第八章微生物的遗传和变异课件.ppt

第八章微生物的遗传变异,第一节 遗传变异的物质基础第二节 基因突变和诱变育种第三节 基因重组和杂交育种第四节 基因工程第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,内容提要,亲代的性亲代的性状在子代表现出来，使子代与亲代有相似的现象，叫遗传。从分子水平上讲，遗传就是遗传信息的复制和表达。,亲代与子代及子代各个体之间，无论在形态结构和生理机能方面，总会有差异，这种同类型不同个体之间的差异称为变异。从分子水平讲，是遗传信息发生了变化。,遗传和变异是生物体最本质的属性之一。,遗传（heredity或inheritance）,变异（variation）,遗传型：,表型（表现型）：,又称基因型，指某一生物个体所含的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。,指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特征的宗和，是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。,有些基因结构未发生变化仅表型改变不是变异，只能称适应或饰变（modification） 。变异是基因结构发生变化，而且往往是不可逆的变化，此变化可以遗传给子代形成新的品种。遗传是相对的，变异是绝对的；遗传中有变异，变异中有遗传。,饰变：是指外表的修饰性的改变，即一种不涉及遗传物质结构改变而发生在转录、转译水平上的表型改变。,表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。,变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。,遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为 （自发突变频率通常为10-6-10-9）,微生物是遗传学研究中的明星：,微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。,很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。,对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。,微生物的独特生物学特性：,（1）个体的体制极其简单；（2）营养体一般都是单倍体；（3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁 殖；（4）繁殖速度快；（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6）菌落形态特征的可见性和多样性；（7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直 接性和均一性；（8）易于形成营养缺陷型；（9）各种微生物一般都有相应的病毒；（10)存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；,第一节 遗传与变异的物质基础,（一）核酸遗传变异的物质基础（3个经典实验）,（二）遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式,1、证明DNA是遗传物质的经典转化实验,Griffith是第一个发现转化现象的 ，虽然当时还不知道称之为转化因子的本质是什么，但是他的工作为后来Avery等人进一步揭示转化因子的实质，确立DNA为遗传物质奠定了重要基础。,（一）核酸遗传变异的物质基础（3个经典实验）,转化实验,材料,方法,动物实验,细菌培养实验,S型菌无细胞抽提液试验,有 荚 膜菌落光滑分泌毒素致 病,无 荚 膜菌落粗糙无 毒不 致 病,SSS三个血清型,RRR三个血清型,实验材料： 肺炎双球菌,肺炎双球菌转化实验（1）动物实验,转化实验（2）细菌培养实验,转化实验（3）S型菌无细胞抽提液试验,（二）噬菌体感染实验,A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含15%放射性,沉淀中含85%放射性,沉淀中含25%放射性,以35S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含75%放射性,原始株 拆开 重建 感染 分离纯化,植物病毒的拆开与重建实验,（一）核酸存在的七个水平细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞核水平: 原（核区）与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA（细 胞质中）,真核：DNA+组蛋白染色体水平: 倍性(真核)和染色体数（真核：多条；原核：一条）核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体，DNA或 RNA（少数病毒），复合或裸露，双链或单链（少数病毒）,二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式,（一）核酸存在的七个水平基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录翻译密码子水平：DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。遗传密码的单位是密码子。密码子是由核酸分子上三个连续核苷酸序列决定的。三个连续的枋苷酸序列核苷酸水平：核苷酸是核酸的组成单位，最小的突变或交换单位，四种碱基,二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式,基因组：是指单倍体细胞中所含的全套遗传物质，包括细胞中的基因及非基因的DNA序列。大多数细菌和噬菌体而言，基因组是指单个染色体上所含的全部基因。二倍体直核生物：单倍体（配子或配子体）细胞核内整套染色体所含的DNA分子及其所携带的全部基因。微生物的基因组一般都比较小，其中最小的大肠杆菌噬菌体MS2仅3000bp，含3个基因，而人的染色体DNA为.x109bp.基因组学：研究生物基因组的组成、组内各基因的精细结构、相互关系及表达调控的科学。,第二节、微生物的基因组,原核生物的质粒,1.定义和特点 定义： 存在于微生物染色体以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子。所含的基因对寄主细胞一般是非必需的，只是在某些特殊的条件下质粒能赋予寄主细胞以特殊的机能，使寄主得到生长优势。特点：超螺旋结构、独立的复制子、严谨型复制、松弛型复制、质粒消除整合,第三节 微生物的染色体外遗传因子,2、质粒的主要类型：根据质粒所编码的功能和赋予的表型效应。,抗性因子（Resistance factor，R因子）：主要包括抗药性和抗重金属两大类。Amp、Kan,致育因子（Fertility factor，F因子）：最早发现的与大肠杆菌的有性生殖有关的质粒。决定细菌的性别。,CoL质粒（col plasmid）：大肠杆菌毒素因子，含有编码大肠杆菌素的基因。一种细菌蛋白，,Ti质粒（tumor inducing plasmid）：,Ti质粒（tumor inducing plasmid）：,Ri质粒（root inducing plasmid）:,基 因 突 变,突变与育种,第四节、微生物突变和诱变育种,一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变,基因突变：,一、基因突变简称突变，是变异的一类，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传变化，可自发或诱导产生。狭义突变指基因突变广义突变是指基因突变和染色体畸变。基因突变：指一个基因内部遗传物质结构或DNA序列的任何变化，包括一对或少数几对的缺失、插入或置换，导致遗传性状的变化。,突变的特点,基因突变,突变的机制,突变类型,微生物突变体的主要类型,形态突变型,菌落形态突变型,菌体形态突变型,生化突变型,营养突变体(营养缺陷型),抗性突变体发酵突变型:能利用到不能利用毒力突变型：致病能力增强或减弱,条件致死突变型致死突变型:突变后生活能力丧失或下降导致死亡的突变型。,产量突变型,按突变实质分,（二）基因突变的特点(5个特点),1 .随机性 2. 稀有性：10-910-63.独立性4. 稳定性5. 可逆性,基因突变随机性（自发性和不对应性）的证明,变 量 试 验,涂 布 试 验,影印培养试验,(在同一个大管中作整体培养),29 291 83 9 22 19 17 20,抗噬菌体菌落数 抗噬菌体菌落数,变量试验,涂布试验,影印培养试验,基因突变及其机制,移码突变,染色体畸变,碱基的置换,一对碱基被另外的一对碱基置换。转换(transition)：即DNA链中的一个嘌呤被嘌呤或嘧啶被嘧啶所置换。颠换(transversion)：即一个嘌呤被嘧啶或嘧啶被嘌呤所置换。,1 诱变的机制,(1)碱基的置换,碱基的置换,直接引起置换的诱变剂,间接引起置换的诱变剂,碱基的置换,T：烯醇式,.,5-BU:酮式,5-BU:烯醇式,碱基的置换,间接引起置换的诱变剂,碱基的置换,烯醇式,酮式,分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起,造成突变点以后全部遗传密码转录与翻译发生错误,增添一个碱基,缺少一个碱基,移码突变,染色体畸变,某些理化因子，如射线，紫外线， 亚硝 酸等，除能引起点突变外，还会引起DNA分 子大损伤，包括染色体易位，倒位，缺失，重复等，即为染色体畸变。,染色体畸变,紫外线诱变作用机理,可使链裂断，破坏核糖和磷酸间的键联,引起胞嘧啶和尿嘧啶产生水合作用造成氢键断裂,能使胸腺嘧啶成二聚体，使结构发生改变,DNA的损伤修复 DNA的损伤：DNA在复制时产生错配、病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏DNA的双螺旋结构，从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。 若DNA的损伤或错配得不到修复，会导致DNA突变。其主要形式： 一个或几个碱基被置换 插入一个或几个碱基 一个或多个碱基对缺失 DNA的损伤修复光复活修复、切除修复,光复活修复：400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上的TT（或CC，CT）二聚体。（包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无）切除修复：将DNA分子中的受损伤部分切除，以 完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、DNA聚合酶、 DNA外切酶、DNA连接酶均参与。（发生在DNA复制前）,重组修复（发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生的缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。诱导修复：造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应,称为应急反应(SOS response)。此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的DNA聚合酶。所以会有2种结果：修复或变异（进化）。,诱变育种的定义,二、突变与育种,诱变育种,诱变育种就是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后设法采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的突变株，以供生产实践或科学实验之用。 诱变育种除提高产量外，还可改进产品质量、扩大品种种类和简化工艺等目的。它具有方法简便、工作速度快和收效显著等优点，仍是目前最广泛使用的育种手段。,效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1 单位,从 青 霉 素 产 量 看 诱 变 育 种,诱变育种的基本环节,诱变育种工作中应考虑的几个原则,选优良的出发菌株,处理单孢子（或单细胞）悬液,选用最适剂量,设计或采用高效筛选方案或方法,利用复合处理的协同效应,利用和创造形态，生理与产量间的相关指标,选择简便有效的诱变剂,挑选优良的出发菌株,生产中用过的自发变异菌株,选用具有有利于进一步研究或应用性状的菌株,采用已发生其他变异的菌株,采用对诱变剂敏感性较高的增变变异株,处理单孢子（或单细胞）悬液,芽孢杆菌应处理芽孢,放线菌，霉菌应处理孢子,细菌指数期，放线菌霉菌要稍加萌发后使用,出发菌株应制成均匀悬夜,选择简便有效的诱变剂,选用最适剂量,剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示,合适剂量：能扩大变异幅度又能促使 变异移向正变范围的剂量,充分利用复合处理的协同效应,两种或多种诱变剂先后使用,同种诱变剂重复使用,两种或多种诱变剂同时使用,利用和创造形态，生理与产量间的相关指标,淀粉酶变色圈试验,变色圈大的为淀粉酶高产菌落,设计或采用高效筛选方案或方法,第一轮,第二轮,五个出发菌株,（8）创造新型筛选方法,1、初筛：以量为主2、复筛：以质为主,突变株的筛选方法,高产突变菌株的筛选方法,抗性突变体的筛选方法,营养缺陷型的的筛选方法,与突变株的筛选相关的几个概念,与突变株的筛选相关的几个概念,相关培养基,基本培养基：能够满足某一菌种的野生型菌株营养要求的最低成分的组合培养基。,完全培养基：是在基本培养基中添加天然物质后能满足某种微生物各种营养缺陷型的营养要求的加富培养基。,补充培养基：是在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的加富培养基。,与突变株的筛选相关的几个概念,三类遗传型,野生型 A+B+,营养缺陷型 A+B-,原养型 A+B+,高产突变株的筛选,琼脂块培养法筛选 春日霉素高产菌种,梯度培养皿法,含异烟肼,接敏感菌含突变株,抗药性突变株的筛选,营养缺陷型的筛选办法,诱变剂处理,淘汰野生型：青霉素浓缩法、菌丝过滤法、 差别杀菌法,检出缺陷型：夹层培养法、限量补充培养法、逐个 检出法、影印接种法,鉴定缺陷型,中间培养,淘汰野生型（青霉素浓缩法）,淘汰野生型（差别杀菌法）,1.适用于细菌的芽孢2.原理：将诱变处理的芽孢接种到基本培养基上，野生型的芽孢生长成营养细胞，而缺陷型的不能生长成营养细胞。,检出缺陷型（夹层培养法）,检出缺陷型（限量补充培养法）,微量蛋白胨的基本培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株,检出缺陷型（逐个检出法）,检出缺陷型(影印接种法),鉴定缺陷型,生长谱法：基本培养基+氨基酸 基本培养基+维生素 基本培养基+嘌呤或嘧啶,第三节、基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组 细菌的基因重组,原核微生物 通过转化、接合、转导、原生质体融合等形式进行 一 部分物质转移和基因重组。,转化(transformation),几个概念：转化、转化因子、感受态,转化过程,转化的特点,转 化 (transformation),受体细胞直接吸收了来自供体细胞的DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。,转化因子:有转化活性的外源DNA片断,转化是游离的片段的转移和重组,游离的片段叫转化因子,转化因子由供体提供,自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生，,实验室里通过提取获得,双链有转化能力，单链没有.,受体细胞最能接受外源DNA片段并能实现转化的生理状态称为感受态，只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，从出现到消失约为分钟(对数期的中期),感受态,感受态的决定决定因素,细胞遗传性决定：大肠杆菌，根瘤菌属等,和菌龄有关：对数生长的中后期,环腺苷酸cAMP可提高1000 倍,Ca2+能促使细胞进入感受态,感受态因子,是受体细胞表面上的一种蛋白质，即膜相关DNA结合蛋白,功能使转化因子结合在受体细胞表面,细胞壁自溶素和几种核酸酶,每个受体细胞表面约有30 -80个转化因子结合点，当转化因子结合到受体表面结合点上时 ，DNA一条链被受体细胞膜上的核酸酶分解，另一条链进入受体细胞，通过整合与受体细胞进行基因重组，有人发现DNA也可通过双链形式进入受体细胞形成双倍体的转化子。,转化过程,转化过程,转化的特点 不需两个细胞直接接触，供体DNA提取出来，注入受体即可。,转染：感受态细胞吸收质粒DNA和噬菌体DNA。,转导的种类,遗传物质通过噬菌体的携带而转移的基因重组。转导子：重组受体细胞,转导的发现,转导(transduction),转导的特点,普遍转导,完全普遍性转导(compietetransduction),鼠伤寒沙门氏菌,A-B+色氨酸缺陷型,A+B-组氨酸缺陷型,低频转导（LFT）裂解物的形成,局限转导：少数特定基因,转导的特点,需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触,噬菌体DNA不接合到寄主染色体,噬菌体蛋白质包裹寄主任何一部分DNA片段,噬菌体DNA整合到寄主染色体上,噬菌体DNA与寄主染色体特定基因发生交换,普遍性转导,局限性转导,接 合 及 其 发 现,因子和接合,接合(conjugation):细菌杂交，细 胞间的直接接触。,雄性菌株与雌性菌株接合结果,接 合 及 其 发 现,通过细胞间的直接接触能进行大段的转移的过程，叫接合,因子和接合（大肠杆菌的结合）,雄性菌株与雌性菌株接合结果,F-,三者根本区别在于DNA转移的方式不同,转化：供体DNA片断注入受体细胞，通过细胞膜,接合：供体进入受体通过性纤毛,转导：供体DNA片断通过媒介噬菌体携带进入受体,(四)原生质体融合,通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，称为原生质体融合或细胞融合。,原生质体融合的一般原理和主要过程,先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶(如细菌可用溶菌酶或青霉素处理，入线菌可用溶菌酶或相应的脱壁权衡利弊，真菌可用蜗牛酶或相应的脱壁酶等)去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁 或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子,（一）有性杂交（二）准性杂交菌丝联结异核体的形成形成双倍体分离子的产生,第四节、真核微生物的杂交育种,目的基因（即外源基因或供体基因）的取得载体系统的选择，目的基因与载体重组体的构建，重组载体导入受体细胞，工程菌或工程细胞株的表达、检测以及实验室和一系列生产性试验等。,第五节 基因工程,基本操作包括：,基因工程的应用,在生产多肽类药物、疫苗中的应用改造传统工业发酵菌种动、植物特性的基因工程改良基因工程在环境保护中的应用,基本流程：,关键要素：,第六节、菌种的衰退、复壮和保藏,一、菌种的衰退与复壮二、菌种的保藏,菌种的衰退与复壮,菌种衰退指群体中退化个体再数量上占一定比例后，表现出菌种生产性能下降或优良性状丧失的现象。复壮是指菌种已发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，从而恢复该菌种原有典型性状的一种措施。,衰退的防止,1.控制传代次数2.创造良好的培养条件3.利用不易衰退的细胞接种传代（构巢曲霉用子囊孢子不用分生孢子）4.采用有效的菌种保藏方法,菌种复壮,1.纯种分离2.通过宿主进行复壮3.淘汰以衰退的个体,菌种保藏,原理：创造一个最有利于菌种休眠的环境，减少传代,方法：1.低温保藏法2.隔绝空气保藏法：石蜡油保藏法、橡皮塞密封保藏法、 琼脂柱穿刺封口保藏法3.干燥保藏法：砂土管保藏法、真空冷冻干燥法4.寄主保藏法,