第七章 微生物的遗传与变异课件.ppt

上章教学回顾,第六章 微生物的生长及其控制6-1 测定生长繁殖的方法6-2 微生物的生长规律6-3 影响微生物生长的主要因素6-4 微生物培养法概论6-5 有害微生物的控制,一、测生长量二、计繁殖数,一、温度二、氧气三、pH,一、微生物的个体生长和同步生长二、单细胞微生物的典型生长曲线三、微生物的连续培养四、微生物的高密度培养,一、实验室培养法二、生产实践中培养微生物的装置,一、几个基本概念二、物理灭菌和消毒的代表高温三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,第七章 微生物的遗传与变异,教学目的与要求了解微生物的遗传变异的物质基础，掌握原核微生物与真核微生物的基因重组和突变，熟悉基因工程的基本操作和菌种保藏原理二、 教学内容：1、遗传变异的物质基础（）2、基因突变和诱变育种（）3、基因重组和杂交育种（）4、基因工程5、菌种的衰退、复壮和保藏,遗传( heredity,inheritance)是指上一代生物将自身的一整套遗传基因稳定地传递给下一代的行为或功能，具有极其稳定(保守)的特性。遗传型(genotype)又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组(genome)所携带的遗传信息。,遗传和变异的几 个基本概念,遗传型(可能性),+,环境条件,表型(实现性),代谢、发育,表型(phenotype)是指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现，是一种具体性状。,变异(variation)指生物体在某种外因或内因的作用下所引起遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。特点：在群体中只以极低的几率(一般10-510-10)出现；性状变化幅度大；变化后的新性状是稳定的、可遗传的和不可恢复的。饰变(modification)指外表修饰性改变，是一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点：是整个群体中的几乎每一个体都发生同样变化；性状变化的幅度小；因其遗传物质未变，故饰变是不遗传的和可恢复的。如Serratia marcescens(粘质沙雷氏菌，旧称“神灵色杆菌”)。,遗传和变异的几 个基本概念,微生物因其独特的生物学特性而成为模式生物物种与代谢类型的多样性个体的体制极其简单营养体一般都 是单倍体易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖繁殖速度快易于积累不同的中间代谢物或终产物菌落形态的可见性与多样性环境条件对微生物群体中各个体作用的直接性和均一性易于形成营养缺陷型突变株各种微生物一般都 有其相应的病毒存在多种处于进化过程中、富有特色的原始有性生殖方式,遗传和变异的几 个基本概念,第一节 遗传变异的物质基础,种质连续理论：18831889年间德国A.Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物（种质）。基因学说：1933年摩尔根（Thomas Hunt Morgan）发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。但染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的3个著名实验的论证才使人们普遍接受核酸尤其是DNA才是真正的遗传物质。,第一节 遗传变异的物质基础,一、3个经典实验一)经典转化实验最早：1928年英国的F.Griffith，以S.pneumoniae(肺炎链球菌) 作研究对象。,肺炎链球菌,S型：,R型：,具荚膜，菌落表面光滑，为致病株,不形成荚膜，菌落外观粗糙，非致病株,结论：加热杀死的S型细菌，在其细胞内可能存在一种具有遗传转化能力的物质，它能通过某种方式进入R型细胞，并使R型细菌获得表达S型荚膜性状的遗传特性。,1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M.McCarty从热死S型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：,（1）动物试验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,热死SIII菌不生长活 RII 菌长出RII菌热死SIII菌+活RII菌长出大量RII菌和10-6SIII菌,活RII菌+SIII菌无细胞抽提液长出大量RII菌和少量SIII菌,平皿培养,平皿培养,平皿培养,（2）细菌培养实验,转化试验示意对照P190动物试验,混合培养,RII型活菌,SIII型活菌,SIII型热死菌,RII型活菌,SIII型活菌,健康,健康,健康,健康,健康,健康,健康,病死,病死,病死,活R菌,长出S菌,只有R菌,离体转化试验：1）从活的S菌中抽提各种细胞成分) 对各种生化组分进行转化试验,只有S型细菌的DNA才能将S. pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。有力地说明S型菌株转移给R型菌株的决不是遗传性状（有无荚膜）本身，而是DNA遗传因子。,加S菌DNA加S菌DNA及DNA酶以外的酶加S菌的DNA和DNA酶加S菌的RNA加S菌的蛋白质加S菌的荚膜多糖,二）噬菌体感染实验,A. D. Hershey和M. Chase， 1952年进行首先把E.coli培养在以放射性32PO43-或35SO42-作为磷源或硫源的组合培养基中，从而制备出含32P-DNA或含35S-蛋白质的噬菌体接着，进行了两组实验（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含15%放射性,沉淀中含85%放射性,沉淀中含25%放射性,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含75%放射性,二）噬菌体感染实验,结果：在噬菌体感染过程中，其蛋白质外壳根本未进入宿主细胞。进入宿主细胞虽只有DNA，但却有自身的增殖、装配能力，最终会产生一大群完整子代噬菌体。结论：证实DNA是噬菌体的遗传物质，在DNA中，存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。,三）植物病毒的重建实验,为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。方法：将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出完整的TMV粒子。选用了HRV（霍氏车前花叶病毒）与TMV进行了如下拆分与重建实验：,实验方法A：RNA（TMV） 蛋白质（HRV）B：RNA（HRV） 蛋白质（TMV）用两种杂合病毒感染烟草：A:表现TMV的典型症状并分离到正常TMV粒子B:表现HRV的典型症状并分离到正常HRV粒子。结论：在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸(RNA),TMV HRV,HRV TMV,拆分,重建,核酸的特性及复制方式(补充)1、核酸的化学组成和结构,第一节 遗传变异的物质基础,2、核酸的特性温度升高导致双链的解链（变性），当温度缓慢降低时被解链的DNA能够重新配对（复性），不同来源的DNA之间碱基序列互补的区段也能够进行碱基配对（退火或杂交）。,二、遗传物质在细胞内存在的部位和方式核酸存在的七个水平细胞水平：大部分DNA都集中在细胞核或核区中，数目1-2个。细胞核水平：核染色体组（核基因组或基因组）和核外染色体。染色体水平：染色体数和染色体倍数（单倍、双倍）核酸水平：核酸种类、核酸结构、DNA长度基因水平：具有特定核苷酸序列的核酸片段（遗传功能单位）密码子水平（遗传信息单位）遗传密码是指DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸顺序。其信息单位是密码子。每一密码子由3个核苷酸序列即1个三联体组成。核苷酸水平（核苷酸单位或碱基单位）最低突变单位或交换单位,第一节 遗传变异的物质基础,掌握几个有用的数据：每个碱基对（pb）的平均相 对分子质量约为650；1106的dsDNA约为1.5kb或0.5m;3nmol碱基的重量约等于1g。多数细菌的基因组为19Mb,第一节 遗传变异的物质基础,二、遗传物质在细胞内存在的部位和方式1、细胞核水平1）在原核细胞中染色体DNA(核染色体)：在核区内，双链，环状或线状，无组蛋白；染色体外DNA(核外染色体):质粒(F 质粒、R质粒、Col质粒、Ti质粒、Ri质粒、mega质粒和降解质粒)2）在真核细胞中核DNA：在细胞核内与组蛋白结合成核小体；核外DNA：细胞质基因(包括线粒体和叶绿体基因等)；共生生物（如卡巴颗粒）；2m质粒(酿酒酵母的在核内)等。,原核生物的质粒,1、定义典型质粒：凡游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA(cccDNA)分子。线形质粒2、特点具有麻花状的超螺旋结构，大小一般为1.5300kb。携带某些核基因组上所缺少的基因，使细菌等原核生物获得了某些对其生存并非必不可少的特殊功能。复制类型有严紧型复制控制和松弛型复制控制两种。含质粒的细胞在正常的培养基上受吖啶类染料、丝裂霉素C、紫外线、利福平等因子处理后，会发生质粒消除。具有与核基因组整合与脱离功能，这类质粒又称为附加体。质粒与质粒间，质粒与核染色体间发生基因重组。,原核生物的质粒,3、质粒在基因工程中的应用优点体积小，便于DNA的分离和操作；呈环状，使其化学分离过程中能保持性能稳定；有不受核基因组控制的独立复制起始点；拷贝数多，使外源DNA 可很快扩增；存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克隆的检出和选择（如E.coli 的pBR322质粒）4、质粒的分离与鉴定分离：细胞的裂解、蛋白质和RNA去除以及质粒DNA与染色体DNA分离。鉴定：电镜、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳及密度梯度离心法。,第一节 遗传变异的物质基础,二、遗传物质在细胞内存在的部位和方式2、基因水平： 是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位，其物质基础是一条以直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片断。由众多的基因构成了染色体。以原核生物为例：,基因调控系统,操纵子,启动基因(启动子),调节基因,操纵基因,结构基因,DNA链,R,A,mRNA,B,mRNA,C,mRNA,O,a,b,c,蛋白质,第一节 遗传变异的物质基础,二、遗传物质在细胞内存在的部位和方式2、基因水平：真核生物的基因与原核生物的基因最明显的不同是它们一般无操纵子结构，存在着大量不编码序列和重复序列，转录和转译在细胞中有空间分隔，以及基因被许多无编码功能的内含子阻隔，从而使编码序列变成不连续的外显子状态。,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变简称“突变”。是变异的一类，泛指细胞(病毒粒)内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。狭义的突变专指基因突变(点突变)；广义的突变则包括基因突变和染色体畸变。野生型菌株：简称野生型，指从自然界分离到的菌株。突变株(变异体、变异型)野生型经突变后形成的带有新性状的菌株。,（一）突变类型,突变株的表型,选择性突变株,非选择性突变株,营养缺陷型(株),抗性突变型(株),条件致死突变型(株),形态突变型(株),抗原突变型(株),产量突变型(株),依表型的改变分为：营养缺陷型因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸等生物合成酶的能力，因而无法再在基本培养基上正常生长繁殖，而必须在基本培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性，它们可在加有相应药物或用相应物理因子处理的平板上选出条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，并呈现其固有的表型，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型形态突变型由突变引起的个体或菌落形态的变异抗原突变型因突变而引起的细胞抗原结构发生改变产量突变型因突变而要代谢物产量上明显有别于原始菌株。,（一）突变类型,每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。也可用某一单位群体在每一世代中产生突变株的数目来表示。突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。因此，在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性突变株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的回复突变株（back mutant或reverse mutant）或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定。,（二）突变率,（二）突变率,基因符号 基因的名称用其英文单词的头3个小写英文字母表示，且应排成斜体字（书写时可在其下划一底线区别）。同一基因的不同基因突变则在3个英文小写字母后加一个正体大写字母或数字表示。如hisA、hisB代表组氨酸的A、B基因。在基因名称右上方可用不同符号表示微生物的突变型:his+、his-分别表示组氨酸原养型和缺陷型， gal+、gal-分别表示能发酵半乳糖和不能发酵半乳糖 strS、strR分别表示对链霉素敏感和具有抗性蛋白质（基因表达产物）的符号用其英文单词的头3个大写英文字母（或1个大写，2个小写）表示，且应排成正体字,（三）突变的特点,1.自发性:2.稀有性 : 3.可诱变性: 4.不对应性：5.独立性：6.稳定性：7.可逆性：,自发突变率极低而且稳定，10-610-9,各种性状的突变自发地发生,在诱变剂作用下，自发突变可提高10-10000倍,突变的性状与引起突变的原因之间无直接的对应关系。例如，在紫外线作用下，除产生抗紫外线的突变体外还可诱发任何其他性状的变异,某一基因的突变率不受它种基因突变率的影响。说明突变对某一细胞或某一基因都是随机的。,突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定变化，故产生的新的变异性状也是稳定的、可遗传的。,任何性状都可发生正向突变，也都可以发生相反的过程回复突变。,（四）基因突变的自发性和不对应性的证明,在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对应的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，主要攻克了如何检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终于在科学的基础上结束了这场纷争。,本次教学回顾及作业,教学回顾第一节 遗传变异的物质基础3个经典实验，遗传物质在细胞内的存在部位和方式第二节 基因突变和诱变育种基因突变，突变率，突变的特点作业复习本次教学内容，预习下次教学内容,上次教学回顾,遗传和变异的几个基本概念第一节 遗传变异的物质基础第二节 基因突变和诱变育种,遗传、遗传型、表型、变异、饰变,3个经典实验遗传物质在细胞内的存在部位和方式,基因突变，突变率，突变的特点、基因突变的自发性和不对应性的证明,（五）基因突变及其机制,诱变(诱发突变),自发突变,点突变(基因突变),畸变,碱基置换,移码突变,基因突变,转换：,颠换,A G，T C,A T，AC,G C，GT,缺失：,插入：,缺失：,添加,易位(转座)：,倒位：,重复：,插入：,染色体DNA序列从某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象。,染色体发生两次断裂后，某一区段发生颠倒，而后又愈合的现象。,一)自发突变,概念：指生物体自然发生而非人为引起的突变1、基因突变的自发性和不对称性的实验证明变量试验：1943年S.E.Luria和M.Delbruck涂布试验:1949年H.B.Newcombe影印平板培养试验：1952年J.Lederberg夫妇2、自发突变的原因(机制)由背景辐射或环境因素引起诱变作用 ，如宇宙射线、加热等微生物自身产生诱变物质如微生物细胞内的咖啡碱、硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氖丝氨酸及过氧化氢等。DNA复制中偶然碱基配对错误(10-710-111000 =10-6 ) ，引起突变。,大肠杆菌稀释培养物(103/mL),10ml,10ml,(培养前先分成50小管),(在同一大管中作整体培养后分50份),( 抗噬菌体菌落数),( 抗噬菌体菌落数),3,2,64,1, 0 103,1,21,7, 1,7, 4, 5, 4,7, 5, 3, 6,4, 5,Luria等的变量实验,结论： E.Coli抗噬菌体性状的产生，并非由所抗的环境因素（即噬菌体T1）诱导出来的，而是在它接触T1前，在某次细胞分裂过程中自发产生的。这一自发突变发生得越早，抗性菌落出现得就越多，反之则越少。 噬菌体T1在这里仅起淘汰原始的未突变菌株和甄别抗噬菌体突变型的作用，而决非“驯养者”。,保温5 h,保温5 h,喷入T1保温,喷入T1保温,6个平板重新涂布,喷入T1保温,喷入T1保温,6个平板重新涂布,I个小菌落生长时产生抗噬菌体突变,在未喷噬菌体T1前没有突变细胞,自发突变假说,获得免疫性假说,在12个琼脂平板上每个平板涂布5*104个大肠杆菌的噬菌体敏感性细胞,每个平板上有5*104个小菌落，每个菌落约含5000个细菌,1个抗噬菌体菌落（共28个）,小菌落中每个抗噬菌体细胞产生1个抗菌体菌落（共353个）,两组平板有相同数目的细菌，所以将产生相同数目的抗噬菌体菌落,Newcombe 的涂布试验,结论： E.Coli抗噬菌体突变的确发生在与T1接触之前。 噬菌体T1的加入只起到甄别这类自发突变是否发生作用，而不是诱发相应突变的原因。,涂布试验中突变率的计算,初始接种量：5 104 个/皿培养5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌这时，每个平皿上的细胞数为：5100 5 104 2.6 108个/皿在6个平板上，比接种时增加的细胞数为：6 （2.6 108 5 104）= 15.6 108在未涂布的平板上共发现28个突变，故突变率 = 28/15.6 108 = 1.8 108,含药物的培养皿,不含药物的培养皿,原始敏感菌种,1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,10,影,印,接,种,Lederberg等设计的平板影印培养法,二)诱发突变,诱发突变：简称诱变。指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。诱变剂：凡具有诱变效应的任何因素。化学因素的诱变物理因素的诱变紫外线X射线和 射线等是不带电的光量子，不能直接引起物质原子电离或激发，但在与基因分子碰撞时，把全部或部分能量传给原子而产生次级电子。这些次级电子一般具有很高的能量，能产生电离作用；因而直接或间接地改变DNA结构。,化学因素的诱变,1、直接引起碱基置换的诱变剂是一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的化学诱变剂，能与所有生物体的DNA，无论它是离体的DNA、离菌的噬菌体还是代谢作用几乎停顿的细胞(如芽孢)等都发生化学作用，从而引起突变(主要转换，极少颠换)。如亚硝酸、烷化剂、羟胺。,2、间接引起碱基置换的诱变剂 是一些碱基类似物，其结构与DNA中的碱基十分相似，但稳定性较正常碱基小，在菌体内能以不同的形式存在(如5溴尿嘧啶能以酮式或烯醇式状态存在)它们能通过活细胞的代谢作用掺入到DNA分子中而不妨碍DNA的正常复制，但其发生的错误配对可引起碱基的置换。,化学因素的诱变,3、移码诱变剂 能插入DNA分子的碱基对之间，使DNA链结构变形，并在DNA复制时由于不对称交换，引起DNA链中插入或缺失一个或几个碱基，造成这一对核苷酸后的整个密码的移动，产生移码突变。,物理因素的诱变,紫外线(UV)对DNA的损伤与修复损伤DNA具有强烈的紫外吸收能力，尤其是核酸链上的碱基对，其中嘧啶比嘌呤更敏感。紫外线的大剂量作用可导致菌体死亡，小剂量则可引起突变。生物学效应：DNA链断裂、DNA分子内部和分子间交联、核酸和蛋白质交联、嘧啶碱的水合作用及胸腺嘧啶二聚体的形成等。,同一条链上：双链解开和复制受阻，导致死亡两条链上：破坏腺嘌呤的正常掺入和碱基配对，导致突变,物理因素的诱变,紫外线(UV)对DNA的损伤与修复修复光复活：把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，就可出现明显降低其死亡率的现象。经UV照射后形成了胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗中会被一种光激活酶(光解酶、光裂酶)结合而稳定存在，但在300-500nm 可见光下，此酶会因获得光能而激活，并使二聚体重新分解成单体。注意：在利用UV进行诱变育种时，就应在红光进行照射和后续操作，并放置在黑暗条件下培养。暗复活(暗修复、切除修复)是活细胞一种用于对被UV等诱变剂损伤后不依赖可见光，只通过酶切作用去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常DNA链的核酸修复方式 。,本次教学回顾及作业,教学回顾7-2 基因突变和诱变育种基因突变基因突变的自发性和不对应性的证明基因突变及其机制作业P246 3，5，6,上次教学回顾,7-2 基因突变和诱变育种基因突变基因突变的自发性和不对应性的证明基因突变及其机制,变量试验涂布试验影印平板试验,自发突变诱发突变,二、突变与育种,一)自发突变与育种、从生产中育种如从污染噬菌体的发酵液中，分离到抗噬菌体突变株；酒精工厂糖化酶产生菌中，筛选到糖化力强、培养条件较粗放的白色孢子变种“上酒白种”等。、定向培育优良菌株定向培育：利用微生物的自发突变，采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株的过程。19世纪，巴斯德培育低毒力的炭疽芽孢杆菌活菌苗；牛型结核杆菌接种在含牛胆汁和甘油的马铃薯培养基上筛选卡介苗。,二、突变与育种,二)诱变育种概念：利用物理、化学等诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，把适合人类需要的少数优良菌株选育出来的过程。实践意义可获得供工业和实验室应用的各种菌株。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。如青霉素生产菌株(产黄青霉)的选育,二)诱变育种,1、基本环节,出发菌株,诱变,绝大多数个体死亡,少数存活,多数未变,少数突变,多数负变,少数正变,多数幅度小,少数幅度大,多数不投产,少数宜投产,可计算： 存活率 突变率 正变率 “高产率” 投产率,二)诱变育种,2、一般原则(1)选择简便有效的诱变剂。(2)挑选优良的出发菌株 (3) 处理成单细胞或单孢子悬液 (4)选用最适剂量 (5)充分利用复合处理的协同效应 (6)利用和创造微生物形态、生理与产量间的相关指标，以便在初筛中即可从形态性状估计其生产潜力。(7)设计和采用高效筛选方案和方法(初筛和复筛)(8)创造新型筛选方法,）选择简便有效的诱变剂诱变剂的种类：物理诱变剂和化学诱变剂诱变剂的选择在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的情况下，则应选择最高效的因素。简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为简便。设备：紫外灯、磁力搅拌器、无可见光（只有红光）暗室等，紫外灯：波长为253.7nm, 功率是15W，处理时的照射距离：20cm30cm，照射时间不短于1020s,也不长于1020min。样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm(常可取5mL单细胞悬液放置在直径为6cm的小培养皿中，在无盖的条件下直接照射)。照射时，要用磁力搅拌器搅拌。处理剂量：常用照射时间或死亡率作为相对剂量。,）选择简便有效的诱变剂简便有效的诱变方法化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反应的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上划区并分别均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经保温培养后，可发现在颗粒周围有一透明的抑菌圈，在抑菌圈的边缘挑取若干突变菌落，将它们一一制成悬浮液，再分别涂布在琼脂平板表面，使长出许多单菌落，最后可用影印平板法或逐个检出法选出突变种。,2）挑选优良的出发菌株出发菌株用来育种处理的起始菌株出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力； 出发菌株的来源； 自然界直接分离到的野生型菌株 历经生产考验的自发突变菌株 具有有利于进一步研究或应用性关的菌株已经历多次育种处理的菌株,) 处理单细胞或单孢子悬液,指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。产生原因：分离性迟延现象生理性迟延现象,要求： 菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长； 细胞分散且为单细胞或单孢子悬液，以避免表型迟延现象,方法： 玻璃珠打散10-15min; 加0.3%吐温80（表面活性剂） 用无菌脱脂棉过滤。,制备： 物理诱变剂生理盐水（0.85%NaCl) 化学诱变剂缓冲液,浓度： 细菌、放线菌 108个/mL 霉菌、酵母菌 106个/mL,) 选用最适的诱变剂量,剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。最适剂量的选择：某诱变剂的剂量存活率诱变率三者的最佳结合点。剂量存活率曲线：剂量诱变率曲线：,实际工作中：产量性状的正变较多倾向于低剂量（如，在UV作诱变剂中，控制致死率在70-75%甚至30-70）,第三轮，第四轮 (都同第二轮),创造新型筛选方法,初筛：以粗测为主。平板或摇瓶平皿快速检测法变色圈法水解圈法、显色圈法生长圈法：营养缺陷株的筛选抑菌圈法：产量突变株的筛选梯度平板法：抗性突变株的筛选摇瓶培养法复筛：用摇瓶培养或发酵罐精测,、3类突变株的筛选方法,产量突变株的筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选,产量突变型的筛选,操作要点：）把诱变后的微生物的单细胞悬液均匀涂布在琼脂平板上；）待长上稀疏的小菌落后，用打孔器一一取出长有单菌落的琼脂小块；）分别把它们整齐地移入灭菌的空培养皿内，在合适的条件下继续培养4-5d；4）把每一长满单菌落的琼脂再转移至已混有供试菌的大块琼脂平板上，以分别测定各小块的抑菌圈，择优取之。,方法：梯度平板法（gradient plate）,抗药性突变株的筛选,抗药性突变株的应用：作为菌株的遗传标记作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）,图7-18用梯度平板法定向筛选抗性突变株,1)与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基基本培养基(MM，符号为-)能满足某一种的野生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。补充培养基(SM,符号为A或B)在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要(其他营养缺陷型仍不能生长)的培养基。完全培养基(CM,符号为+)可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。,营养缺陷型突变株的筛选,营养缺陷型突变株的筛选,2)与营养缺陷型有关的3类遗传型个体野生型变异前的原始菌株。能在相应的基本培养基上生长。若A、B两个基因表示其对这两种营养物合成能力，则野生型株的遗传型应是A+B+。营养缺陷型原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，丧失了合成某种代谢产物的能力，因而无法再在基本培养基(MM)上正常生长繁殖，必须在培养基中外源补加该物质(补充培养基)才能生长的菌株。A营养缺陷型的遗传型用A-B+表示原养型营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。遗传型也为A+B+。,诱变,回变或重组,艾姆氏试验,基本原理： S.t.（鼠伤寒沙门氏菌）的his-菌株在基本培养基-平板上不能生长，而其回复突变成his+菌株后则能生长。,利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便有效方法。,许多化学物质原先并非诱变剂或致癌剂，只有在进入机体并在肝脏的解毒过程中，受到肝细胞中一些加氧酶的作用，才形成有害物。,有某种高浓度诱变剂存在,有某种适当浓度诱变剂存在,赖氨酸发酵,菌种：谷氨酸棒杆菌的Hom,肌苷酸（ IMP ）发酵,调控理论的实践应用,菌种：谷氨酸棒杆菌的酶12的腺嘌呤缺陷型,抗反馈调节突变株是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的组成型菌株。,菌种：黄色短杆菌的抗AHV突变株,菌种：黄色短杆菌抗AHV菌株的甲硫氨酸缺陷型,苏氨酸发酵,营养缺陷型突变株的筛选,3)筛选营养缺陷型菌株的一般步骤和万法a、诱变：常用紫外线诱变形成少量营养缺陷型菌株。b、中间培养：用完全培养基或补充培养基培养过夜c、淘汰野生型(浓缩缺陷型)抗生素法：某些抗生素能杀死生长繁殖着的微生物，而对处于休止状态的微生物无杀伤作用。如青霉素(细菌)；制霉菌素(真菌)菌丝过滤法： 适用于放线菌、霉菌等丝状微生物。d、检出营养缺陷型逐个测定法(点种法) 把经诱变处理并淘汰野生型后的菌液在完全培养基上涂布分离，将培养后长出的每个茵落分别点种在基本培养基和另一个完全培养基上，培养一段时间后，凡在基本培养基上不能生长而在完全培养基的相应位置上能生长的菌落，表明其为营养缺陷型。,营养缺陷型突变株的筛选,e、鉴定营养缺陷型生长谱法：将检出的缺陷型菌株接种在完全培养基上培养，把生长的菌体或孢子经离心和无菌水清洗后制成 浓度为107-l08个/mL的菌悬液。取0.1m1该悬液与基本培养基混匀倒皿，冷凝并稍干燥后，分区加沾有各种营养物的滤纸片，培养，观察生长反应。,生长谱法1.单一营养缺陷型2.非所涂物质营养缺陷型3-4.双重营养缺陷型5.回复突变型6.高浓度生长因子抑制作用,生长谱法方法简便； 回变和污染不影响 结果 测定物质可为粉末 或纸片,缺陷型的鉴定,测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；,组合营养物法：,步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：a. 将多种营养因子编组；b. 将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养；c. 结果分析；,如： 一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 13 14 五组：5 9 12 14 15,营养因子分组编排时注意；1）每组内无重复的营 养因子 2）每组中应包含只出 现一次的因子 3）每组中其他因子应 分别出现二次,缺陷型的鉴定,一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 13 14 五组：5 9 12 14 15,缺陷型的鉴定,缺陷型的应用,作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变育种、研究代谢过程时用作亲本标记；作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种;作为aa、维生素、碱基的测定菌株。,本次教学回顾及作业,教学回顾7-2 基因突变和诱变育种突变和育种基本环节、一般原则3类突变株的筛选产量突变株的筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选作业P246 9，13，14,上次教学回顾,7-2 基因突变和诱变育种突变和育种3类突变株的筛选,产量突变株抗药性突变株营养缺陷型突变株,基本环节一般原则,第三节 基因重组与杂交育种,一、原核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组,一、原核生物的基因重组,一)转化(transformation)概念受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。通过转化形成的后代，称为转化子，有转化活性的外来DNA片断为转化因子。微生物的种类：十分普遍感受态(competence)指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。转化过程：S.pneumoniae(G+)转染：指用提纯的病毒核酸(DNA或RNA)去感染其宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。,转化过程,感受态细胞的建立用人工方法提高受体菌的感受态水平DNA的结合与摄取首先供体菌的dsDNA与受体菌细胞表面上的接受位点相结合，其中一条链被细胞表面上的核酸酶水解，水解产生的能量协助把另一条链推进受体细胞。转化因子与染色体重组来自供体菌的ssDNA片断与双链结构受体染色体DNA同源片断发生交换重组，形成一小段杂合DNA区段；然后受体菌染色体进行复制，于是杂合区也随之得到复制，细胞分裂后，形成一个转化子(strR)和一仍保持受体菌原来基因型(strS)的子代。,供体(strR),dsDNA,感受态受体(strS),酶解与吸收单链,同源区段配对,单链整合,复制与分裂,转化子(strR),非转化子(strS),转化过程示意图,一、原核微生物的基因重组,二)转导(transduction)概念通过缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段DNA到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。由转导作用而获得部分新性状的重组细胞，称为转导子。 种类1、普遍转导2、局限性转导3、溶原转变,1、普遍转导,概念通过极少数完全缺陷噬菌体(噬菌体内仅含有供体DNA)对供体基因上任何小片段DNA进行误包(错误的装配) ，而将其遗传性状传递给受体菌的现象。一般用温和噬菌体为媒介。分类完全普遍转导：简称普遍转导或完全转导。流产普遍转导：简称流产转导,病毒,感染,供体细菌,子代病毒,含病毒DNA的颗粒,含宿主DNA的转导颗粒,感染,感染,受体细胞,噬菌体生长,重组,产生更多的病毒颗粒,转导子,由P22噬菌体引起的完全普遍转导,流产转导示意图,宿主的DNA,2、局限性转导,概念指通过部分缺陷(含有部分宿主的DNA)的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因整合、重组，形成转导子的现象。特点只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因，一般为噬菌体整合位点两侧的基因该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带缺陷噬菌体的形成是由于它在脱离宿主核染色体过程中，发生低频率(10-6)误切(反常切除) 局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素对溶源菌的诱导并引起裂解后产生。分类低频转导和高频转导,2、局限性转导,低频转导LFT)通过一般溶源菌释放的噬菌体所进行的转导，只形成极少数(10-410-6)转导子。高频转导HFT)通过对双重溶源菌的诱导所释放的噬菌体所进行的转导，可形成高达50%左右的转导子。,同时有两种噬菌体整合在细菌的染色体上,前噬菌体：没有感染力,图1.1-4 细菌受噬菌体感染后的两种反应 A.裂解反应 B.溶原性反应,自发或诱导变异,营养态,游离态,整合态,一、原核微生物的基因重组,三) 接合(conjugation,mating)概念：供体菌(“雄性”)通过性菌毛与受体菌(“雌性”)直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片断传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象。接合之后的受体细胞称接合子。能进行接合的微生物：细菌和放线菌E.coli的杂交实验E.coli的4种接合型菌株与F因子,E.coli的杂交实验,A+B+C-D-,A-B-C+D+,+,离心后洗净,A+B+A-B-,C-D- C+D+,A+B+C+D+,2108,1108,1108,2108,无菌落生长,无菌落生长,研究细菌接合的营养缺陷型法原理A,B,C,D：met,bio,thr,leu,-,-,-,E.coli的4种接合型菌株与F因子,100/0,25,50,75,转移区tra,复制区rep,转座因子,F因子 即F质粒，又称致育因子或性因子，是小分子的DNA，长约6104bp，约为E.coli染色体的2%。,1、F+菌株即“雄性”菌株，指细胞内存在一至几个F质粒，并在细胞表面着生一至几条性菌毛的菌株。当F+菌株与F-菌株接触时，通过性菌毛的沟通和收缩，F质粒由F+菌株由“滚环模型”转移至F-菌株中，同时F+菌株中的F质粒也获得复制，使两者都成为F+菌株。 F因子以很高的频率传递，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般并不被转移。,滚环模型,F+细胞内，F因子的一条DNA单链在特定位点上发生断裂；断裂的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板，通过模板的滚动，一方面把解开的单链以5为先导通过性菌毛推入F 细胞中，另一方面，在供体细胞内以滚动的环状模板重新合成一条互补的环状单链，以取代传递到F 细胞中的那条单链。这种DNA复制机制称为滚环模型；,2、F-菌株即“雌性”菌株，指细胞内无F质粒，细胞表面也无性菌毛的菌株。可以通过与F+、F或Hfr菌株接合而接受供