第五章 微生物药物产生菌的菌种选育课件.ppt

育种(strain improvement)是指为改善种质对原出发菌株(作物)进行的遗传操作。,第五章微生物药物的菌种选育,微生物药物菌种选育的目的： 提高产量 组份优化 新化合物的获取,基因突变是一切突变的内因。任何代谢产物的生成均由遗传因素所决定，产生菌遗传物质的任何变化，都有可能改变其产物的产量和性质。微生物的生理条件、培养条件、发酵条件等在育种发面也有着重要作用。,1945,时间,1943,1943,1943,1955,1971,1977,目前,发酵单位(U/ml),100,250,500,850,8000,2万,5万,510万,青霉素诱变史,微生物的潜力是无穷的。,我们今天所吃的大米，是人类长期以来用人工选择、杂交、辐射诱变、化学诱变等方法改变了水稻“原生态”后生产出来的，是“人定胜天”的结果。,我们完全可以利用现有的资源，创造出奇迹。,自发突变(spontaneous mutation)：自然条件下, 菌株也会发生遗传或生理上的变化而造成产量的改变。突变有着正向和反向的差别。在无性繁殖的细菌中,突变率是用每一个细胞世代中每个细菌发生突变的概率，即用一定数目的细菌在一次分裂过程中发生突变的次数表示, 约10-8。不同生物和同一生物个体的不同基因的自发突变率不同。,自发突变因素:宇宙射线环境中的低浓度物质温度的改变,腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的第六位可以氨基或亚氨基形式出现，而鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)的第六位可以酮式或烯醇式出现。平衡一般倾向与氨基和酮基配对，即DNA双链一般以AT ,GC为主。,自发突变的机理之互变异构效应假说,如果A以亚氨基形式出现，在DNA合成到达这一位置的瞬间，通过DNA多聚酶的作用，新合成的DNA链上的相对位置就是C，而不是T 。如T以稀有的烯醇式形式出现，则错配G，而不是A 。,诱变育种(induced mutation):利用物理或化学诱变剂(mutagen)处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后设法采用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选少数符合目的的突变株(mutant)，以供生产科研之用。,步骤：出发菌株诱变初筛复筛放大获得优良变异株。,诱变育种两个主要的环节：诱变(induction)、筛选(screening),经典(常规)育种：诱变育种,出发菌株的选择：处理细胞一般为单孢子悬液,诱变剂量的选择,诱变剂的种类：物理诱变剂，化学诱变剂，拟辐射物质,诱变剂的选择：简便有效,1927年,美国遗传学家缪勒(H.J.Muller,18901967)首次发现用X射线照射果蝇精子后，果蝇后代发生突变的个体数大大增加。同年,又有科学家用X射线和g射线照射玉米和大麦的种子，也得到了类似的结果。 第二次世界大战期间，科学家发现了第一个化学诱变剂芥子气，开辟了化学诱变的新途径。从此，利用各种物理的和化学的手段进行人工诱变的工作在世界范围内广泛开展起来。,诱变处理的兴起,高产突变株的筛选： 化合物抗菌活性的琼脂块法 形态突变株的筛选： 去除色素，孢子等 自身耐药突变株的筛选： 产量越高，对自身的抗性就越强 营养缺陷型突变株的筛选：去除反馈抑制 结构类似物或前体类似物的筛选：选择对其抗性水平高的变株，可解除反馈抑制而提高产量。,五、根据产物特点而设计实验,b-内酰胺类抗生素可与某些金属离子螯合而降低其抗菌作用。筛选对高浓度金属离子有抗性的突变株，意味着提高浓度的b-内酰胺类抗生素解除了金属离子的毒性，即得到了高产菌株。,浅蓝菌素(cerulenin) 通过抑制聚酮体的前体 (也是脂肪酸前体)小分子酸类的合成而抑制聚酮体类抗生素的产生，因此筛选在适当浓度的浅蓝菌素琼脂平板上的生长菌落即可能获得高产菌株。将道诺霉素产生菌在一定浓度的浅蓝菌素琼脂平板上生长后，长出的菌落大多数因抗生素的生物合成被抑制而表现为无色，呈现红色的即为产生抗生素的菌落，这样获得高产菌株的机率就得到提高。,2004年1月13日，沃尔夫农业奖由中国的袁隆平与美国康奈尔大学的塔克斯莱(Steven Tanksley)分享，以表彰他们“对杂交水稻所做出的开创性研究和发现杂交优势的基因原理”。袁隆平从实践及推理中突破了水稻为自花传粉植物而无杂种优势的经典观念的束缚, 成为继陈省身(沃尔夫数学奖)及吴健雄(沃尔夫物理学奖) 之后第三个中国人。 丘成桐, 2010 沃尔夫数学奖,袁隆平屡获国际大奖在于水稻是一种极为重要的农作物，是由于其重大的经济价值，并不意味着中国在生物技术的开发和理论研究方面已走到了世界的前列。恰恰相反，在这些方面我们还与发达国家存在相当大的差距。袁隆平因为发现水稻杂种有优势，进而培育、推广杂交水稻，但是杂交水稻为什么会有优势？水稻杂交优势的遗传基础是什么？这些更根本性的理论研究成果却是坦克斯利做出的。这种理论研究具有更为重大的学术价值，将会对未来的应用开发产生深远的影响。,菲律宾的国际水稻研究所已开发出的“金大米”，通过转基因技术让水稻制造胡萝卜素(维生素A的前体), 有助于消灭在亚洲地区广泛存在的维生素A缺乏症。,国外正在试验用转基因技术提高水稻中铁元素的含量，以减少亚洲妇女常见的贫血症；将玉米基因转入水稻中，大幅度提高水稻的产量和改良稻米的品质等。,2005.3, 英国剑桥先正达种子公司(Syngenta Seeds)报道了第二代转基因“金大米” 胡萝卜素(防止失明)含量增加了20倍。”,2009年，中国颁发了具有自主知识产权的一个转植酸酶基因玉米品种，以及两个转抗虫基因水稻品种（世界上首次）的生产应用安全证书。引发公众转基因食品安全性大争论。中国工程院院士范云六：转植酸酶基因玉米可以提高饲料的利用效率，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲养成本；减少动物粪、尿中植酸磷的排泄，减轻环境污染，有利于环境保护。此外，利用农业种植方式生产植酸酶，还具有节能、环保、低成本的优势。 中国工程院院士张启发：转抗虫基因水稻不仅能有效控制螟虫等鳞翅目害虫危害，保障水稻增产，还能减少80%的化学农药用量。,杂交和转基因杂交是同种或近似种之间的交配，两亲不同但不至于差得太远。这里关于种的定义是经典的生殖隔离，但是不必拘泥这个，骡子就是异种杂交的例子。杂交的特征是遗传物质都是在亲本中已经存在的，不同的组合造成不同的性状。转基因在本质上不同 。以BT（Bacillus thuringiensis产生的可抵抗水稻抵抗螟虫等虫害的一种毒性蛋白，对人体无害）为例，没有任何亲本中有这个遗传物质，而是人为加入的。这个不是靠时间长短能由自然界替代的过程。有异种之间遗传物质传递的现象，但是很少，也不可预期。自然条件下，作物一般不能获得转基因的特性。,科学地看待问题：基于科学知识，而非基于逻辑推论和有选择性的所谓常识,经典育种的黄金时代已经过去，现在以及未来属于遗传工程。,现代生物技术在微生物药物育种中的应用理性菌种选育(Rational strain improvement),是指在对微生物药物的分子水平的装配、催化、调节等机理透彻了解的基础上,有针对性地进行育种研究。,代谢工程是指运用重组DNA技术通过对微生物细胞内的酶、转运和调节等功能进行操作以提高细胞活性的现代生物技术。主要用于有价值的化合物的研究和开发，在能源、原材料 、治疗用品的研究和开发等方面也起着重要的作用。运用于药物的研发是一个新兴的领域。,代谢工程(metabolic engineering),代谢工程超越了基因扩增和基因表达调控, 强调在整体水平对生物合成旁路的观察、代谢旁路的重建、热动力学的稳定性、代谢物转化的速率及其控制。这就将单个的酶反应转向了整体的代谢旁路和生物转化网络。,合成异源代谢产物 扩大底物利用范围 生产非天然的新物质, 如新型药物 降解环境有害物质 提高微生物对环境的适应能力 阻断或降低副产物的合成 提高代谢产物产率。,应用领域,金大米 从香叶基焦磷酸到b胡萝卜素的生物合成需要八氢番茄红素合成酶基因、植物八氢番茄红素脱饱和酶基因、胡萝卜素脱饱和酶基因和八氢番茄红素环化酶基因。,Ye(2000) 使用来自欧文氏菌的八氢番茄红素脱饱和酶基因（该基因能够同时承担植物八氢番茄红素脱饱和酶基因和胡萝卜素脱饱和酶基因的功能）替代了相应的两个基因，使得酶促反应步骤由4个减少为3个。,Bohmert等在拟南芥中同时表达了来自细菌的分别编码3-酮硫裂解酶(3-ketothiolase) 、乙酰乙酰辅酶A还原酶(acetacetyl-CoA reductase) 和PHA合成酶(PHA synthase)的三个基因，构建了PHB的生物合成途径，使得转基因拟南芥能够大量产生本来没有的PHB，叶片中的含量达到鲜重的4%(约为干重的40%)。,Slater等在拟南芥和油菜种子中表达上述三个基因的同时增加了一个来源于大肠杆菌的苏氨酸脱氨酶(threonine deaminase)基因，在植物中构建了新的生物合成代谢途径，使得拟南芥和油菜能够产生3-羟基丁酸酯与 3-羟基戊酸酯的共聚物 (poly 3-hydroxybutyrate-CO-3-hydroxyvalerate)。,生物塑料,代谢工程正被运用于涉及抗生素生物合成的代谢旁路的操纵。产生菌的生物化学和生理学的知识也提供了直接改变代谢的合理基础。有可能通过测量前体和中间产物的代谢流以及鉴别限速步骤以用作遗传操作的靶点。通过分析可将代谢流指向所需的代谢产物并消除不必要产物的生物合成。,以模式菌株S. lividans建立了一个代谢流分析模型，目标是阐明次级代谢产物碳源分布的关系，对初级碳代谢进行操作以提高其抗生素的产生。,A. 提高微生物药物的单位产量增加限速酶所编码的基因的拷贝数：增加限速酶的拷贝数可能增加抗生素的产量。,S. clavuligerus中自半胱氨酸，缬氨酸和赖氨酸产生头孢菌素C,自身抗性的增加意味着更多抗生素的生成，如将氨基糖甙类抗生素的抗性基因 氨基糖苷-6-N-乙酰转移酶基因转化至卡那霉素和新霉素产生菌，转化子对多种氨基糖甙类抗生素的抗性增加，而且卡那霉素和新霉素的产量提高了2-6倍。,引入抗性基因,表达放线紫红素的途径专一性调节基因act-orf4, 基因的拷贝数增加了2倍，而抗生素的产量增加了30-40倍。,调节基因的操纵 增加正调节基因的拷贝数阻断负调节基因,将道诺霉素生物合成的调节基因dnrR1 和dnrR2以高拷贝的形式转化至产生菌中，道诺霉素的中间体紫红霉酮的合成量提高了十倍。,S. avermitilis可产生抗寄生虫药物多组份的阿维菌素(avermectin)，其中B1是主要的活性成分。Ikeda等使用诱变技术获得了仅产B组份(B1a, B2a, B1b, B2b)的变株K2024, 和仅产A组份(A1a, A2a, A1b, A2b)的变株K2021。将这两亲本进行原生质体融合后，获得了只产B1a和 B2a 组份的融合株 K2038。,B. 阻断代谢旁路，增加有效成分的产量或改善组份的构成,进一步，他们利用转座子突变技术选择性地敲除 S. avermitilis 中毒性化合物寡霉素的生物合成基因，所得菌株只产生阿维菌素。,Formation of CHC-CoA in S. collinus,Genetic organization of the genes for the biosynthesis of CHC unit,C. 合理地设计产生有价值的天然产物的衍生物的生物合成旁路,CHC unit is used for the biosynthesis of Doramectin,不足之处不能提供或很少提供某些产物合成所需的前体物质 没有翻译后修饰,D. 构建能产生中间体或前体的基因工程菌,大肠杆菌(E. coli)是最常使用的表达系统:生长迅速(菌体倍增约为20分钟)，发酵设备简单，提取纯化容易，工艺成熟。,6-dEB为 Sac. erythraea 产生的红霉素的前体，原株中产量低,Sac. erythraea 和 E. coli相比较，发酵过程难以扩大化，菌体倍增时间长(4小时), 发酵和生产工艺需严格控制。,大肠杆菌系统中表达DEBS产生6-dEB,如何表达正确折叠和翻译后修饰的PKS。催化表达产生6-dEB的巨大的DEBS蛋白为两个相同的28个活性位点a2b2g2的二聚体, 有7个必需磷酸泛酰乙胺化的残基。E. coli 没有保证ACP的活性的磷酸泛酰乙胺化酶。 组成部件必需在E. coli 中有供应。6-dEB是由1个丙二酰CoA和7个(2S) -甲基丙二酰CoA (2S-mmCoA)作为骨架所组成的。E. coli 没有 (2S)- mm CoA 。 为保证产生有效的细胞内产生6-dEB的系统，DEBS在胞内的活力必须与前体的生物合成相适应, 以对相关的立体化学和动力学参数进行最优化。,产6-dEB的工程菌E. coli BAP1的构建,编码6dEB合成酶的质粒图,6-dEB的产量已达到红霉素工业菌株的生产水平,本实验的成功是生物学诸多技术的综合，它包含了对6-dEB分子水平的催化，对E. coli 基因组和生理功能的了解等，强调了学科交叉的重要性。,抗生素的产生菌大多是好氧的，因此为保证其生长和有效地产生抗生素，必须保证氧气的充足供应。在大规模的发酵种，常需要不断地添加氧气以满足细胞生长和代谢。然而在培养基中，氧气的溶解度低。工业上常通过改良生物反应器(如改变搅拌浆的形状，增加档板和搅拌功率）或增加通气量，但这些设备的要求高，能耗大。,E. 引入异源基因，改善培养和生产工艺,血红蛋白基因在放线菌中的应用,将从透明颤菌中考虑的血红蛋白基因(vhb) 转至天蓝色链霉菌发现，菌体可在限氧的条件下生长，而且其中放线紫红素的产量增加了十倍。,vhb在Sac. erythraea中表达，可将红霉素的产量提高60%。,将vhb基因转至头孢菌素产生菌中，不仅提高了工程菌对氧气的利用量，而且大幅度提高了抗生素的产量。,在好氧菌透明颤菌中发现血红蛋白为氧气携带者，能促进氧气扩散到细胞末端的氧化酶上，这使得细胞在缺氧状态下也可能良好生长。,以DNA改组为代表的体外定向进化(directed evolution),定向进化不需事先了解酶的空间结构和催化机制, 通过模拟自然进化机制, 以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法，在体外改造酶基因，定向选择有价值的非天然酶。短期内可以在试管中完成自然界需要几百万年的进化过程，是发现新型酶和新的生理生化反应的重要途径。,目的：增加酶的底物专一性、立体选择性、比活、稳定性、溶剂耐受性、增加pH范围，以及这些特性的组合。,The fundamental rule of directed evolution is you get what you screen forFrancis Arnold定向进化的根本规则是获得你希望通过筛选得到的突变体,在待进化酶基因的PCR扩增反应中, 利用Taq DNA多聚酶不具有35校对功能的性质, 配合适当条件, 以很低的比率向目的基因中随机引入突变, 构建突变库, 凭借定向的选择方法, 选出所需性质的优化酶, 从而排除其他突变体。,定向进化的一般原理,在定向进化中, 尽管突变具有随机性， 但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类， 降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。,定向进化 = 随机突变 + 选择,与自然进化不同, 定向进化是人为引发的，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。,DNA改组(DNA Shuffling)原理,DNA Shuffling 与常规定向进化的比较,错误倾向性PCR (Error-prone PCR) 外显子改组 (Exon shuffling) 点饱和突变 ( Saturation mutagenesis) 体外随机引发重组( Random priming in vitro recombination) 交错延伸( Staggered extension process) 区域化自我复制 ( Compartmentalized self replication) 体外随机定位诱变 (Random site-directed mutagenesis),部分类似的和发展的方法,酶的体外定向进化应用实例,改组的酶库较天然酶的一个优势在于前者可能含有后者经天然选择压力所不能表现出来的一些特性(或特性的综合)。如对有着很高商业价值的 Savinase 酶进行改组时，挑取了654个克隆研究如pH、热稳定性、溶剂稳定性等特征。发现12%的克隆在所有检测的特征中均有提高。,值得一提的是，有的克隆表现出了原株没有的特点。同时发现，热稳定性最佳的的嵌合株与其他的相比，在序列上并不比与起始的热稳定株更近。这提示根据酶的序列来选择起始改组的材料时必须慎重。,选择一个最接近人们需要的酶分子作为起点建立有效且灵敏的选择方法， 确保检测出功能变化,关键点：,与DNA改组相同，全基因组改组是美国Maxygen 公司(DNA改组发明人W.P.C.Stemmer为CEO)开发的一种新的菌株育种技术。,全基因组改组(Whole Genome Shuffling),全基因组改组可以说是经典的原生质体融合基础上的一个突破。与原生质体融合的重复操作不同，全基因组改组是在第一轮诱变后，选取多个而非单个高活性的菌株进行原生质体融合。后面的几轮也如法炮制。这样, 全基因组改组是有性的重复重组(Sexual recursive recombination), 而非简单原生质体融合的无性重复突变(Asexual recursive mutagenesis)。,Asexual vs. sexual evolution,全基因组改组与经典原生质体融合的比较: 泰洛菌素产量提高实验。研究发现一年、四轮、24,000次全基因组改组就达到了20年、106次经典的育种方法(化学突变和筛选)的效果。,一个菌种选育的新纪元正在出现，其中基因组学、蛋白质组学、代谢组学已经用来阐述基因和代谢旁路的相互作用。尽管传统的、经验的方法如随机诱变和选择等仍然是非常有效的(虽然它们很费时) ，基因组学可运用更加直接，理性的方法用来减少不必要、有害突变的引入。,基因组在应用于发酵过程来获得高产率、为得到新的化合物而创造新的旁路、提高产生菌的细胞生长和发酵的能力等方面有着巨大的潜力。,经典诱变 手段成熟，有许多成功的经验可以借鉴。 染色体的随机突变，筛选量大，效率低，可逆性强，周期长，分子水平的机理不清楚。,现代生物技术 基因水平的定向突变，目标明确，可设计， 机理清晰，筛选量少。仍处于发展时期。,经典诱变与理性菌种选育的比较,