结 异核体形成（质配） 核配形成杂合二倍体体细胞交换和单倍体化。,准性生殖与有性生殖的比较,项 目 准性生殖 有性生殖参与接合的亲本细胞形态相同的体细胞形态或生理上有分化的性细胞独立生活的异核体阶段 有 无接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂接合发生的几率偶然发现，几率低 正常出现，几率高,