第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术课件.ppt

天然药物化学,主讲人：赵雪梅,提取分离的方法与技术,提取分离的两种情况：,1、目的物为已知成分或化学结构类型,2、从天然药物中寻找未知有效成分或有效部位,研究有效成分的程序,提取 分离 鉴定,第一节 提取方法及技术,一、溶剂提取法,1、概念,根据天然药物中各种化学成分的溶解性能，选择对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，用适当的方法将所需化学成分尽可能完全的从药材组织中溶解提出的方法。,2、基本原理,（1）粉碎 （2）苷类 防止酶的水解,3、提取前的预处理,是在渗透扩散作用下，溶剂渗入药材组织细胞内部，溶解可溶性物质，造成细胞内外溶质的浓度差，从而带动溶质做不断往返的运动，直至细胞内外溶液中被溶解的化学成分的浓度达到平衡，提出所需的化学成分。,4、影响提取的因素,溶剂的选择、提取的方法、药材的粉碎度、温度、时间、浓度差等。,溶剂提取法的关键：选择合适溶剂的溶剂。,溶剂的选择：遵循“相似相溶”的规律，根据溶剂的极性，被提取成分及共存的其他成分的性质来决定，同时兼顾考虑溶剂是否使用安全、易得、廉价、浓缩方便等问题,5、溶剂的极性,常用溶剂的极性大小的顺序排列如下：,石油醚 苯 无水乙醚 三氯甲烷 乙酸乙酯 丙酮 乙醇 甲醇 水,表2-1 常用溶剂的介电常数,按极性大小顺序将溶剂的分类：,（1）水,（2）亲水性有机溶剂,（3）亲脂性有机溶剂,极性较大且能与水相互混溶的有机溶剂。 甲醇、乙醇、丙酮等。,极性较小，与水不能混溶的有机溶剂。 石油醚、苯、乙醚、三氯甲烷、乙酸乙酯等。,提取溶剂 性能特点 适宜提取成分 提取方法强极性溶剂 溶解范围广（酸水、碱水） 生物碱盐 穿透能力强 苷类 浸渍法 价廉易得、安全 鞣质 煎煮法 糖类 渗漉法 水 有些脂溶性成分溶解不完全 氨基酸 （酸水） 有些苷类成分的酶解 蛋白质 水提液易发霉、变质 水溶性杂质多，过滤困难 沸点高，浓缩困难,常用提取溶剂性能特点,提取溶剂 性能特点 适宜提取成分 提取方法 除去多糖、 溶解范围广（不同浓度乙醇）蛋白质外 渗漉法（稀醇） 水溶性杂质溶出少 的大多数 浸渍法 乙醇 可抑制酶的活性 化学成分 回流法 提取液不易发霉、变质 均可 连续回流法 大部分可回收利用 但有挥发性、易燃烧 甲醇 溶解特点与乙醇相似，但有毒 丙酮 溶解性能同乙醇，但沸点低、易挥发，作为提取溶剂不常用； 但对色素溶解性能好，在分离、精制时常用。 亲水性有机溶剂（和水可任意混溶）,提取溶剂 性能特点 适宜提取成分 提取方法 对化合物溶解选择性较强;水溶性杂质少、易纯化 ; 游离生物碱 回流法挥发性大、易燃烧、有毒 ; 苷元 连续回流法价格昂贵，对提取设备要求高; 某些苷类穿透力较弱，提取时间长;作为提取溶剂不常用。 如:乙醚 极易燃 氯仿 不易燃，毒性大,对生物碱溶解性好 苯 毒性大 石油醚 沸程 3060、6090、90120 脱脂、脱色常用 与甲醇、乙醇不能任意混溶。,亲脂性有机溶剂,【提取方法与技术】,（一）浸渍法,含义 将药材用适当的溶剂在常温或温热的条件下浸泡一定时间，浸出有效成分的一种方法。,操作技术 冷浸法 室温 温浸法 4060,适用范围 适用于有效成分遇热易破坏及含淀粉、果胶、黏液质、树胶等多糖物质较多的天然药物。,特点 方便、简单，时间长，效率低，易霉变提示 加防腐剂：甲苯、甲醛、三氯甲烷,（二）渗漉法,含义,操作技术 粉碎浸润装筒排气浸渍渗漉收集渗漉液,将药材粗粉置渗漉装置中，连续添加溶剂使渗过药粉，自上而下流动，浸出有效成分的一种动态浸提方法。,适用范围,适用于提取遇热易破坏的成分。,特点 因能保持良好的浓度差，效率高。 溶剂消耗多，时间长 提示 常温进行，溶剂为水、酸液、碱液及不同浓度的乙醇,（三）煎煮法,含义,将药材加水加热煮沸，滤过去渣后取煎煮液的一种传统提取方法。,操作技术,适用范围,适应于有效成分能溶于水且不易被水、热破坏的天然药物的提取。,特点 操作简单、效率高。提示 不宜用于提取含挥发油成分、遇热易 破坏、含糖类丰富的天然药物。,使用低沸点的溶剂如乙醇、氯仿等加热提取天然药物中有效成分时，为减少溶剂的挥发损失，保持药材与溶剂持久地接触，通过加热浸出液，使溶剂受热蒸发，经冷凝后变为液体流回浸出器，如此反复至浸出完全的一种热提取方法。,（四） 回流提取法,含义,适用范围,操作技术,适用于脂溶性较强成的分提取。,特点 效率高、溶剂消耗大，操作较麻烦。提示 不宜用于对热不稳定的成分的提取。,（五）连续回流提取法,含义 能用少量溶剂进行连续循环回流提取，充分将有效成分浸出完全的方法。,操作技术 常用索氏提取器,适用范围 适用于脂溶性成的分提取。,特点 效率高、溶剂用量少，不适用于对热不稳定的成分的提取。提示 更换溶剂。,（六）超声提取法,含义,是一种利用超声波浸提有效成分的方法。,基本原理,利用超声波的空化作用，破坏植物药材的细胞，使溶剂易于渗入细胞内，同时超声波的强烈震动能传递巨大能量给浸提的药材和溶剂，使他们做高速运动，加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，加速有效成分的浸出，极大地提高提取效率。,操作技术,适用范围,适应于遇热不稳定成分的提取，适应于各种溶剂的提取。,特点 时间短、效率高、 无需加热 。提示 要求高。,【知识链接】二、其他提取方法,（一）水蒸气蒸馏法,含义,基本原理,水蒸气蒸馏法是利用某些挥发成分与水或水蒸气共同加热，能随水蒸气一并蒸馏出，经冷凝后分取获得的性质， 从天然药物中提出的方法。,是当水和与水不相溶的液体成分共存时，根据道尔顿分压定律，整个体系的总蒸气压等于两个组分蒸气压之和。当总蒸气压等于外界大气压时，混合物开始沸腾并被蒸馏出来。 P总=PA+PB,操作技术,适用范围 适用于提取具有挥发性，能随水蒸气蒸馏出而不被破坏，不溶或难溶于水，与水不发生化学反应的天然药物化学成分。,特点 简单、方便、实用，宜推广提示 保温、与大气压相通后，关热源。 可再蒸馏,（二）升华法,含义 是利用某些固体物质具有在低于其熔点的温度下受热后，不经熔融就直接转化为蒸气，遇冷后又凝固为原来的固体的性质，使之从天然药物中提出的方法。,操作技术,适用范围 适用于具有升华性成分的提取。,特点 时间长、损失大，易炭化、分解。提示 水浴、油浴加热,（三）超临界流体萃取技术,超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction, SFE）是一种利用某物质在超临界区域形成流体，对天然药物中有效成分进行萃取分离的新型技术，集提取和分离于一体。,超临界流体：某物质处于临界温度（Tc）和临界压力(Pc)以上时，形成一种既非液体又非气体的特殊相态。,常用的超临界流体物质：二氧化碳、氧化亚氮、乙烷、乙烯和甲苯等。,1、概念,气体、超临界流体和液体的物理性质,【超临界流体特性】具有液体和气体的双重特性，如：密度与液体近似 ，黏度与气体近似，扩散力和渗透能均大大强于液体（扩散速度比液体快约两个数量级），对很多物质有很强的溶解能力。,2、基本原理 SF的溶解度直接与其密度相关，通过改变萃取压力和温度很容易改变SF的溶解能力3、操作技术 4、适用范围 适用于提取分离挥发油、脂溶性、高热敏性及易氧化分解成分。,超临界流体 最常见的是二氧化碳，其临界温度为(Tc =31.4)，临界压力为(Pc= 7.37 MPa),第二节 分离精制和鉴定的方法与技术,浓缩方法 蒸发 水提取液薄膜蒸发 水、稀醇提取液 蒸发器、冷凝管、真空泵蒸馏 常压蒸馏：低沸点有机溶剂提取液的浓缩回收 减压蒸馏：高沸点有机溶剂及有效成分遇热不 稳定的提取液的浓缩回收 旋转蒸发仪反渗透法、超滤法,一、系统溶剂分离法,含义 按极性由小到大的顺序选用不同极性的溶剂组成溶剂系统，依次提取分离提取液中各种不同的成分，使各溶解度有差异的成分得到分离。,操作技术,适用范围 适用于有效成分尚未明确的天然药物提取液的分离。,【特点】 操作繁琐【提示】 研究不明成分的方法,【知识链接】 溶剂系统及其提取分离成分,1、概念 是指往提取液中加入一种与其互不相溶的溶剂配成两相溶剂系统，利用混合物中各种成分分配系数的差异而将所需成分萃取出来的分离方法。2、基本原理 利用混合物中各种成分在两相不相溶的溶剂分配系数的差异而达到分离的目的,二、两相溶剂萃取法,分配系数 K=Cu/CL,分离因子 两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。 =KA/KB (注KAKB),3、萃取溶剂的选择,从水提液中萃取亲脂性成分： 一般选用苯、三氯甲烷或乙醚,萃取偏亲水性成分：需用乙酸乙酯、丁醇等,对于碱性、酸性、两性成分的萃取分离： 常用PH梯度萃取法 即利用混合物中各成分的酸（或碱）性强弱不同，相应改变溶剂PH值使之相继成盐或游离，改变成分在溶剂系统中的分配系数而与其他成分分离的一种方法。,（一）简单萃取法,提示1、水体液的浓度最好在相对密度1.1-1.2之间。,2、选用的萃取溶剂第一次用量一般为水提液的1/2-1/3， 以后的用量可适当减少为水提液的1/4-1/6。,3、一般萃取3-4次即可。,4、若用氯仿萃取，易产生乳化现象。5、形成乳化，破乳。,【适用范围】分配系数差异较大的成分的分离,（二）逆流连续萃取法,含义 利用两相互不相溶的溶剂相对密度的不同，使相对密度小的相液作为移动相（或分散相），逆流连续穿过相对密度大的作为固定相（或连续相）的相液，借以交换溶质而达到分离的一种连续萃取技术。,【适用范围】 适用于各种密度的萃取溶剂,（三）逆流分溶法,（四）液滴逆流分配法,【适用范围】 适用于分离中等极性、分离因子较小及不稳定的物质。,【适用范围】 适用于皂苷类化学成分的分离。,破坏乳化现象的方法放置较长时间,其他破坏乳化的物质如乙醇、黄化蓖麻油等,搅动,乳化层抽滤,将乳化层加热或冷冻,分出乳化层，再用新溶剂萃取,加入少量电解质（如氯化钠）,滴加数滴醇类如戊醇改变表面张力，破坏乳状液,三、沉淀法,含义 是指在天然药物的提取液中加入某些试剂，使产生沉淀或降低溶解性而从溶液中析出，从而获得有效成分或去除杂质的方法。,分类（一）酸碱沉淀法,是利用某些成分能在酸（或碱）中溶解，继而又在碱（或酸）中生成沉淀的性质达到分离的办法。,1、操作技术2、适用范围 酸性、碱性或两性化合物的分离。3、特点 沉淀反应可逆4、提示 分离生物碱、 内酯结构化合物 具酸性的化合物,（二）试剂沉淀法,含义 利用一些成分能与某些试剂产生沉淀的性质，或利用某些成分在不同溶剂中溶解度的差异，通过加入特定试剂或溶液，使生成沉淀，与其他成分分离。,1、操作技术2、适用范围 适用于能与某些试剂产生沉淀或在不同溶剂中溶解度有差异的化学成分的分离3、特点 沉淀反应可逆或不可逆,四、结晶与重结晶法,含义 利用混合物中各成分在溶剂中溶解度的差别，使所需成分以结晶状态析出，达到分离精制的目的分离方法。,结晶 将物质由非结晶状通过处理得到结晶状物的过程。,重结晶 将粗结晶用适当的溶剂处理纯化为较纯的结晶状物质。,1、结晶溶剂的选择,选择合适的溶剂是结晶法的关键。,溶剂具备条件1）不与结晶物质发生化学物质,2）对结晶物质的溶解度随温度不同有显著差异 热时溶解度大，冷时溶解度小,3）对杂质溶解度非常大或非常小,4）沸点适中,5）能给出较好的结晶,结晶法常用的溶剂有水、冰醋酸、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、氯仿等。,当不能选择一种合适的试剂时，通常选用两种以上溶剂组成的混合溶剂。,以两种能以任意比例互溶的溶剂组成，要求低沸点溶剂对被提纯物质的溶解度大，而高沸点溶剂对被提纯物的溶解度小。,3、结晶的条件,杂质的去除,有效成分的含量,溶液的浓度,合适的温度、时间,3、结晶纯度的判断,1）晶形和色泽,2）熔点和熔距,3）纸色谱或薄层色谱技术,4）高效薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱,4、操作技术,1）制备结晶溶液。,2）趁热过滤，除去不溶性杂质。,3）将滤液放冷，使析出结晶。,4）抽气滤过，将结晶从母液中分出。,5）重结晶,6）晶体的干燥 红外灯烘干 真空恒温干燥器干燥,5、适用范围 适用于分离纯化固体化学成分6、特点 分离纯化固体成分的重要方法之一。7、提示 选择合适的溶剂 注意结晶条件,五、透析法,含义 利用提取液中小分子物质可通过透析膜，而大分子物质不能通过透析膜的性质使分子量差异较大的物质达到分离的方法。1、操作技术2、适用范围 适用于分离纯化天然药物化学成分中的大分子物质3、特点 操作简单、分离较完全4、提示 关键是膜孔的选择,六、分馏法,含义 利用各沸点不同的化合物组成混合物，在分馏过程中产生高低不同的蒸气压，从而收集到不同沸点温度的馏分，达到分离的目的的方法。1、操作技术2、适用范围 适用于分离纯化天然药物中沸点相差较小的液体混合物。,3、特点 操作简单、加热可破坏某些成分4、提示 保持柱内适当的温度梯度，严格控制热源的温度。,七、色谱法,基本原理,利用混合物中各成分在固定相和移动相中吸附、分配及其亲和力的差异而达到分离。,分类,按固定相和支持剂种类:氧化铝色谱、硅胶色谱、 聚酰胺色谱、凝胶色谱等。,按移动相种类：气相色谱、液相色谱。,按操作方式：柱色谱、纸色谱和薄层色谱。,按色谱原理：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、 凝胶色谱等。,表2-3 被分离化合物与相应选择的色谱方法,1、吸附柱色谱法,利用作为固定相的吸附剂对混合物中各成分吸附能力的大小不同，使各成分得到相互分离的方法。,（1）基本原理： 相似者易于吸附,（2）吸附剂： 硅胶：是一种微呈酸性的多孔性物质。常用SiO2xH2O表示。能与许多化合物形成氢键而产生吸附作用。 适用于分离中性或酸性亲脂性成分的分离。,（一）柱色谱法,氧化铝：是一种吸附性很强的亲水性吸附剂，有酸性、碱性、中性三种规格。 适用于分离碱性或中性的亲脂性成分。,聚酰胺：是由酰胺聚合而成的一类高分子化合物。,基本原理 聚酰胺分子内存在的许多酰胺基能与酚类的羟基、酸类的羧基及醌类的醌基形成氢键而产生吸附。,图2-14 聚酰胺吸附色谱的原理,聚酰胺对化合物吸附里的强弱取决于形成氢键的能力，影响形成氢键能力的因素：, 溶剂的种类：聚酰胺形成氢键的能力在水中最强，在有机溶剂中较弱，在碱性溶剂中最弱。,常用溶剂的洗脱能力顺序：,水甲醇或乙醇丙酮稀氢氧化钠或稀氨溶液甲酰胺或二甲基甲酰胺尿素水溶液, 化合物分子结构：,A 化合物分子能形成氢键的基团数目越多，被聚酰胺吸附越强。,B 成键基团所处的位置不同，被吸附的强弱也不同。,C 分子中芳香核、共轭双键多者被吸附强度大，少者则被吸附强度小。,D 能形成分子内氢键者被吸附强度减小。,适用于化合物的制备性分离、除鞣质。, 活性炭：是一种非极性吸附剂,影响吸附能力的因素：,A 在水溶液中吸附力最强，在有机溶剂中较弱。,B 对极性基团多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物。,C 对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物。,D 对分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。,适用于分离亲水性成分（大量制备性分离）。,3、移动相,4、被分离物质,溶剂和吸附剂的选择：,若被分离物质的极性较大，可选用活度较低的吸附剂，而移动相的极性较大；若被分离物质的极性较小，可选用活度较高的吸附剂，而移动相的极性较小。,常见官能团极性大小顺序：,1）选择色谱柱内径与柱长之比 1151 202）装柱 吸附剂粒度 均匀 100目 用量 试样 吸附剂 130 160 11001200,（5）操作技术,柱色谱装置,【装柱】,干法湿法,3）上样,湿法上样：易溶性的试样用洗脱剂溶解加样干法上样：难溶性的试样加低沸点的极性有机溶剂再与吸附剂拌匀，挥干溶剂加样,4）洗脱,梯度洗脱，等份收集,（6）特点（7）适用范围（8）提示 聚酰胺吸附剂与试样用量 110 120 洗脱剂为含水溶剂系统：以水装柱，用水、乙醇（从低到高）依次洗脱洗脱剂为非极性溶剂系统：以系统中极性较低的溶剂装柱。,2、分配色谱法,利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数的不同，来达到分离的色谱分离方法。,（1）基本原理 分配系数的不同，达到分离,（2）支持剂 硅胶、硅藻土、纤维素粉、滤纸。 反相分配色谱：-C18H37 ， -C8H17 ， -C2H5键合硅胶正相分配色谱：硅胶表面键合氨基或腈基,（3） 溶剂系统 复合两相溶剂系统 ； 纸色谱摸索；,（4） 被分离物质 正相分配色谱 极性较小的成分移动速度快； 反相分配色谱 极性较大的成分移动速度快；,（5）操作方式 装吸着固定相的支持剂装入柱内； 用适量固定相溶解试样； 固定相饱和后的移动相洗脱；1）装柱 固定相与支持剂用量0.51112）加样 支持剂用量为试样量的1001000倍3）洗脱 （8）提示 必须固定相与移动相预饱和 温度恒定 合理控制上样量,3.离子交换柱色谱法,含义 是利用离子交换树脂上的功能基在水溶液中与溶液的其他离子进行可逆性交换的性质，以离子交换树脂作为固定相，使混合成分中离子型与非离子型物质或具有不同解离度的离子化合物得到分离的一种色谱法。,（1）基本原理阳离子交换树脂,阴离子交换树脂,（2）离子交换树脂的选择 电荷种类、解离能力、分子大小与数量 交换容量、颗粒大小,（3）操作方式： 1）树脂的预处理阳离子交换树脂： 按酸-碱-酸的步骤 阴离子交换树脂： 按碱-酸-碱的步骤,（4）特点 （5）适用范围 具有解离能力的化合物 （6）提示 试样用量 交换容量决定,2）装柱 3）上样 4）洗脱 5）再生,4、凝胶滤过柱色谱法,含义 是以凝胶为固定相，选择适当的溶剂进行洗脱，使混合物中分子量大小不同的化合物得到分离的方法。,（ 1）基本原理,（ 2）凝胶的种类及性能,1）葡聚糖凝胶,2）葡聚糖凝胶LH-20,3）聚丙烯酰胺凝胶,4）琼脂糖凝胶,（ 3）操作方式,1）凝胶的选择 2）浸泡溶胀 3） 装柱,4）加样 5）洗脱 6）再生（4）特点（5）适用范围 大小分子化合物的分离（6）提示,大孔吸附色谱法 不含交换基团，具有大孔结构的有机高聚物吸附剂。,1、基本原理 吸附性能及分子筛作用。,2、影响分离的因素,（1）树脂本身的化学结构,（2）被分离成分的性质,（3）溶剂的影响,（二）薄层色谱法,具体操作： 制板、活化： 点样： 展开：上行、下行、近水平、环形、单向二次、双向二次 显色：紫外线照射法、喷雾显色法、碘蒸气显色法 测定比移值。,Rf值=原点至色谱斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离,（三）纸色谱法 是以滤纸为支持剂 ，滤纸上吸着的水为固定相，用一定的溶剂系统为移动相进行展开，而使试样中各组分达到分离的一种分配色谱法。,具体操作：点样、展开、显色、计算比移值,（四）高效液相色谱法,高效液相色谱法（HPLC）又称高压液相色谱、高速液相色谱法,（1）基本原理 根据被分离物质中各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子量大小的差异而获得分离。,（2）操作技术（3）特点：高压、高速、高分离效能、高灵敏度、操作自动化、检测范围广。,（4）适用范围 广泛（5）提示 色谱纯度,（五）气相色谱法,气相色谱法是一种以气体作为流动相的色谱分离方法。,（1）基本原理 利用混合物中各组分在气体与固定相之间吸附能力的不同或分配系数的差异而获得分离。,（2）操作技术（3）特点：效率高、分析速度快、试样用量少、选择性好、应用范围广,（4）适用范围 适用于具有沸点低、易挥发特性的挥发油成分的分离、鉴定和定量分析。（5）提示 色谱纯度,