微生物分离课件.ppt

5 工业微生物产生菌的分离筛选,菌株分离：将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。,5 工业微生物产生菌的分离筛选,可以从哪些方面进行菌株分离？1.向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株2.由自然界样品中分离目的菌株3.从一些发酵制品中分离目的菌株如酱油中分离蛋白酶产生菌,5 工业微生物产生菌的分离筛选,分离筛选的步骤：,菌株分离：,采样,富集,分离,产物鉴别,第一节 含微生物样品的采集,第二节 含微生物样品的富集培养,第三节 微生物的分离,第四节 野生型菌株的筛选和目的产物的鉴别,5 工业微生物产生菌的分离筛选,第一节 含微生物样品的采集,从土壤中采样,根据微生物生理特点采样,特殊环境下采样,5 工业微生物产生菌的分离筛选,第一节 含微生物样品的采集,从土壤中采样,土壤是微生物的大本营，是微生物最集中的地方土壤经常是首选的采样目标,第一节 含微生物样品的采集,从土壤中采样,每克土壤含菌量递减规律：细菌放线菌霉菌酵母菌藻类原生动物影响微生物分布因素：地理条件、养分、水分、土质、季节,第一节 含微生物样品的采集,从土壤中采样 （一）根据土壤特点,1、土壤有机质含量和通气状况2、土壤酸碱度和植被情况3、地理条件4、季节条件,从土壤中采样 （一）根据土壤特点,1、土壤有机质含量和通气状况选取有机质含量丰富采样地点细菌、放线菌 耕作土、菜园土、近郊土霉菌、酵母菌 山坡森林土,从土壤中采样（一）根据土壤特点,2、土壤酸碱度和植被情况PH7.07.5 细菌、放线菌PH7.0 霉菌、酵母菌植物根部分泌物影响土壤中微生物分布如番茄地腐烂番茄堆积处维生素C产生菌较多,从土壤中采样 （一）根据土壤特点,3、地理条件我国南方土壤中微生物数量和种类比北方多原因：温度高、温暖季节长、相对湿度高、土壤有机质丰富等,从土壤中采样 （一）根据土壤特点,4、季节条件南方：秋季 北方：春秋季,第一节 含微生物样品的采集,从土壤中采样 （二）采样方法,用编号塑料袋装记录地点、土壤质地、植被名称、时间等环境条件采样后，及时分离,样地较远时，随身携带选择培养基斜面,二、根据微生物生理特点采样p61 1、根据微生物营养类型,纤维素酶产生菌 秸秆、落叶、腐烂木头蛋白酶、脂肪酶产生菌 肉类加工厂、酒店污水沟淀粉酶、糖化酶产生菌 面粉厂、糕点厂、酒厂、 淀粉厂果胶酶产生菌 柑橘、草莓、山芋及果园土分解某类化合物的微生物 大量使用、生产或处理 这类化合物的工厂附近采样,第一节 含微生物样品的采集,根据微生物生理特点采样 2、根据微生物的生理特性,高温酶产生菌 温泉、火山、堆肥低温酶产生菌 南北极、冰窖、深海耐压菌 海洋底部嗜盐菌 盐湖、盐矿耐高渗透压酵母 甜果、蜜饯、甘蔗渣,第一节 含微生物样品的采集,特殊环境下采样 局部环境条件的影响海洋是一个特殊的环境1.20%-50%海鞘、海参体内的微生物可产生具有细菌毒性和杀菌活性的化合物2.某些海绵共生细菌中分离到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物质3.深海鱼类肠道内的嗜压古细菌，80%可产生EPA和DHA,第一节 含微生物样品的采集,特殊环境下采样 具有特殊性质的微生物分布在特殊环境中1.美国德州南部一个岩洞中有大量能进行氨氧化和产几丁质酶的微生物，原因是2.侵蚀木船的蠕虫肠道中分离到既能固氮又能降解纤维素的微生物3.美国分离到一株节杆菌，可降解木质素，对硝酸处理过的花生壳降解率可达到63%,第二节 含微生物样品的富集培养,富集培养：在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下生长繁殖，由原来自然条件下得劣势钟变成人工环境下的优势种。,第二节 含微生物样品的富集培养,可以从下面3个方面进行富集培养：一、控制培养基的营养成分二、控制培养条件三、抑制不需要的菌类,第二节 含微生物样品的富集培养,一、控制培养基的营养成分投其所好、生态模拟环境中含有较多某种物质，其中能分解利用该物质的微生物也较多。在培养基中加入某种特定物质，能分解利用该物质的微生物得到充足的营养而迅速繁殖；其他微生物得不到营养，生长受到抑制。,第二节 含微生物样品的富集培养,一、控制培养基的营养成分投其所好通过连续富集培养技术，富集高浓度污染物降解菌如：苯胺作为唯一碳源对样品进行富集培养，待底物完全降解后，再以一定接种量转接到新鲜的含苯胺的培养基中，如此连续转接培养数次。同时将苯胺的浓度逐渐提高，便可得到能降解苯胺占优势的微生物培养液。,第二节 含微生物样品的富集培养,二、控制培养条件PH、温度、通气量等pH7.07.5 细菌、放线菌pH4.56 霉菌、酵母菌 例如：放线菌的富集 将样品液在40恒温预处理20min，有利于孢子的萌发，可较大的增加放线菌数量。,第二节 含微生物样品的富集培养,二、控制培养条件例如：嗜酸微生物可用于低品位矿的生物沥滤和煤的脱硫，其生长pH上限3.0，最适生长pH1.02.5怎么富集培养？ 嗜冷微生物的富集，可将样品液置于15，甚至0培养，抑制其他中温、高温微生物的生长,第二节 含微生物样品的富集培养,三、抑制不需要的菌类1.芽孢杆菌的富集 可将土壤加热到80或在50%乙醇溶液中浸泡1h，杀死不产芽孢的微生物2.富集培养基中加入胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰氏阳性细菌的生长3.加入四环素等抗生素抑制细菌生长，可富集霉菌,第二节 含微生物样品的富集培养,三、抑制不需要的菌类4.分离链霉菌以外放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到100保温1h，可减少细菌和链霉菌的数量5.分离耐高浓度酒精和高渗透酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间，杀死非目的微生物6.分离普通放线菌，怎么办呢？,第三节 好氧微生物的分离,富集培养后，所得微生物群体是菌落纯吗？,二、利用平皿中的生化反应分离,一、稀释涂布法和划线分离法,三、组织分离法,四、单细胞或单孢子分离法,五、通过控制营养和培养条件分离,第三节 好氧微生物的分离,（一）稀释涂布法,用无菌水将土样十倍梯度稀释，取某一稀释度悬浮液在平板上涂布适温培养一段时间挑取单菌落,第三节 好氧微生物的分离,（二）划线分离法,第三节 好氧微生物的分离,二、利用平皿中的生化反应进行分离、透明圈法、变色圈法、生长圈法、抑菌圈法,第三节 好氧微生物的分离,二、利用平皿中的生化反应进行分离、透明圈法在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基浑浊；能分解底物的微生物在菌落周围产生透明圈圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力适用对象：水解酶产生菌、有机酸产生菌,第三节 好氧微生物的分离,二、利用平皿中的生化反应进行分离、透明圈法淀粉 碘液有机酸 碳酸钙,图1目的菌株在淀粉平板上形成水解圈,产半纤维素酶,第三节 好氧微生物的分离,二、利用平皿中的生化反应进行分离、变色圈法在平板培养基中加入指示剂或显色剂，快速筛选微生物如：果胶酶产生菌、谷氨酸产生菌、解脂微生物、内肽酶、乙醇等,二、利用平皿中的生化反应进行分离、变色圈法 如：果胶酶产生菌,在单菌落周围加入几滴1% CTAB（溴化十二烷基三甲基铵），静置10min若有透明圈产生则为碱性果胶酶产生菌,二、利用平皿中的生化反应进行分离、变色圈法-解脂微生物分离Fryer改良的双层法，先在平民内倒一层营养琼脂把一张棉纸圆片在被维多利亚蓝染了色的乳脂中浸湿，铺在已凝固的琼脂表面，然后覆盖一薄层含样品的营养琼脂，保温培养，解脂菌落可以在棉纸中产生蓝带,二、利用平皿中的生化反应进行分离、变色圈法-分离内肽酶产生菌方法1：用酪蛋白作底物产生透明圈鉴别方法2：用吲羟乙酸酯为底物加到分离培养基内，产生蛋白酶的菌落水解吲羟乙酸酯为3-羟基吲哚，后者能氧化生产蓝色物质，根据呈色圈可选出平板上产蛋白酶菌落。,二、利用平皿中的生化反应进行分离、生长圈法筛选氨基酸、核苷酸、维生素产生菌采用对应的营养缺陷型作工具菌；高浓度工具菌混合基本培养基倒平板后，涂布待检菌，适当温度培养一段时间某菌落周围形成浑浊的生长圈，该菌落可产生工具菌所需营养,第三节 好氧微生物的分离,二、利用平皿的生化反应进行分离、抑菌圈法分离筛选抗生素产生菌工具菌：抗生素的敏感菌,第三节 好氧微生物的分离,二、利用平皿的生化反应进行分离、抑菌圈法筛选产抗微生物的方法进展采用联合检验菌寻找新的微生物资源，如：海洋微生物采用新的筛选方法，如：筛选抗霉菌抗生素时，先筛选抑制几丁质合成酶的生理活性物质，再从中筛选所需抗生素。,第三节 好氧微生物的分离,三、组织分离法从有病或特殊组织分离菌株、对一般有病组织的分离方法取材冲洗消毒冲洗培养,第三节 好氧微生物的分离,三、组织分离法、食用菌孢子分离法单孢子分离法收集孢子稀释分离单孢子培养单孢子成菌落转入斜面，测定生产性能,第三节 好氧微生物的分离,四、单细胞或单孢子分离法凹玻片 小滴分离纯化方法 将待纯化的孢子悬液稀释至1500个/mL，用校正口径的滴管（每毫升4000滴）吸取孢子悬液，均匀滴于无菌干燥盖玻片上，将盖玻片翻转盖于凹玻片的孔穴上，穴内加一滴已灭菌的培养液，盖玻片与载玻片用凡士林密封。显微镜观察，记录只有一个孢子的小滴位置，恒温培养，挑取单菌落。,第三节 好氧微生物的分离,五、通过控制营养和培养条件分离1、培养基的营养成分2、培养基的pH3、排除不需要的菌类4、控制培养温度,五、通过控制营养和培养条件分离1、培养基的营养成分六种营养因子碳源/氮源投其所好,五、通过控制营养和培养条件分离2、培养基的pH培养基的pH调节到被分离微生物要求的范围如：分离碱性蛋白酶和碱性脂肪酶产生菌，可把培养基pH调到911，抑制其他微生物的生长维持培养基pH相对稳定的方法：加入磷酸盐加入碳酸钙,五、通过控制营养和培养条件分离3、排除不需要的菌类-加入专一性抑制剂分离细菌 50u/mL制霉菌素放线菌 0.05%十二烷基磺酸钠（SDS）霉菌、酵母菌 青霉素、链霉素、四环素各30u/mL根霉、毛霉 0.01%去氧胆酸钠或山梨醇,五、通过控制营养和培养条件分离4、控制培养温度高温微生物：最适温度5060中温微生物：最适温度2040低温微生物：最适温度15或更低,第四节 厌气微生物的分离厌气菌工业菌种用途：白酒增香、污水处理、水产养殖等分离方法：加还原剂 划线分离法 焦性没食子酸法 平皿/试管厌气培养法 玻璃板隔绝空气法 生物吸氧法,第五节 野生型目的菌株的筛选和菌株鉴定,初筛,复筛,5 工业微生物产生菌的分离筛选,菌株鉴定,初筛：从大量分离到的微生物中筛选具有合成目的产物的菌株。1、平板筛选优点：简便、高效2、摇瓶发酵筛选 优点：更接近发酵罐培养条件,透明圈法筛选蛋白酶产生菌,平板筛选-1.筛选氨基酸产生菌用不含有机氮的培养基，培养后喷上茚三酮显色，有呈色圈的时氨基酸产生菌。然后在确定属于哪一种氨基酸产生菌。2.筛选表面活性剂产生菌利用表面活性剂溶血原理在加入羊血的平板上挑菌,（二）摇瓶发酵筛选,白假丝酵母,枯草杆菌,第五节 野生型目的菌株的筛选,复筛一个菌株重复35个三角瓶，培养后的发酵液用精确分析方法测定如：分光光度法、滴定法、HPLC法等注意：发酵时优化培养条件 为育种作准备,第六节 极端环境微生物的分离筛选极端微生物是最适合生活在极端环境中的微生物的总称，包括嗜热、嗜冷、嗜酸、嗜碱、嗜压、嗜金、抗辐射、耐干燥和极端厌氧等多种类型。,表5.1极端微生物的种类和生存条件,第六节 极端环境微生物的分离筛选科学家们相信，极端微生物是这个星球留给人类独特的生物资源和极其珍贵的科研素材。开展极端微生物的研究，对于揭示生物圈起源的奥秘，阐明生物多样性形成的机制，认识生命的极限及其与环境的相互作用的规律等，都具有极为重要的科学意义。极端微生物中发现的适应机制，还将成为人类在太空中寻找地外生命的理论依据。极端微生物研究的成果，将大大促进微生物在环境保护、人类健康和生物技术等领域的利用。,第六节 极端环境微生物的分离筛选紫膜，就是紫色的膜，是生长在极端嗜盐菌原生质膜上的一种物质，含有与视觉中的视紫红质相类似的蛋白质，在国际市场上的价格相当于黄金的1万倍。,第六节 极端环境微生物的分离筛选,图5.4 极端微生物选育主要流程p79宏基因组 ( Metagenome)(也称微生物环境基因组 Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词, 其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature” , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因, 目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。,第六节 极端环境微生物的分离筛选,功能基因组 英文名称：functional genome 定义：细胞内所有具有生物学功能的基因。,第六节 极端环境微生物的分离筛选,（二）采集样品根据微生物的生理特性采样,高温酶产生菌 温/热泉、火山、堆肥、火山低温酶产生菌 南北极、冰窖、深海耐压菌 海洋底部耐渗透压酵母 甜果、蜜饯、甘蔗渣,云南腾冲热泉,（三）采样方法,用编号塑料袋装记录地点、土壤质地、植被名称、时间等环境条件采样后，及时分离,样地较远时，随身携带选择培养基斜面（四）富集培养（五）菌株分离,极端微生物培养注意事项,常用培养基对95%以上极端微生物难以培养共培养共代谢是一个方向可采用基因工程技术表达极端酶,第七节 生物可降解塑料菌株的分离筛选,白色污染：废弃塑料解决办法：分离生物可降解塑料菌株PHA特点:具有机械加工特性 生物可完全降解真养产碱杆菌产PHA可达细胞干重80%,第七节 生物可降解塑料菌株的分离筛选,（一）从自然界分离产生的微生物（二）利用活性污泥生产（三）构建基因工程菌生产生物可降解塑料,第七节 生物可降解塑料菌株的分离筛选,三、合成特点和发酵特点发酵过程需要充足碳源发酵初期氮源要丰富，供氧要充足；使菌体大量生长；细胞浓度达到一定程度时，减少氮源供应，降低溶解氧，有利于PHA合成,