微生物优良菌种的选育课件.ppt

第四章 微生物优良菌种的选育,4 Breeding of the Industrial Strains,提纲,微生物优良生产菌种的特征自然突变选育诱变选育 原理 基本方法杂交育种 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌原生质体融合基因工程技术 基因表达系统 利用大肠杆菌的基因表达系统 利用酵母菌的基因表达系统 基因工程菌的稳定性,优良菌种应具备的特征,对菌种的要求 1.生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产 物的产量高，其它代谢产物少2.操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离3.稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化4.安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素,优良菌种应具备的特征,选择生产菌种应注意的因素1.原料方面：广，转化率高；2.产物方面：目的产物含量高，副产物少；3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定4. 设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。（培养条件要求低，周期短，需氧量小，抗污染能力强）,一、自然选育（spontaneous Mutation）,概念：不经人工处理，利用微生物自然突变进行的菌种选育的过程。自然突变的原因：多因素低剂量的诱变效应； 互变异构效应结果：负变大于正变，应经常分离纯化优点：简单易行，可与生产同步进行。缺点：频率低，10-810-9 /次分裂。,自发突变的原因有三个层次：细胞外的原因(如紫外线、环境的化学突变剂等)；细胞内的原因(代谢产生的突变因子，如亚硝酸、过氧化物等)；DNA分子内的原因(碱基的互变异构效应)。,1、自然选育的内容和作用,对工业生产而言，自发突变的结果有两种：菌种衰退(概率大)和菌种性能的提高(概率小)。定向培育(菌种驯化)利用微生物的自发突变，在特定的培养条件下或环境中培养微生物，筛选具有特殊性能的微生物的过程。卡介苗(BCG vaccine) （230代，前后经历13年时间）、巴斯德定向选育炭疽杆菌疫苗。用特定的工业废水驯化微生物得到能够处理这种废水的菌种。,二、诱变选育,诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包括诱变和筛选两个步骤。概念：利用被称为诱变剂的物理因素或化学试剂处理微生物细胞，提高其基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。原理：在诱变剂的作用下会出现染色体畸变（染色体或DNA片段发生缺失、易位、重复等）；基因突变(少数碱基改变)。,影响诱变的因素： 出发菌株（有一定生产能力，形态、生理强壮） ； 诱变剂的种类（单一或复合）与剂量（不宜过高和过 低，致死率：70-80）。诱变剂：能提高基因突变频率的物理、化学、生物因子。 筛选比诱变更重要。筛选的方法：通过选择/鉴别培养基加以识别。初筛复筛确定最佳发酵条件（负变多，正变少）,1、诱变选育的基本步骤,1、诱变选育的基本步骤,选择出发菌株具有特定生产性状的能力或潜力；形态、生理强壮，产量较高；对诱变剂的敏感性大；变异幅度大。制备菌悬液尽可能均匀，避免因多细胞聚集造成诱变筛选得到的菌落不纯。,本身性能要好,易经诱变提高,诱变剂及剂量的选择可以选择单一诱变剂，也可以选择复合诱变剂。常见的诱变剂包括：物理诱变剂，如紫外线、射线、射线、激光、快中子等。化学诱变剂，如硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N甲基-N-N-亚硝基胍(NTG)、氮芥、乙烯亚胺等（烷化剂(alkylating agent)），又如亚硝酸等（使碱基氧化脱氨基，A to H, C to U, G to X ），又如5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤等（碱基类似物）。,复合诱变剂使用两种或数种诱变剂处理生产菌种，联合使用的两种或多种诱变剂称为复合诱变剂。增变因子：单独使用无诱变作用，但和诱变剂共同使用可以提高诱变效果乃至正突变频率的物理或化学因素。,诱变剂量的表示方法可以直接用所使用的诱变剂的单位表示，如紫外线的强度、化学诱变剂的浓度和处理时间等。也可以用致死率表示。诱变剂量的选择通常以致死率为依据，但须根据具体条件摸索。,变异菌株的筛选方案根据菌落的形态变化筛选根据特定产物的合成机理或菌种特性筛选抗代谢类似物营养缺陷型抗生素抗性菌株初筛（筛选的菌株多，不需要很精确）复筛（筛选的菌株少，需要很精确）用与生产条件相似的培养基培养突变株，对突变株的生产能力进行验证。,2、突变菌株的筛选,筛选的重点在初筛(前面两点)，因为复筛的工作量小。,2.1、营养缺陷型突变株筛选,野生型菌株：从自然界分离得到的微生物发生突变前的原始菌株，为野生型菌株（wild type strain）。 营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或者自然突变失去合成某种营养（氨基酸，维生素，核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，成为营养缺陷型（auxotroph）。,基本培养基：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基（minimal medium,MM），有时用符号“ ”来表示。不同微生物的基本培养基是不相同的。 完全培养基：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或者半天然培养基，成为完全培养基（complete medium,CM），有时用符号“ + ”表示。完全培养基营养丰富，全面，一般可在基本培养基中加入富含氨基酸，维生素和碱基之类的天然物质配制而成。,2.1、营养缺陷型突变株筛选,酶缺陷，结果造成中间产物积累；解除协同反馈，使另一分支末端产物积累；渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末端产物少，中间产物积累。方法？,可使用影印平板法进行筛选。完全培养基上长的菌落影印到基本培养基上，不长的为营养缺陷型。,2.2、抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选,调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结合但不发生作用；方法：,末端产物结构类似物筛选；（未突变者死）,2.3、组成型突变株筛选,诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物。突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过适当方法分辨组成型菌落。,筛选方法,加诱导酶合成抑制物 如：加邻硝基-D-岩藻糖苷，抑制-半乳糖苷酶合成。 诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖，生长，被富集。 交替培养法 含诱导物（乳糖）中培养组成型快不含诱导 物（葡萄糖）中培养诱导型失酶反复。显色反应法 不含诱导物平板培养加底物分解（有颜色变 化）检出。,2.4、抗（敏感）性突变株筛选,包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 抗生素抗性突变：提高产量； 抗噬菌体突变：消除噬菌体污染； 条件抗性突变：也称条件致死突变，如温度温度敏感突变，乳糖短杆菌（谷氨酸产生菌）高温呈营养缺陷表型，在富含生物素的培养基中高温培养，提高产量； 物敏突变（柠檬酸转化异柠檬酸）如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型，柠檬酸积累。,三、杂交育种,工业上长期诱变会使菌种生活能力下降。借助有性重组，使不同菌株的遗传物质 得以交换（获优良性状集中的重组体）。 诱变育种：变异的范围小，一个或少数几个基因发生突变，不太可能通过诱变获得新产品； 杂交育种：变异的范围大，可能导致大范围遗传物质的改变，有可能通过杂交获得新产品。,杂交育种的思路类似于农作物或动物的杂交思路，如A菌株产量高，但生长慢；B菌株产量低，但生长快。两种杂交则有可能获得产量高、生长快的菌株。,1、细菌的杂交育种,方法：转化（transformation）、转导（transduction）、接合（conjugation）。获部分合子。出发菌株需带遗传标记：营养缺陷、抗生素抗性、温敏、发酵性能。,、放线菌的杂交育种,基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似放线菌的遗传体系和杂交原理：异核现象：放线菌在杂交过程中，经菌丝间接触和融合形成异核体，同一细胞（菌丝）含不同基因型的核。无重组体出现。接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分 合子。整+部分、部分+部分。异核系的形成：部分合子产生后形成的无性繁殖系。菌落很小，能在基本或选择培养基上生长。 （单交换，二体区）重组体的形成：异核系不稳定，可经过双交换形成重 组子，产生重组子孢子。,注意：两个亲本必需带有遗传标记，如抗生素抗性、营养缺陷型等，才能筛选重组体。,放线菌的杂交方法,混合培养法：两互补缺陷型亲株混合培养，制孢 子悬液，选择性平板分离。平板杂交法：一亲株培养，形成孢子，影印至已 分别铺有另几种孢子的平板上，获 孢子后再影印至选择平板上。玻璃纸转移法：两亲本需要双标记，混合带纸培养，玻璃纸上长出一层基内菌丝，纸移至一选择平板，获异核系。解剖镜下，小针收集小菌丝，于完全平板涂布，获分离子。,、霉菌的杂交育种,异核体的形成：两不同性状细胞（菌丝）连接，导致一细胞存在两个不同遗传型核。杂合二倍体形成；异核体偶尔发生不同核的融合，形成杂合核，为双倍体。菌丝成斑点、扇面扇变。体细胞重组：杂合二倍体只具有相对稳定性，进一步培 养，繁殖过程发生染色体交换，单倍化，形成各种分离子。,霉菌的杂交技术,诱变获具标记的亲本。异核体的形成：基本培养基上，强迫进行营养互补。还可用多种方法。双倍体检出：可从扇面上挑孢子分离。分离子检出：杂合二倍体单孢子平板分离，检菌落斑点或扇面，斑点处挑孢子至斜面，再纯化鉴别。,、酵母菌的杂交育种,双单特性：存在单倍体和二倍体的生活史二倍体生活力强，生产能力高，可通过杂交得二倍体来育种。方法：首先获得单倍体细胞；二倍体菌落大，椭圆形，可形成子囊。杂交。杂交方式：孢子与孢子交配；孢子与单倍体细胞交配；单倍体细胞间交配。例：卡尔酵母，糖化酵母,四、原生质体融合育种,1、基本概念原生质体融合(protoplast fusion)：在高渗的条件下把两个亲本的细胞壁通过酶解瓦解，得到原生质体，并在助融合剂（如PEG，Ca，Mg离子）或电击的作用下使两个亲本的原生质体发生融合的过程。原生质体：在高渗溶液中除去细胞壁的细胞。,2、原生质体融合育种的优势,没有供体和受体之分，适用面广，受亲缘关系的限制小；打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组。重组频率高；遗传物质的传递更加充分,3、原生质体融合的步骤,革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成,溶菌酶,微球菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌,革兰氏阴性菌不能直接溶壁，只有当乙二胺四乙酸（EDTA）存在时，某些革兰氏阴性菌的细胞壁才能够被溶菌酶溶解。,金黄色葡萄球菌,溶菌酶不能溶解,表皮葡萄球菌能产生一种内肽酶葡萄球菌素，溶解,放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌也可采用溶菌酶,真菌细胞壁主要由纤维素、几丁质和葡聚糖等组成,青霉菌多用纤维素酶和-1,3-糖苷酶等溶壁,曲霉用-1,3-糖苷酶和-1,4-糖苷酶等,酵母菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质,蜗牛酶 或者EDTA处理后加细胞壁溶解酶,4、原生质体融合技术在微生物育种中的应用：,选育高产优质菌株 产生新的产物,五、基因工程育种,精确的定向育种，技术含量高，应用面广。应用：解决了一些药物或材料来源困难，或制造技术复杂，或造价昂贵而无法大量生产和应用的问题。 1982年第一个基因工程产品-重组人胰岛素（一）基因表达系统 从育种的角度考虑，最重要的是目的基因的高效表达。.原核表达系统；.真核表达系统,、原核表达系统,原核生物不适宜表达需后加工处理的那一部分真核基因 不能切除mRNA的内含子； 不能进行蛋白质的糖基化； 不能对氨基酸进行修饰。大肠杆菌：遗传背景清楚；基因操作简便；易培养，世代短，生长快；适宜大规模生产注意：真核蛋白后修饰； 多为胞内产物；产物分离纯 化困难；内毒素；蛋白酶破坏产物；免疫反应。枯草芽孢杆菌：优点，分泌能力强；缺点， 胞外蛋白酶强链霉菌：使用安全；分泌能力强。,、真核表达系统,产生的蛋白质与天然蛋白质具有一致的生理生化功能酵母：真核生物蛋白质的优良表达系统 优点：基因组小，操作方便； 世代周期短，易培养； 有单、双倍体形式；能糖基化；能分泌产物到胞外。 应用：干扰素、乙肝表面抗原基因已经成功表达； 酿酒酵母研究、应用最广泛。丝状真菌： 特点：能进行翻译后加工； 表达产物分泌能力强；安全；发酵、纯化工艺成熟。,（二）利用大肠杆菌的基因表达系统,外源基因在大肠杆菌中的成功表达与表达载体、外源基因的调控序列等有关.表达载体条件： 能独立复制； 有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记，位点位 于 起动子后； 有很强的起动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别； 有使起动子受抑制的阻遏子，受诱导时才转录，可人 为的通过理化因素选择启动时机； 有很强的终止子，使RNA聚合酶集中力量转录克隆 的外源基因；克服质粒高转录引起的质粒不稳定。 产生的mRNA须有翻译的起始信号，即起始密码 AUG和SD序列。,、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素,目的基因的表达产量与每个细胞平均表达量和细胞浓度正相关。影响因素：外源基因的拷贝数；外源基因的表达频率： 启动子的强度（转录水平）；起始密码子AUG和SD序列的间距；核糖体结合位点的有效性表达产物的稳定性；融合蛋白及非融合蛋白，利用信号肽将产物运送到细胞周质空隙中。细胞的代谢负荷。大量的外源基因表达会打破宿主代谢平衡。,、在大肠杆菌中真核基因的表达形式,融合蛋白：N端原核序列，C端真核序列表达高效、稳定，但影响免疫原性，可酶切。非融合蛋白：保持生物活性，但易被水解 N端常带甲硫氨酸，引起人体免疫反应。分泌表达蛋白：使外源基因连接到编码原核蛋白信号肽下游，构建分泌表达质粒。 常用信号肽碱性磷酸酶信号肽（PhoA）、胞外周质蛋白信号肽（OmpA）、霍乱弧菌B亚单位信号肽（CTXB）。在周质空间酶切，释放产物。,（三）利用酵母菌的基因表达系统,.载体系统：多用穿梭载体，同时带有细菌和酵母复制原点和选择标记，在两者中复制、选择。克隆载体（复制序列）酵母附加质粒(YEP)酵母复制型质粒(YRP)酵母着丝粒质粒(YCP)酵母整合型质粒(YIP),.载体系统,表达载体 在克隆载体中插入酵母表达盒和终止子等调控序列,即可构建酵母表达载体。 需糖基化才有生物功能的重组蛋白必须是分泌型蛋白.要在外源DNA上游加前导肽序列。用啤酒酵母表达分泌型外源蛋白时，要求前导肽C端是赖精，其内切酶可识，切。,、影响外源基因在酵母中表达的因素,外源基因的拷贝数：拷贝数，稳定性，整合位置；外源基因的表达效率： 启动子：有上游激活序列、近端启动子TATA序列（转录必须）、mRNA起始密码子；组成型，诱导型。 分泌信号：包括信号肽、前导肽序列；终止序列：保证产物在适当的位置终止；外源蛋白的糖基化：与哺乳动物细胞相同，分泌过程中发生N-糖苷键和O-糖苷键连接的两种糖基化，其产物与天然产物相同宿主菌株的影响：生长力强、内源蛋白酶弱、性能稳定、分泌力强，用二、多倍体。,（四）基因工程菌的稳定性,分裂不稳定：分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌；结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失。1.影响因素：（常见是分裂不稳定） 产不含质粒的子代菌的频率； 两种菌的比生长速率。 质粒拷贝数低时，可增加，但不宜太高（生长负势 ）。 2.提高质粒稳定性的方法：两段培养法（先长菌，后表达，使比生长速率差别减小）；控制培养条件（某些质粒菌对环境改变的反应比不含质粒的差，温度、PH、培养基组分、溶解氧）。,本章知识结构,1、微生物优良生产菌种的特征2、自然突变选育3、 诱变选育4、 杂交育种5、 原生质体融合 6、基因工程技术,Thanks for Your Attention!,