病理学与病理生理学3硕士生病理与病生课件.ppt

抗体技术研究及产业化,冯振卿 Ph.D南京医科大学病理学系 卫生部抗体技术重点实验室2008年10月9日,细胞表面抗原,血型抗原,组织相容性抗原,白细胞分化抗原,CD2CD3CD25CD10CD20CD38CD45CD71CD41CD42CD8,.,肿瘤相关抗原,胃癌,肺癌,肝癌,鼻咽癌,大肠癌,宫颈癌,乳腺癌,结肠癌,卵巢癌,胰腺癌,喉癌,脑胶质瘤,骨肉瘤,病毒,HFRSV,新城疫,甲肝,轮状,登革,乙肝,RSV,乙脑,流感,马雅罗Mayaro,基孔贡亚Chikungunya,Ross River,罗斯河,盖塔Getah,柯萨奇,狂犬,新培斯Sindbis,细菌,大肠杆菌,沙门氏菌,痢疾杆菌,军团杆菌,结核杆菌,绿脓杆菌,麻风杆菌,霍乱弧菌,寄生虫,血吸虫,疟原虫,弓形虫,旋毛虫,丝虫,毛滴虫,绦虫,利什曼原虫,可溶性抗原,酶,血浆蛋白,毒素,细胞因子,补体,激素,小分子化合物,抗体技术的研究和抗体的研发，是生物技术发展的永恒主题 抗体广泛用于临床疾病的诊断和研究 目前在美国单克隆抗体类药物已占FDA所批生物药的3/4,第一章抗体类型和抗体技术发展,第一代 多克隆抗体 第二代 单克隆抗体 第三代 基因工程抗体 第四代 全人抗体 ？,鼠源单抗临床应用的障碍, 血清半衰期短，20h 抗原抗体结合力、亲和力不够 募集效应细胞产生副作用 HAMA反应：810天出现，2030天高峰，anti-id封闭与抗原结合位点，抗鼠抗体加速单抗清除 过敏性休克,影响单抗与靶细胞或抗原结合,引起变态反应和器官损害,HAMA反应示意图,第一代 多克隆抗体 第二代 单克隆抗体 第三代 基因工程抗体 第四代 全人抗体 ？,小鼠抗体,嵌合抗体,重构抗体,人源抗体,鼠 100% 33% 10% 0人 0 67% 90% 100%,第一代 多克隆抗体 第二代 单克隆抗体 第三代 基因工程抗体 第四代 全人抗体 ？,小鼠抗体,嵌合抗体,重构抗体,人源抗体,鼠 100% 33% 10% 0人 0 67% 90% 100%, 人鼠嵌合抗体 改型抗体（又称人源化抗体） 小分子抗体 双特异抗体 抗体融合蛋白,基因工程抗体的类型,1、嵌合抗体 将人Ig C区与鼠Ig V区相连接，从而在同一抗体分子中含有不同属来源的抗体。,构建嵌合抗体的基本原理，从杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因相连接，插入适当的载体中，构建成人鼠嵌合的重链和轻链基因，然后共转染骨髓瘤细胞，使之表达嵌合抗体。,表1 FDA批准上市的单克隆抗体药物,2、改型抗体 应用CDR移植技术，即将鼠单抗V区中互补决定区（CDR）序列取代人源抗体相应CDR序列，重构成既具有鼠源性单抗特异性，又保持人抗体亲和力的CDR移植抗体（CDR-grafted Ab），也称为改型抗体或人源化抗体。,表1 FDA批准上市的单克隆抗体药物,3、小分子抗体 利用细菌表达决定抗体特异性的结构域，所获抗体片段大小仅为IgG分子的1/3-1/12，因此称之为小分子抗体。,小分子抗体包括： Fab 1/3 Fv 1/6 ScFv 1/6 单域抗体 1/12 MRU,Fab片段 Fab片段由重链VH加CH1及完整的轻链构成，在细菌的启动子控制下，在大肠杆菌中表达而合成Fab，大小为完整抗体的1/3，其结构与木瓜蛋白酶消化完整抗体后所产生的Fab片段一致。用DNA重组技术制备的嵌合Fab片段，其V区为鼠源性，而CH1、C为人源性的。,FV片段 FV片段由VH和VL组成，是抗体的抗原结合部位，分子量只有完整分子的1/6。采用共价结合的FV片段，在不改变其分子大小的情况下，可避免VH或VL的解离。,单域抗体和最小识别单位 单域抗体是指VH或VL，其分子大小仅为完整抗体的1/12。由单个CDR构成的小分子抗体称为最小识别单位（MRU）。,单链抗体 单链抗体分子是由一条单一肽链按VH-Linker-VL 或VL-Linker-VH 的顺序组成。分子大小是完整抗体分子的1/6，ScFv是抗体与抗原结合的最小单位。,ScFv具有以下特点： 具有与原亲本抗体相同的特异性和亲和力，但由于分子很小，免疫原性弱，克服了完整抗体不易到达靶细胞、清除慢和易引起超敏反应及组织损伤等缺点； 制备流程较其他基因工程抗体简单，可由大肠杆菌发酵产生；, 无Fc段，所以减少了与非靶细胞上Fc受体结合，使其更特异性集中于靶细胞部位，有利于作为载体用于药物的导向治疗； 易进行分子改造，ScFv基因片段还可以与适当的酶基因或毒素蛋白基因重组，转入适当的表达系统，可产生出酶联抗体或具有与抗原结合特异性和细胞毒性的重组免疫毒素。,4. 双特异抗体(bispecific antibody,BsAb) 一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原决定簇。,制备： 化学偶联技术 基因工程技术 二次杂交瘤技术,在导向治疗中的应用药物导向 肿瘤细胞抗原 BsAb 效应物（细胞毒素等）细胞导向 肿瘤细胞抗原 BsAb 效应细胞（CTL、LAK等）,双特异性抗体,抗人肝癌单抗 /抗人 CD3单抗 抗Her2/neu单抗/抗人CD16单抗 抗人CD20单抗/抗人CD3单抗 抗人卵巢癌单抗/抗人CD3单抗,5. 抗体融合蛋白和免疫毒素 将编码抗原结合部位的基因片段（Fab或Fv段）与毒素或酶的基因融合在一起，可将特定的生物活性物质导向特定部位。,抗体融合蛋白,抗人卵巢癌单抗-IL-12,血吸虫病抗独特型抗体-IL-12,表1 FDA批准上市的单克隆抗体药物,重组免疫毒素,借助DNA重组技术，将编码抗体和毒素的基因连接在一起，产生的免疫毒素为重组免疫毒素。白喉毒素 相思豆毒素 假单胞菌外毒素优点：高效、非特异性毒性较低、体内稳定性较好、易穿透肿瘤、安全,全人抗体的研究,鼠-人杂交瘤 人-人杂交瘤 转人Ig基因组小鼠 抗体库技术 非杂交瘤技术制备单抗,通过基因转染方法改良鼠骨髓瘤细胞，筛选稳定的鼠-人嵌合细胞，使融合的杂交瘤细胞遗传性稳定，不易丢失染色体，可长期、稳定地分泌全人单克隆抗体。,鼠-人杂交瘤技术,鼠-人杂交瘤技术,问题： 鼠源成分残留 稳定性差 染色体丢失,人-人杂交瘤技术,问题：能稳定分泌抗体的亲本细胞很难获得稳定性差染色体易丢失,人-人杂交瘤技术 英国剑桥大学Karpas A(2001)报道建立了人-人杂交瘤技术，获得Karpas 707H人骨髓瘤细胞株，可制备全人抗体。,转入人的Ig基因组,免疫动物,全人抗体,基因敲除小鼠,转人Ig基因组小鼠,抗体库技术,基础： PCR技术的建立 抗体分子在大肠杆菌的功能性表达 噬菌体展示技术的发展,抗体库的种类： 初期的抗体库 噬菌体抗体库 大容量抗体库,人淋巴细胞 抗原筛选产生特异克隆 RT-PCR 轻链重链基因 转印至NC DNA重组 组合抗体库 E.coli随机表达,1.初期抗体库,噬菌体抗体（phage antibody）是将克隆的人Ab V区基因与一种丝状噬菌体DNA上的基因-或基因精确连接，转染细菌后在其膜表面表达Fab段（或单链抗体）-噬菌体外壳蛋白（基因-或基因产物）的融合蛋白。,2. 噬菌体抗体库,这种噬菌体在一定意义上讲相当于一个人B细胞克隆，将B细胞全套可变区基因克隆出来与噬菌体DNA相连，导入细菌体内使之表达，可制备人全套抗体，称为噬菌体抗体库。,问题： 1、从未经免疫动物的抗体库获得的抗体其亲和力不高,抗体体内生成的理论,抗原刺激前，机体具有抗体初级库 抗原刺激后，抗体生成的细胞群体被选择，并发生克隆性增殖。 在抗原的反复刺激下，抗体的V区发生高频率突变，产生高亲和力抗体的细胞被选择，抗体进行类别转换，最终抗体成熟。,抗体亲和力改造,链替换(Chain Shuffling),计算机辅助设计下的定点突变,高亲和力克隆的选择,2、抗体库的库容不足以涵盖某种动物的抗体多样性,3.大容量抗体库 ? 天然抗体库 半合成抗体库 全合成抗体库,抗体库的优点： 1.多数外源抗原对人体有害，不能随意对人体进行免疫。噬菌体抗体无须免疫，可直接从非免疫动物抗体库中筛选出特异性抗体，并能筛选针对该物种自身抗原的抗体； 2.轻、重链随机组合的多样性多于供体B细胞产生抗体的多样性，构建一种噬菌体抗体文库，可供产生针对多种特异性抗原的人源抗体，从而克服了难以建立人-人杂交瘤的困难； 3.细菌增殖快，培养成本低廉，适合工业化大规模生产，为临床大量应用抗体提供了可能。,总抗体库（master library）人们将有望在原核系统模拟体内免疫过程，并任意克隆针对任何抗原的抗体。,非杂交瘤技术制备单抗,人B淋巴细胞,转染EB病毒及生长因子,B细胞永生化,Humira是Abbott/CAT公司开发的一种治疗类风湿关节炎的抗体药物， 2002年上市，是完全人源化单抗，这是抗体药物发展具有里程碑意义大事，预示着抗体药物一个迅猛发展的新时代的来临。2003年有4亿美元的销售额，2005年达到11亿美元。Avastin 2003年上市的治疗结肠癌的抗体药物，也是第一个从抗体库中筛选出的 Fab 段抗体药物。 Avastin的上市使公司的股价上升了90亿美元。,第二部分抗体的应用及产业化研究,单克隆抗体的应用,基础研究,预 防,治 疗,诊 断, 抗体是生化、免疫学、生物芯片等多种诊断试剂中的核心生物原料，在各种疾病的诊断领域具有广泛的用途。我国目前用于临床诊断方面的抗体80% 依靠进口。国外已批准的诊断性单抗有600多种，我国仅60余种。,单克隆抗体用于诊断,单克隆抗体用于疾病诊断,传染病诊断,肿瘤诊断,免疫性疾病诊断,内分泌疾病诊断,血液病诊断, 心脑血管疾病、肿瘤、神经退行性疾病、传染病、自身免疫性疾病和内分泌性疾病等日益威胁着人类的健康。针对这些重要疾病，要不断研究和开发新的治疗药物。虽然化学药物一直占据主流地位，但抗体药物导向性强、副作用小、半衰期长等优势吸引了越来越多的投资。,单克隆抗体用于治疗,单克隆抗体用于疾病治疗,肿瘤,自身免疫性疾病,器官移植,心血管疾病,感染性疾病,表1 FDA批准上市的单克隆抗体药物,美国已上市18种单克隆抗体药物 2002年销售额 29亿美元 2003年 40亿美元 2005年 90亿美元 2008年 150亿美元 2010年 300亿美元,2002年完全人源化单抗humira获得批准上市，这是单克隆抗体药物发展具有里程碑意义大事。Humira是Abbott/CAT公司开发的一种治疗类风湿关节炎的单克隆抗体药物，2003年有4亿美元的销售额，2005年达到11亿美元。,Avastin 是美国FDA批准的治疗结肠癌的抗体药物，也是第一个从抗体库中筛选出的 Fab 段抗体药物。 Avastin的上市使公司的股价上升了90亿美元。,赫赛汀（英文名 Trastuzumab ），抗人表皮生长因子受体-2(HER-2)的人源化单克隆抗体，用于治疗转移性乳腺癌。 有25%-30%原发性乳腺癌患者HER2过度表达。,抗体药物临床应用广泛，市场需求巨大。抗体药物已占FDA批准生物技术药的3/4，所有新研发药物的1/3。,我国治疗用抗体的研制现状,中国仅有3个治疗性单抗药物获准上市抗乙脑中和抗体（鼠源）肺癌治疗性抗体（嵌合抗体）肝癌治疗性抗体（鼠源片断）,血吸虫病治疗性抗体狂犬病治疗性抗体禽流感治疗性抗体鼻咽癌治疗性抗体肝癌治疗性抗体, 抗独特型抗体疫苗（anti-id Ab vaccine）,单克隆抗体用于预防, 动 物 保护力（%） 昆明种 50.46 C57BL/6 42.05 BALB/c 39.53 山羊 42.78 BALB/c（同济） 40.50 ,血吸虫病抗独特型抗体疫苗动物保护性试验,单克隆抗体用于基础研究,细胞种类及亚型的分析,细胞信号转导途径的研究,细胞膜受体及其功能研究,蛋白质分离、纯化,基因分离及功能研究,单克隆抗体用于食品与环境监测,食品,水,土壤,抗体的大规模生产,发酵罐转基因动物反应器转基因植物反应器兔抗体鸡抗体 20只鸡蛋/月/一只鸡 100mgIgY/一只蛋黄,我国抗体工程研发中存在的主要问题,基因工程抗体表达量低,动物细胞规模化培养技术落后,新抗体研究滞后,今后抗体药物发展的方向,寻找新的靶抗原 建立高通量抗体制备和筛选技术 基于抗原立体结构设计和改造抗体 基于抗原-抗体相互作用设计抗体模拟物,基因工程抗体制备技术日臻成熟，全人抗体研究具有诱人的前景，临床应用有望进一步扩大，我国在抗体工程研究中应注重原创性，力争在国际竞争中占有一席之地。,谢 谢！,