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生物工程下游技术课件,第一章 绪 论,生物工程下游技术贯穿于人们的日常生活以及社会的生产实践中，在化学工业、生物工业、资源开发和环境保护等领域发挥着重要作用。就生产实践而言，生物工程下游技术的重要性在于，天然的以及化学和生物过程所产生的物质，均不同程度地与其他物质以混合物的形式存在。有用物质的最终产品需要达到较高的纯度，而有害物质需要充分净化和妥善处理，这些都必须借助各种分离操作加以实现。混合物的分离不能自发进行，需要外界能量。这种能量可以储存于分离介质中，或者通过分离设备以热能和（或）机械能的形式提供。因此，高效分离介质、分离技术与设备的开发和设计是生产实践的重要环节。对于生物物质，由于其性质和用途的特殊性，需要特殊的分离技术和更多步骤的分离过程，进一步增加了分离操作的难度，使分离过程在生物技术产业中的地位愈显重要。都必须借助各种分离操作加以实现。混合物的分离不能自发进行，需要外界能量。这种能量可以储存于分离介质中，或者通过分离设备以热能和（或）机械能的形式提供。因此，高效分离介质、分离技术与设备的开发和设计是生产实践的重要环节。 生物工程下游技术（生物分离技术）的定义：为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相关硬件设备的总称，指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程。生物工程下游技术是实现生物工程产业化的关键问题。,1.1 生物分离技术的特点1.1.1 生物分离技术特点 应用面广；种类繁多；产物在物料中含量低；价格与产物浓度呈反比；初始物料成分复杂；生物活性物质稳定性低；产品的质量要求高，尤其是药品等。 1.1.2 生物分离技术的重要性1、生化产品的必经的过程。2、回收率不高。抗生素（80%左右）， 蛋白质（60-90%）。3、分离纯化昂贵。下游研究费用占整个研究费用的50%以上；产品的成本构成中分离纯化的成本站全部成本的40-80%，精细和药用产品的成本比率更高，大多数酶70%。4、基因工程的R&D(研究与发展)费用，下游占50 -80%。基因工程表达产品成量要求高，尤其量是药品等。 5、中药现代化的重要技术平台。6、提供产品竞争力的关键技术之一。7、环境污染的治理。8、国家安全。1.1.3方法选择原则 尽可能简单、低耗、快速、成熟（总原则）；1、分离步骤尽可能少；2、避免相同原理的分离技术多次重复出现；3、尽量减少新化合物进入待分离的溶液；,4、合理的分离步骤次序（原则：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本）。设计前应了解信息：1)、产物物化性质（A、溶解度及影响因素,如温度、pH、有机溶剂和盐等；B、分子量和分子形状；C、沸点和蒸汽压；D、极性大小；E、分子电荷及影响因素，包括pH值和盐等；F、功能团；G、免疫原性；H、稳定性及其影响因素,包括温度、pH、毒性试剂等(如青霉素低pH不稳定)；I、pI）；2)、产品规格/质量标准；3)、进料的组成和物性。4)、生产规模；5)、危害性；6)、分批分离还是连续纯化。 生物生产过程的最后一个环节是把目标产物从反应液中加以分离成为符合质量要求的产品，并要求收率高，成本低。从酶反应液中分离产物相对要比从发酵液中分离产物容易得多，因后者首先要把细胞从发酵液中分离出来。若产物在胞内还得先将细胞破碎后才能进一步处理，若产物在胞外也必须先除去细胞获得滤液。在发酵过程中，必然还会同时产生很多非目标产物，但与目标产物理化性质相近，目标产物的含量往往是较少或很少的。此外，不少产物属活性生化物质，对热、pH以至剪切都很敏感，在分离过程中必须在低温和一定的pH范围和剪切应力下操作，并严格防止外界微生物和杂物的污染。 由此可见，生化分离是步骤多、要求高、对最终产品进行“把关”的生产环节，所含产品总成本的比例也较高，约为40%60%。,1.2 生物分离过程一般步骤 有关生物技术产品的一般分离路线如图11所示。下面对几类重要的生物技术产品的大致分离路线进行简短的介绍。1、溶剂类：如乙醇、丙酮-丁醇的发酵液，不必先行菌体去除，可将其直接进入醪塔。溶剂从塔顶馏出，菌体及其他固体物随废液在塔底放出。从醪塔馏出的溶剂还要经过精馏或分馏得到产品。2、柠檬酸：主要采用钙盐沉淀法，即将发酵液过滤后的滤液加入石灰乳，使柠檬酸形成钙盐而沉淀。沉淀物经加入硫酸后形成碳酸钙沉淀而将柠檬酸释出。在去除碳酸钙后的溶液经蒸发浓缩、结晶、离心、干燥后即得成品。3、抗生素类：大致可分为三种路线，但多数都需进行菌体分离。液-液萃取法，如青霉素、头孢霉素、红霉素、林可霉素等具有在偏中性pH时成盐能溶于水，而在酸性（带羧基的抗生素）或碱性,图1-1 生物技术产品的一般分离路线图,（带碱基的抗生素）情况下成酸或碱能溶于有机溶剂的特性，反复采用水和溶剂（对抗生素的溶解度大，而与水不互溶，但有一定密度差，且无害无毒）在不同pH情况下进行液-液萃取和反萃取。 萃取液经脱色等精制处理后，可进行结晶、干燥获得产品。离子交换法，如链霉素、庆大霉素、卡那霉素等氨基糖苷类抗生素和多粘菌素等能在一定条件下离解为阳离子或阴离子，故可使用离子交换树脂对其提取。其洗脱液经脱色、浓缩、喷雾干燥等精制工序即得成品。沉淀法，如用于四环类抗生素是利用其具有等电点（当溶液的pH等于两性物质的等电点时，该物质在水中的离解度最小，溶解度最大），该两性均质即沉淀而出。如认为纯度不够，可将其溶解后再形成某种不溶性盐后再进行过滤、干燥得到成品。离子交换法和沉淀法也适用氨基酸的分离。4、工业酶类：将发酵滤液或细胞匀浆后的滤液经沉淀、超滤、色层分离、透析、冷冻干燥等工序获得产品。由于酶是蛋白质物质，一切操作都应在低温下进行。,第二章 培养液的固液分离,概述 细胞的分离与胞内产物的溶解。如图11所示，通过微生物发酵或动植物细胞培养得到的原料液，应首先将其中的菌体或细胞与培养液分离。如果目标产物为胞外物，可直接利用培养液进行以后的分离纯化操作；如果目标产物为胞内物，则要对菌体或细胞进行适当的处理，释放目标产物，然后除去细胞或其碎片，再进行目标产物的分离纯化。本章介绍细胞分离、目标产物释放以及蛋白质复性的各种主要方法。2.1 发酵液的预处理 发酵液中蛋白质的去除这是指目标产物是非蛋白质物质的场合。 加热当目标产物为非热敏时，加热可使发酵液中蛋白质变性而改善固- 液分离条件，并使发酵液获得巴氏灭菌的作用。如链霉素发酵液在pH3 的条件 下，70加热半小时后可使过滤速度增加10100倍。 凝聚采用一种往发酵液中加入电解质的方法，使其中蛋白质发生凝聚 或絮凝。最简单的电解质是酸碱，其次是无机化合物，如三氯化铁、明 矾等。常用合成高分子电解质有聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺盐，并 常与无机化合物共用。 添加助滤剂主要作用是吸附蛋白质使发酵液易于过滤。常用的助滤剂,有硅藻土、珍珠岩、磨碎木浆、淀粉等。助滤剂的加入能改善可压缩性滤 饼的性能，形成更多的可透过通道，适用于过滤具有菌丝体的发酵液。2.2 分离方法2.2.1 过滤分离法 利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。 1、过滤速度 过滤操作一般以压力差为透过推动力，只靠重力不能达到足够大的透过速度。过滤操作中固形成分被过滤介质截留，在介质表面形成滤饼。滤液的透过阻力来自两个方面，即过滤介质和介质表面不断堆积的滤饼。 提高过滤速度和过滤质量是过滤操作的目标。由于滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素，因此在过滤操作以前，一般要对滤液进行絮凝或凝聚等预处理，改变料液的性质，降低滤饼的阻力。此外，可在料液中加人助滤剂 （如硅藻土）提高过滤速度。但是，当以菌体细胞的收集为目的时，使用助滤剂会给以后的分离纯化操作带来麻烦，故需慎重行事。随着过滤介质的不断改进，采用精密微滤膜介质的错流过滤法已逐渐成为过滤操作的主流。有关内容将在第7章中介绍。 2 、过滤设备 生化工业常用的过滤设备主要有加压叶滤机、板框过滤机、回转真空过滤机等。加压叶滤机由许多滤叶组合而成。每个滤叶以金属管为框架，内装多孔金属板，外罩过滤介质，内部具有空间，供滤液通过。加压叶滤机在密封条件下过滤，适于无菌操作；机体装卸简单，洗涤容易。但造价较高，过滤介质更换较复杂。,2.2.2 离心分离法 离心沉降是科学研究与生产实践中最广泛使用的非均相分离手段，不仅适用于菌体和细胞的回收或除去，而且可用于血球、胞内细胞器、病毒以及蛋白质的分离，也广泛应用于液液相分离。 差速离心分级差速离心是生化工业中最常用的离心分离方法。以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离是分级离心操作的一种特殊情况，即为一级分级分离。表21 为一些菌体的细胞的大小和离心操作条件。,表21 主要菌体和细胞的离心分离,可以看出，菌体和细胞一般在5005000g的离心力下就可完全沉降，工业规模的离心操作为提高分离速度，所用离心力较大。操作中，根据实际物系的特点（目标产物和其他组分的性质和相互作用等）、分离的目的和所需分离的程度，选择适当的操作条件（离心转数和时间），可使料液中的不同组分得到分级分离。图21 为差速离心分级细胞破碎液的一例。离心分离设备 离心机是生化实验室及生化工业广泛使用的分离设备。实验室用离心机以离心管式转子离心机为主，离心操作为间歇式。图22为各种形式的离心机转子。,图22 各种形式的离心机转子,图21 细胞破碎液的差速离心分级,工业用离心设备一般要求有较大的处理能力并可进行连续操作。离心分离设备根据其离心力（转数）的大小，可分为低速离心机、高速离心机和超离心机。生化用离心机一般为冷却式，可在低温下操作，称为冷冻离心机。各种离心机的离心力范围和分离对象列于表22。,表22 离心机的种类和适用范围 工业离心分离设备中，较为常用的有管式和碟片式两大类。管式离心机（图23 ）又称圆筒式离心机，结构比较简单。操作过程中，料液从圆管一端的中输入，在离心力作用下，管内液面基本上是以旋转轴为中心的圆筒面（斜线部分），从另一端的中心排出轻相（上清液）。间歇操作时，固体粒子沉降于管壁；连续操作时，从管壁附近的出口排出重相（浓缩的悬浮液）。管式离心机转数可达到2104 r / min 以上，离心力较,大，但缺点是沉降面积小，处理能力较低。碟片式离心机（图24 ）又称分离板式离心机，离心转子中有许多等间隔的碟型分离板，以增大沉降面积，提高处理能力。以连续操作为目的的碟片式离心机设有连续排出重相（浓缩悬浮液）的喷嘴（图24 b ）。操作过程中，料液从中心进料口输入，通过转子底部的液孔进入分离板外径处，进入分离板的间隙。通过分离板的间隙向转子中心移动过程中，重相（粒子）受离心力作用而沉降，轻相从转子上部出口排出。连续操作时，重相从喷嘴连续喷出。碟片式离心机结构复杂，离心转数一般较管式离心机低，约1104r / min。,图23 管式离心机图 24 碟片式离心机,2.3沉淀 沉淀：是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。另一种由溶解度降低引起的固体成相现象称为结晶（见第10 章）。与结晶相比，沉淀是不定形的固体颗粒。构成成分复杂：除含有目标分子外，还夹杂共存的杂质、盐和溶剂。因此，沉淀的纯度远低于结晶，沉淀法是一种初级分离技术。但是，多步沉淀操作也可制备高纯度的目标产品。 利用沉淀原理分离蛋白质起源于19 世纪末，是传统的分离技术之一，目前广泛应用于实验室和工业规模蛋白质等生物产物的回收、浓缩和纯化。本节以蛋白质的沉淀分级为主，介绍蛋白质的表面特性及其沉淀原理、各种沉淀方法和沉淀生成动力学。2.3.1盐析法 原理 水溶液中蛋白质的溶解度一般在生理离子强度范围内（0.150.5mol / kg ）最大，而低于或高于此范围时溶解度均降低。如图25蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析。当离子强度较高时，溶解度的对数与离子强度之间呈线性关系，用Cohn 经验方程描述。 logS = KsI 式中 S 蛋白质的溶解度，g / dm3 常数； Ks盐析常数； I 离子强度，mol/ dm3,图25蛋白质溶解度与离子强度（硫酸胺）的关系 电解质影响蛋白质溶解度的机理尚不十分清楚，有不同的理论解释。但一般认为，向蛋白质的水溶液逐渐加入电解质时，开始阶段蛋白质的活度系数降低，并且蛋白质吸附盐离子后，带电表层使蛋白质分子间相互排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而蛋白质的溶解度增大，这种现象称为盐溶。随着离子强度的增大，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱同时，由于盐离子的水化作用使蛋白质表面疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出疏水区域，从而增大了蛋白质表面疏水区之间的疏水相互作用，容易发生凝聚，进而沉淀。所以，一般在蛋白质的溶解度与离子强度的关系曲线上存在最大值，该最大值在较低的离子强度下出现，在高于此离子强度的范围内，溶解度随离子强度的增大迅速降低。,影响盐析的因素 1、无机盐在相同的离子强度下，不同种类的盐对蛋白质的盐析效果不同。图26 为七种盐对氧碳血红蛋溶解度的影响。盐的种类主要影响Cohn 方程中的盐析常数Ks , 图26 中的各条溶解度曲线具有不同的斜率（即Ks 值）。盐的种类对蛋白质溶解度的影响与离子的感胶离子序列或Hofmeister 序列相符，即离子半径小而带电荷较多的阴离子的盐析效果较好。例如，含高价阴离子的盐比1-1价盐的盐析效果好，即盐析常数大。常见阴离子的盐析作用顺序为：阳离子的盐析作用的顺序为： 在选择盐析的无机盐时，除考虑上述各种离子的盐析效果外，对盐还有如下要求： ( 1 ）溶解度大，能配制高离子强度的盐溶液。 ( 2 ）溶解度受温度影响较小。 ( 3 ）盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉降或离心分离。 硫酸铵价格便宜、溶解度大且受温度影响很小、具有稳定蛋白质（酶）的作用，因此是最普遍使用的盐析盐。,图26不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系,但硫酸铵有如下缺点：硫酸铵为强酸弱碱盐，水解后使溶液pH 降低，在高pH下释放氮；硫酸铵的腐蚀性强，后处理困难；残留在食品中的少量的硫酸按可被人味觉感知，影响食品风味；临床医疗有毒性，因此在最终产品中必须完全除去。除硫酸按外，硫酸钠和氯化钠也常用于盐析。硫酸钠在40 以下溶解度较低，主要用子热稳定性高的胞外蛋白质的盐析。 2、温度和pH 值除盐的种类外，盐析操作的温度和pH 是获得理想盐析沉淀分级的重要参数。温度和pH 对蛋白质溶解度的影响反映在Cohn 方程中是对值的影响。一般物质的溶解度随温度的升高而增大，但在高离子强度溶液中，升高温度有利于某些蛋白质的失水，因而温度升高，蛋白质的溶解度下降，如图27 所示。但是，必须指出，这种现象只在离子强度较高时才出现。在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升高而增大。 在pH 接近蛋白质等电点的溶液中蛋白质的溶解度最小（值最小），所以调节溶液pH 在等电点附近有利于提高盐析效果。因此，蛋白质的盐析沉淀操作需选择合适的pH 和温度，使蛋白质的溶解度较小。同时，盐析操作条件要温和，不能引起目标蛋白质的变性。所以，盐析和后述的其他沉淀法一样，需在较低温度下进行，但不像有机溶剂沉淀法那样要求严格。2.3.2 等电点法 在上节所述的盐析沉淀中，有时也要结合等电点沉淀的原理，使盐析操作在等电点附近进行，降低蛋白质的溶解度。但是，利用中性盐进行盐析时，使蛋白质溶解度最低的溶液pH一般略小于蛋白质的等电点。 等电点沉淀的操作条件是：低离子强度；pHpI。因此，等电点沉淀操作需在低离子强度下调整溶液pH 至等电点，或在等电点的pH下利用透析等方法降低离子强度，使蛋白质沉淀。由于一般蛋白质的等电点多在偏酸性范围内，故等电点沉淀操作中，多通过加入无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸等）,调节pH 。 等电点沉淀法一般适用于疏水性较大的蛋白质（如酪蛋白），而对于亲水性很强的蛋白质（如明胶），由于在水中溶解度较大，在等电点的pH 下不易产生沉淀。所以，等电点沉淀法不如盐析沉淀法应用广泛。但该法仍不失为有效的蛋白质初级分离手段。例如，从猪胰脏中提取胰蛋白酶原（pI=8.9）时，可先于Ph3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质（pI=3.0）工业生产胰岛素(pI=5.3)时，先调pH 至8.0除去碱性蛋白质，再调pH 至3.0除去酸性蛋白质（同时加人一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果）。 与盐析法相比，等电点沉淀的优点是无需后继的脱盐操作。但是，如果沉淀操作的pH 过低，容易引起目标蛋白质的变性。2.3.3 有机溶剂沉淀 向蛋白质溶液中加人丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，水的活度降低。随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而凝聚和沉淀。同等电点沉淀一样，有机溶剂沉淀也是利用同种分子间的相互作用。因此，在低离子强度和等电点附近，沉淀易于生成，或者说所需有机溶剂的量较少。一般来说，蛋白质的相对分子质量越大，有机溶剂沉淀越容易，所需加人的有机溶剂最也越少。 有机溶剂沉淀法的优点是：有机溶剂密度较低，易于沉淀分离；与盐析法相比，沉淀产品不需脱盐处理。但该法容易引起蛋白质变性，必须在低温下进行。另外，应用有机溶剂沉淀时，所选择的有机溶剂应为与水互溶、不与蛋白质发生作用的物质常用的有丙酮和乙醇。 乙醇沉淀法早于40年代就应用于血浆蛋白质（如血清白蛋白）的制备加 ，目前仍用于血浆制剂的生产。,2.3.4 热沉淀 在较高温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性沉徒，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。必须指出，热沉淀是一种变性分离法，带有一定的危险性，使用时需对目标产物和共存杂蛋白的热稳定性有充分的了解。,第三章 细胞破碎,细胞破碎的意义：微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但有些目标产物存在于细胞内部。目前重组DNA技术，表达的产品（如胰岛素、干扰素、白细胞介素等），都是胞内产物。首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。细胞破碎主要用于以大肠杆菌为宿主生产重组多肽药物的场合，这时蛋白质以沉淀的形式存在于细胞之内。某些代谢产物，如抗生素、类脂、核酸、酶等也有产生在胞内的，但其中相当大一部分不必先破壁，因为在萃取过程中，细胞壁同时被破碎。细胞的结构根据细胞种类而异。动物、植物和微生物细胞的结构相差很大，而原核细胞和真核细胞又有所不同。动物细胞没有细胞壁，只有由脂质和蛋白质组成的细胞膜，易于破碎。植物和微生物细胞的细胞膜外还有一层坚固的细胞壁，破碎困难，需用较强烈的破碎方法。3.1 细胞壁的结构 革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层组成，而革兰氏阴性菌的细胞壁在肽聚糖层的外侧还有分别由脂蛋白和脂多塘及磷脂构成的两层外壁层（图31）。革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，约1550nm ，肽聚糖含量占40 90 。革兰氏阴性菌的肽聚搪层约1.52.0nm ，外壁层约810nm 。因此，革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌坚固，较难破碎。,图31 细菌的细胞壁结构 酵母的细胞璧由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质构成，比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎例如，面包酵母的细胞壁厚约70nm 其他真菌的细胞壁亦主要由多糖构成，此外还有少量蛋白质和脂质等成分。 原核细胞和真核细胞的细胞膜均由脂质和蛋白质构成，二者之和占细胞膜构成成分的80 100 。原核细胞和真核细胞的内部结构相差很大。原核细胞结构简单，无细胞核，一般由细胞浆和核糖体构成。真核细胞的细胞质内包含丰富的细胞器，如线粒体、核糖体、叶绿体、内质网和高尔基体等。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，释放其中的目标产物。,细胞破碎和产物释放原理 细胞破碎主要采用各种机械破碎法和化学破碎法，或机械破碎法和化学破碎法的结合。机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力。化学破碎又称化学渗透，利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率。或者完，全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。3.2 细胞破碎法3.2.1 机械破碎法 机械破碎处理量大、破碎效率高、速度快，是工业规模细胞破碎的主要手段。细胞破碎器与传统的机械破碎设备的操作原理相同，主要基于对物料的挤压和剪切作用。但根据细胞为弹性体、直径小、破碎难度大和以回收胞内产物为目的、需低温操作等特点，细胞破碎器采用了特殊的结构设计。细胞的机械破碎主要有高压匀浆、珠磨、撞击破碎和超声波破碎等方法。3.2.1.1 高压匀浆法（大规模细胞破碎法） 高压匀浆又称高压剪切破碎。图32 是高压匀浆器的结构简图。高压匀桨器的破碎原理是：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速（可达到450m/ s ）喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎高压匀浆器的操作压力通常为50 70MPa 。 工作原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂。,图32 高压匀浆器结构简图 高压匀浆法中影响细胞破碎的因素 （1）破碎动力学方程 1/(1-r)=ktnpx 式中r细胞破碎率， P操作压力， N悬浮液通过匀浆器的次数，,Kt与温度等有关的破碎常数， X与微生物种类有关的常数。对于酵母菌x值可取2.2 （2）影响破碎的主要因素 由方程知主要因素有p、n、kt(温度)、菌体的种类和生长环境 1）一般p上升，n上升、R上升。但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也 有实验表明p超生一定值时，R增加但很慢。工业生产中，通常压力为55- 70mpa。 2）T上升，R上升，5-30，酵母浓度450-750kg/m3的R上升提高1.5 倍。但高温只适用于非热变性产物。 3）菌体种类：较小的G+，易造成堵塞（针阀）的团状或丝状真菌，含有质 地坚硬的 包含体的基因工程菌（易操作针阀），不宜采用高压匀浆法破 碎。 高压匀浆法的特点 高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达到20左右。团状和系状菌易造成高压匀浆器堵塞，一般不宜使用高压匀浆法。高压匀浆操作的温度上升约10MP，为保护目标产物的生物活性，需对料液作冷却处理，多级破碎操作中需在级间设置冷却装。置因为料液通过匀浆器的时间很短（204ms），通过匀浆器后迅速冷却，可有效防止温度上升，保护产物活性。 3.2.1.2 珠磨法 图33 是水平密闭型珠磨机的结构简图。珠磨机的破碎室内填充玻璃（密度为2.5g/cm3 ）或氧化锆（密度为6.0g / cm3 )微球（粒径约0.11.0mm），填充率为80 85。在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动。,微球和微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。 工作原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂（玻功小珠、石英砂、氧化铝d1mm）一起快速搅拌，细胞与研磨剂之间互相碰撞、剪切，使细胞破碎，释放内含物。,图33 珠磨机结构简图,影响细胞破碎的因素。 （1）破碎动力学方程（一级方程） 对于间歇操作 ln1/(1-r)=kt 对于连续操作 ln1/(1-r)=kI I=v/qv 相当于反应时间， 即破碎时间式中 R破碎率（%）， k速率常数（1/S）， t破碎时间（s） t平均停留时间（s）， v破碎室悬浮液体积(l)， q进料速率（l/s） （2）R的因素：R上升，则k上升，t上升，延长研磨时间k（破碎速率常 数）与许多操作参数有关： 珠体直径一般珠体越小，细胞破碎速度也越快，但太小易于漂浮，难以保留在研磨机腔体中，易带出。实验室规模研磨机0.2mm，工业规模不得小于0.4mm。 珠体的装量：升高，可以提高破碎率。但装量大，能量耗大（搅拌要求高），但热扩散下降，引起温度升高。宜控制在80%90%珠体体积/腔体自由体积。,细胞浓度料液性质：细胞浓度对悬浮液的流变特性具有影响，所以会影响破碎率。但文献报道中互相矛盾。最佳的细胞浓度应该用实验来确定。 搅拌器转速与构型：转速上升，能增加R，但过高的转速使能耗上升，且还会使R下降，应适当。 操作温度：适当提高温度（理论T上升，K上升，但实际产物不变），（5-40）对产物影响较小，热积用冷却套来散发。 因此：在料液一定时，延长t，适当增加装量，提高转速和温度都可有效地R上升， （3）R的确定（根据产物的总收率，及下游过程确定） 珠磨法的破碎率一般控制在80%因为高的R，能耗大；产热多，冷却难 度大；产物失活损失上升；细胞碎层小，不易分离，给下一步操作带来 困难。,表31高压匀浆法与珠磨法比较,3.2.2 超声波破碎法 工作原理 1、过程：超声波空穴泡速迅闭合极强的冲击波粘滞性的细胞剪切 应力引起胞内液流细胞破碎 2、原理：空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞破碎 影响因素 声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型 特点： 1）适应于实验室规模的应用（操作简单、液量损失少，可加冰或加冷水） （大规模操作时，声能传递和散热困难） 2）易失活物质不宜用（超声波可促使产生一些化学自由基因使 物失活） 3）G-杆菌破碎效果好，酵母菌效果差。利用酶反应，分解破坏细胞壁上的 特殊键，从而达到破壁的目的。有两种酶溶法：外加酶法、自溶法。3.2.3 酶溶法3.2.3.1外加酶法 1）种类 溶菌酶，B-3，3-葡聚糖酶，B-1，6-葡聚糖酶，蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽键内切酶，壳多糖酶，细胞壁溶解酶（复合酶）。酶有专一性。 可根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应次序。例如对酵母细胞，先加入加胞壁-溶解蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶溶解葡聚糖，剩下原生质在渗透区改变时，膜破裂胞内质释出，甘露糖酶可以加速这一过程。,3.2.3.2 自溶法 所需的溶胞酶： 1）是由微生物自己产生的，以便使生长繁殖过程进行下去； 2）可控制一定的条件（温度、时间、PH、激活剂和细胞代谢途径）使微生物产生过剩的溶酶胞或激发该酶的活性。 缺点： 对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质变性。 自溶后，细胞悬浮液粘度上升，过滤速率下降。3.2.4 化学渗透法 定义：使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性）的化学试剂，使胞内物质有选择地渗透出来，称为化学渗透法。 化学试剂及其原理 1）表面活性物质：促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞破碎。 例：TritonX-100是一种非离子型清洁剂，参考流水性的磷脂亲和力强， 破坏了内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物释放出来。 2）EDTA螯合剂：与结构中ca2+或Mg2+螯合，使其原有结构破坏而破 裂。例：G-壁外膜层中靠ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持其结 构，EDTA螯合后，脂多糖分子脱落，外膜层出现洞穴。内膜层的磷脂来 填补，从而使内层膜通透性增强，胞内物释放出来。 3）有机溶剂：能被 细胞壁中的类脂吸收，使胞壁膜溶胀，导致细胞破碎。例：甲苯、苯、二 甲苯、氯仿、高级醇等。 4）变性剂：与水中氢键作用，减弱水的极性，使疏水性化合物溶于水。例： 胍能从大肠杆菌膜碎片中溶解蛋白。,特点 优点： 1）选择性释放产物。如：可使一些较小分子量的溶质，如多肽和小 分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。 2）细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一 步提取。缺点： 1）通用性差，某种试剂只能作用于某种特定类型细胞； 2）时间长、效率低，胞内物一般释放率不超过80%； 3）有些化学试剂有毒，在其后产物提取精时，需分离除去。3.2.5 反复冻融法 定义：将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。 原理 1）冷冻使细胞膜的疏水键结构破裂，亲水性能上升； 2）胞内水形成冰晶粒，剩余胞质盐浓上升，外水进入，溶胀而破碎。 特点：只适用于细胞壁较脆弱的菌体。 3.3 综合对比,表32 各种细胞破碎方法对比,萃取是一种初步分离纯化技术。如上所述萃取法根据参与溶质分配的两相不同而分为多种，如液固萃取、液液有机溶剂萃取、双水相萃取和超临界流体萃取等，每种方法均各具特点适用于不同种类生物产物的分离纯化。因此，本章从萃取分离的基本概念和理论入手。分别介绍各种萃取技术的原理、特点、应用以及设备和操作设计的理论基础。4.1 萃取基本概念 萃取是利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作，所以，萃取操作中至少有一相为流体，一般称该流体为萃取剂。以液体为萃取剂时，如果含有目标产物的原料也为液体，则称此操作为液液萃取；如果含有目标产物的原料为固体，则称此操作为液固萃取或浸取（Leaching ) 。以超临界流体为萃取剂时，含有目标产物的原料可以是液体，也可以是固体，称此操作为超临界流体萃取。另外，在液液萃取中，根据萃取剂的种类和形式的不同又分为有机溶剂萃取（简称溶剂萃取）、双水相萃取、液膜萃取和反胶团萃取等。各种萃取方法将在第三节以后顺次介绍。 图41表示互不相溶的两个液相，上相（密度较小）为萃取剂（萃取相），下相（密度较大）为料液（料液相），两相之间以一界面接触。在相间浓度差的作用下，料液中的溶质向萃取相扩散，溶质浓度不断降低，而萃取相中溶质浓度不断升高（图42)。在此过程中，料液中溶质浓度的变化速率即萃取速率可用下式表示：,第四章 萃 取,式中c 料液相溶质浓度，mol / dm3 c* 与萃取相中溶质浓度呈相平衡的料液相溶质浓度，mol/ dm ； t 时间，s ； k 传质系数，m/s a 以料液相体积为基准的相间接触比表面积，m-1 。,图41 两液相接触状态示意图,当两相中的溶质达到分配平衡（c=c*）时，萃取速率为零，各相中的溶质浓度不再改变。很明显，溶质在两相中的分配平衡是状态的函数，与萃取操作形式（两相接触状态）无关。但是，达到分配平衡所需的时间与萃取速率有关，而萃取速率不仅是两相性质的函数，更主要的是受相间接触方式即萃取操作形式的影响。 4.2 物理萃取和化学萃取 物理萃取即溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。例如，利用乙酸丁醋萃取发酵液中的青霉素即属于物理萃取。化学萃取则利用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。萃取剂与 溶质之间的化学反应包括离子交换和络合反应等。例如，利用季铵盐（如氯化三辛基甲铵，记作R+ Cl-）为萃取剂萃取氨基酸时，阴离子氨基酸,图42 萃取过程中料液中料液相和萃取相溶质浓度变化,阴离子氨基酸（A -）通过与萃取剂在水相和萃取相间发生下述离子交换反应而进入萃取相。 其中横杠表示该组分存在于萃取相（下同）。 化学萃取中通常用煤油、己烷、四氯化碳和苯等有机溶剂溶解萃取剂，改善萃取相的物理性质，此时的有机溶剂称为稀释剂。 物理萃取广泛应用于石油化工和抗生素及天然植物中有效成分的提取过程，而化学萃取主要用于金属的提取，也可用于氨基酸、抗生素和有机酸等生物产物的分离回收。4.3 有机溶剂萃取 有机溶剂萃取简称溶剂萃取。是石油化工、湿法冶金和生物产物分离纯化的重要手段，具有处理量大、能耗低、速度快等特点，并且易于实现连续操作和自动化控制。本节主要介绍有机溶剂与水相直接接触的常规溶剂萃取法，而近年来不断发展的液膜萃取和反胶团萃取将在后两节中介绍。 弱电解质的分配平衡 溶剂萃取常用于有机酸、氨基酸和杭生素等弱酸或弱碱性电解质的萃取。弱电解质在水相中发生不完全解离，仅仅是游离酸或游离碱在两相产生分配平衡。而酸根或碱基不能进入有机相。所以，萃取达到平衡状态时，一方面弱电解质在水相中达到解离平衡，另一方面未解离的游离电解质在两相中达到分配平衡。,4.3.1 溶剂萃取操作 1、水相物理条件的影响 无论是物理萃取还是化学萃取，水相pH值对弱电解质分配系数均具有显著影响。物理萃取时，弱酸性电解质的分配系数随pH 降低（即氢离子浓度增大）而增大，而弱碱性电解质则正相反。例如，红霉素是碱性电解质。在乙酸戊酯和pH 9.8 的水相之间分配系数为44 . 7 ，而水相pH 降至5.5 时，分配系数降至14.4 。 温度也是影响溶质分配系数和萃取速度的重要因素。选择适当的操作温度，有利于目标产物的回收和纯化。但由于生物产物在较高温度下不稳定，故萃取操作一般在常温或较低温度下进行。 此外，无机盐的存在可降低溶质在水相中的溶解度，有利于溶质向有机相中分配，如萃取维生素B12 时加人硫酸铵，萃取青霉素时加人氯化钠等。但盐的添加量要适当，以利于目标产物的选择性萃取。2 、有机溶剂或稀释剂的选择 根据目标产物以及与其共存杂质的性质选择合适的有机溶剂，可使目标产物有较大的分配系数和较高的选择性。根据相似相溶的原理，选择与目标产物极性相近的有机溶剂为萃取剂，可以得到较大分配系数。此外，有机溶剂还应满足以下要求： （1）价廉易得； （2）与水相不互溶； （3）与水相有较大的密度差，并且粘度小，表面张力适中，相分散和相分离 较 容易； （4）容易回收和再利用； （5）毒性低，腐蚀性小，闪点低，使用安全；,（6）不与目标产物发生反应。3 、化学萃取剂 由于氨基酸和一些极性较大的抗生素的水溶性很强，在有机相中的分配系数很小甚至为零，利用一般的物理萃取效率很低，需采用化学萃取。氨基酸的化学萃取剂如前所述。可用于抗生素的化学萃取剂有长链脂肪酸（如月桂酸）、烃基磺酸、三氯乙酸、四丁胺和正十二烷胺等，由于萃取剂与抗生家形成复合物分子的疏水性比抗生素分子本身高得多，从而在有机相中有很高的溶解度。因此，在抗生素萃取中萃取剂又称带溶剂。例如，月桂酸可与链霉素形成易溶于丁醇、乙酸丁酯和异辛醇的复合物，此复合物在酸性（pH5.55.7 ）条件下可分解。因此，链霉素可在中性条件和月桂酸的存在下进行萃取，然后用酸性水溶液进行反萃取，使复合物分解，链霉素重新溶于水相中。又如，柠檬酸在酸性条件下与磷酸三丁酯反应生成中性络合物，该中性络合物易溶于有机相。4 、乳化现象 实际发醉产物的萃取操作中常发生乳化现象。乳化即水或有机溶剂以微小液滴形式分散于有机相或水相中的现象。产生乳化后使有机相和水相分层困难，出现两种夹带： 发酵废液（萃余液）中夹带有机溶剂（萃取液）微滴，使目标产物受到损失； 有机溶剂（萃取相）中夹带发酵液（萃余液），给后处理操作带来困难。 产生乳化的主要原因是发酵液中存在的蛋白质和固体颗粒等物质，这些物质具有表面活性剂的作用，使有机溶剂（油）和水的表面张力降低，油或水易于以微小液滴的形式分散于水相或油相中。油滴分散于水相称为水包油型或O/W型乳浊液，而水滴分散于油相称为油水型或W/O型乳浊液。油滴分散于水相称为水包油型或O/W型乳浊液，而水滴分散于油相称为油水型或,W/O 型乳浊液。在表面活性剂的存在下油水形成乳浊液的现象是乳化液膜萃取的理论基础，但在通常的有机溶剂萃取操作中需尽量避免其产生。产生乳化后，需采取某种手段破坏乳浊液，提高萃取操作效率。 在实施萃取操作前，对发酵液进行过滤或絮凝沉淀处理，可除去大部分蛋白质及固体徽粒，防止乳化现象的发生，产生乳化后，可根据乳化的程度和乳浊液的形式，采取适当的破乳手段。如果乳化现象不严重，可采用过滤或离心沉降的方法，对于OW型乳浊液，加入亲油性表面活性剂，可使乳浊液从OW 型转变成WO 型。但由于溶液条件不允许W/O 型乳浊液的形成，即乳浊液不能存在，从而达到破乳的目的。相反，对于WO 型乳浊液，加入亲水性表面活性剂如十二烷基磺酸钠可达到破乳的目的。4.4 双水相萃取 双水相系统 根据热力学第二定律可知，混合是熵增加的过程，因而可自发进行。但另一方面，分子间存在相互作用力，并且这种分子间相互作用力随相对分子质量的增大而增大。因此，传统观点认为，当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。可形成双水相的双聚体系很多，如聚乙二醇（PEG）