第七章 微生物遗传变异与育种课件.ppt

第七章 微生物遗传变异与育种,第一节 遗传变异的物质基础第二节 基因突变和诱变育种第三节 基因重组和杂交育种第四节 基因工程第五节 菌种的衰退、复壮与保藏,1. 遗传与变异的基本概念,遗传(heredity):亲代生物的性状在子代得到表现;亲代生物传递给子代实现与其相同性状的遗传信息.特点:具稳定性.,基因型(genotype):指一生物体全部基因的总和;是一种内在可能性或潜力.,表型(phenotype):生物体所有外表特征和内在特性的总和; 是具一定基因型的生物在一定条件下所表现出的具体性状.,变异(variation):生物体在外因或内因的作用下,遗传物质的结构或数量发生改变.变异的特点:a.出现几率极低 b.变化幅度大; c.新性状稳定,可遗传.,饰变(modification):指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化.特点:每个个体都发生同样变化; 性状变化幅度小; 不遗传.引起饰变的因素消失后, 可恢复.,第一节 遗传变异的物质基础,主要的遗传物质DNA的特点:, 分子结构相对稳定, 能够自我复制, 前后代保持一定连续性, 指导蛋白质的合成,控制新陈代谢过程和性状, 产生可遗传的变异,2.1 DNA作为遗传物质的实验证据之一 肺炎链球菌的转化现象,1928年，格里菲斯(Griffith)以肺炎链球菌为研究对象，发现了S型菌株和R型菌株发生转化的现象。,1944年，艾维里(Avery)通过进一步的转化实验弄清楚了Griffith实验中的转化因子的实质。,1928年，Griffith进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活RII菌或死SIII菌 小鼠存活对小鼠注射活SIII菌小鼠死亡对小鼠注射活RII菌和热死SIII菌 小鼠死亡 抽取心血 分离 活的SIII菌,一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验,（一）经典转化实验（transformation）：F.Griffith，研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌）SIII型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性RII型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性,（2）细菌培养实验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,热死SIII菌不生长活 RII 菌长出RII菌热死SIII菌长出大量RII菌和10-6SIII菌,活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,+活RII菌,平皿培养,肺炎链球菌体外转化实验,2.2 DNA作为遗传物质的实验证据之一 E.coli噬菌体T2的感染实验,1952年,侯喜(A.D.Hershey)和蔡斯(M .Chase)用同位素示踪法研究了大肠杆菌噬菌体T2的感染过程。,噬菌体感染实验,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,沉淀中含85%放射性,以32P标记DNA做噬菌体感染实验,以35S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,2.3 RNA作为遗传物质的实验证据 烟草花叶病毒(TMV)的重建实验,1956年,H .Fraenkel-Conrat用含RNA的TMV所作的著名的植物病毒重建实验证明TMV的主要感染成分是其核糖核酸RNA。,病毒重建实验示意图(引自Klug and Cummings，2000),3、病毒重建实验,（一）核酸存在的七个水平及质粒细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞核水平: 原核与真核生物的细胞核结构不同染色体水平: 倍性(真核)和染色体数核酸水平：在原核中染色体水平、存在部分二倍 体DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录翻译密码子水平：信息单位,起始和终止,核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基,代表性生物体内基因组大小,微生物基因组,基因组(genome):某一物种的单倍体的所有染色体上遗传物资的总称。,由配子发育而成的个体叫做单倍体(haploid)；由受精卵发育而成的个体叫做二倍体(diploid),密码子水平,核苷酸是最小突变单位和交换单位,核苷酸水平,原核微生物核外遗传物质,质粒（plasmid）： 游离于染色体外，具有自主复制能力的小型共价闭合环装DNA分子。,提取所有胞内DNA后电镜观察,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察,对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。,质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的 机能，从而使宿主得到生长优势。,质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应,致育因子（Fertility factor，F因子）抗性因子（Resistance factor，R因子）产细菌素的质粒(Bacteriocin production plasmid）毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒（Metabolic plasmid）隐秘质粒（cryptic plasmid）,质粒的主要类型,1)致育因子(F因子)由于这种质粒还可以整合到细菌染色体上，成为染色体的一部分，又叫作附加体。F质粒整合到宿主细胞染色体上的菌株叫Hfr.,携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）,环形的F因子主要包括 四个部分：原点，转移的起点；形成性伞毛的基因；DNA复制酶基因；插入序列，与插入到细 菌染色体的过程有关。,2)抗性因子（R因子）包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。R因子一般由相连的二个DNA片段组成。一是RTF质粒 （抗性转移因子），它含调节DNA复制和转移的基因；二是抗性决定质粒，含有抗性基因。,R因子的特征：,1）能自行重组，即来自两种不同耐药菌株的R因子基因整合在一起，构成多重耐药菌株2）R因子也能借助性纤毛进行接合而传递,而且R因子和F因子之间也能发生重组3）R因子不能整合到核染色体上4）由相连的RTF质粒和抗性决定基因组成,R因子的结构组成,大肠杆菌产生的细菌素为大肠杆菌素(colicins),而产生这种细菌素的质粒被称为Col质粒。,通过抑制复制、转录、翻译或能量代谢等而专一性地杀死近缘且不含Col质粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素的影响，质粒本身编码一种免疫蛋白，从而使宿主对大肠杆菌素有免疫作用。,作用机理：,3)产细菌素的质粒(Bacteriocin production plasmid),4）Ti质粒（诱癌质粒）的结构及特点,环状dsDNA,160-250kb，六个功能区致瘤区：合成植物生长素和细胞 分裂素冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解质粒转移区(tra)：参与不同农杆 菌中的接合转移毒（性）区：参与T-DNA的转移和 插入植物染色体DNA复制区：参与Ti 质粒DNA复制,5) 代谢质粒（Metabolic plasmid）,质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。,将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。,降解质粒：,巨大质粒：又叫共生质粒。发现于根瘤菌属中的一些成员，质粒上有一系列固氮基因。,6) 隐秘质粒（cryptic plasmid）,隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。,质粒的特性,质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。质粒的稳定性 正常条件下质粒在细胞分裂前复制，其特殊的分配机制以保证其在子代细胞中的均等分配，从而实现质粒遗传的稳定。,质粒作为载体的优点,1、体积小，便于DNA的分离与操作2、呈环状，使其在化学分离过程中能保持性能稳定。3、有不受核基因组控制的独立复制起始点。4、拷贝数多，使外源DNA可很快扩增。5、存在抗药性基因等选择性标记。,质粒的类型,严谨型质粒(stringent plasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数松弛型质粒(relaxed plasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数,窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)：只能在一种特定的宿主细胞中复制,广宿主范围质粒(broad host range plasmid)：可以在许多种细菌中复制,第二节 基因突变和诱变育种,基因突变,指遗传物质本身发生根本的变化。广义的突变包括染色体变异和基因突变或点突变。狭义的突变单指基因突变,它是指一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变。,自发突变 环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致,一般频率较低，通常为10-6-10-9 。,诱发突变 人们利用某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。,基因突变的特征,不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。,自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。,稀有性：突变率低且稳定。,独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。,可诱发性：诱变剂可提高突变率,一般可以将突变率提高10105倍。,可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutation），从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（back mutation或reverse mutation）。,稳定性：变异性状稳定可遗传。,突变类型,按方法分：按突变株的表型是否能在选择性培养基 上加以鉴别来区分,基因突变自发性和不对应性的实验证明,三个经典实验变量实验涂布实验影印实验,证明：1、突变是自发产生的 2、突变的性状与引起 突变的原因间无直 接对应关系。,1、变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria and Max Delbruck（1943）,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,突变率：每个细胞在每世代中某性状的突变几率。,2、Newcombe的涂布实验（1949）,3、影印实验,Joshua Lederberg,Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,1、诱发突变的原因,（1）碱基的置换 （2）移码突变：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误 （3）染色体畸变：缺失、重复、插入、易位、倒位,2、自发突变的原因（1）背景辐射（2）有害产物积累（3）碱基错配,* 突变机制,1、碱基的置换：也称点突变。指一对碱基被另一对碱基所替代。分类 转换：嘌呤置换嘌呤，嘧啶置换嘧啶 颠换：嘌呤置换嘧啶，嘧啶置换嘌呤2、移码突变：诱变剂使DNA分子中的核苷酸插入或缺失，从而使该部分后面的遗传密码发生转录和转译错误的突变。3、染色体畸变：DNA较大的损伤，包括染色体结构上的缺失、插入、易位、倒位以及染色体数目改变。,紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶,嘧啶二聚体,UV,1、光复活作用,嘧啶二聚体,光解酶,2、切除修复（暗修复作用）需要内切、外切、聚合以及连接酶共同作用。,嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多,胸腺嘧啶二聚体,嘧啶的紫外线光化产物,胸腺嘧啶二聚体的修复,光复活作用,微生物等生物的细胞内存在光复活酶,光复活酶识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物,打开二聚体,将DNA复原。,可见光光能(300-500nm)激活光复活酶,此时的光复活酶没有活性,PRE为光复活酶,暗修复作用,一种不需要光激活的修复体系。,可修复由紫外线、射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。,切开二聚体的5-末端,形成3- OH和5-P的单链缺口,从5-P到3-OH方向切除二聚体,并扩大缺口,以另一条互补链为模板,从原有链上暴露的3-OH 端起合成缺失片段,将新合成链的3-OH与原链的5-P相连接,突变结果,错义突变:使所表达的蛋白质中一种氨基酸的位置上,变成另一种氨基酸.,无义突变:正常翻译为氨基酸的碱基置换后变成UAG(琥珀突变)、UAA(赫石突变)或UGA(乳石突变)等终止密码子,造成多肽链合成的中止.,同义突变:碱基发生了置换,但由于遗传密码子的简并性,而并没有影响原来的氨基酸顺序.如密码子GCU置换成GCC后,它们都是丙氨酸的密码子.,基因突变的类型（根据遗传信息的变化）,原序列 5-AUG CCU UCA AGA UGU GGG Met Pro Ser Arg Cys Gly(1)同义突变 5- AUG CCU UCA AGA UGU GGA Met Pro Ser Arg Cys Gly(2)错义突变 5- AUG CCU UCA GGA UGU GGA Met Pro Ser Gly Cys Gly(3)无义突变 5- AUG CCU UCA AGA UGA GGA Met Pro Ser Arg(4)移码突变 5-AUG CCU UCA AGU GUG GG Met Pro Ser Ser Val,第三节 基因重组和杂交育种,基因重组（gene recombination）是两个独立基因组内的遗传基因，通过交换与重新组合形成新的稳定基因组的过程。,基因重组,原核微生物 通过转化、接合和转导完成基因重组,真核微生物 有性繁殖 染色体高频率重组。,部分真菌 有丝分裂（准性生殖）低频率基因重组的方式。,细菌基因重组的方式,原核生物的基因重组,接合：细胞与细胞的直接接触(由F因子介导),转导：由噬菌体介导,自然转化：游离DNA分子 + 感受态细胞,原生质体融合,1、转化：（transfrmation）受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部分新遗传性状的现象。,细菌的遗传转化(genetic transformation),定义:同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取,并得到表达的水平方向的基因转移过程。包括自然遗传转化和人工转化两种转化方式。,2、转导：（transduction）以噬菌体为媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使受体细胞获得供体细胞的部分遗传性状的现象。分类：普遍转导 局限转导 溶源转变,低频转导高频转导,完全普遍转导流产普遍转导,普遍转导：完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段“误包”，实现遗传性状的传递至受体菌的转导现象。,局限转导：通过部分缺陷噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。特点:1.只转导供体菌个别特定基因 2.由部分缺陷的噬菌体携带 3.低频“误切”或双重溶源菌裂解产生缺陷噬菌体,（鼠伤寒沙门氏菌）,普遍转导,局限转导,普遍性转导与局限性转导的区别,溶源转变与转导的本质差异：1、溶源转变温和噬菌体不携带来自供体菌的外源基因2、新性状来自于噬菌体本身的基因3、温和噬菌体是完整的，无缺陷4、新获得的性状随噬菌体消失而消失,溶源转变：温和噬菌体感染宿主使其溶源化，噬菌体基因整合到宿主核基因上，使其获得除免疫性以外的新性状的现象。,3、接合：供体菌通过性菌毛与受体菌接触，并传递不同长度的单链DNA给受体菌并在其细胞中进行双链化或与核染色体发生交换、整合，使受体菌获得供体菌遗传性状的现象。多在细菌和放线菌中存在结合现象。,4、原生质体融合： 通过人为的方法，将遗传性状不同的两个原生质体发生融合，进而发生遗传重组以产生同时携带双亲性状、遗传稳定的融合子的过程。,真核微生物的基因重组,真核微生物的基因重组的方式有性杂交：一般指性细胞之间的结合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。准性杂交：同种生物的两个不同的体细胞发生融合，以有丝分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子的杂交方式。,第四节 基因工程 (自学）第五节 菌种的衰退、复壮与保藏,菌种的衰退（degeneration）：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象。菌种的生产性状是不进则退的。 表现：1、菌落和细胞形状改变 2、生长速度减缓 3、代谢产物生产能力下降 4、抗不良环境条件能力减弱,采用有效的菌种保藏方法。,防止菌种衰退的方法：,控制传代次数减少移种和传代的次数减少自发突变的几率。,选择合适的培养条件,采用不同类型的细胞进行传代对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种；,菌种的复壮：使衰退的菌种恢复原来优良性状态。,狭义：菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施。,广义：菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。,淘汰已衰退的个体：采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。,菌种的复壮措施：,纯种分离：平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等。,通过寄主体内生长进行复壮：接种到相应宿主体内以提高其致病性,前提：鉴别菌种衰退与杂菌污染,采用有效的菌种保藏方法。,菌种保藏：,目的：存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种,原理： 选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）,菌种保藏的方法,石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。,干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。,低温保藏法方法：菌种管置4冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。,真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。,液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中(-196)。适用于各种微生物的较理想的保藏方法,菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。,国内外菌种保藏机构：,菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL） 中国武汉大学微生物菌种保藏中心(CCTCC) 德国国家菌种保藏中心(DSMZ) 荷兰微生物菌种保藏中心(CBS),干法保藏菌种的方法,几种常用菌种保藏方法的比较,Thank you!,