微生物的遗传、变异和菌种的选育、保藏(二)课件.ppt
基因重组 凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组或遗传重组。 作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。 在基因重组时，不发生任何碱基对机构上的变化。,一、杂交 重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交。 一般所说的杂交则是细胞水平上的一个概念。 杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。,二、转化 受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。 转化发生的条件： 受体细胞要处于感受态；供体DNA片段大小适宜，分子量一般为1107 D 左右；菌株间的亲缘关系密切。 转化的类型：自然遗传转化和人工转化。,感受态：受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期。 转化因子：本质是供体DNA片段。 一般的转化因子都是线状双链DNA；也有少数报道认为线状单链DNA也有转化作用。,转化的过程 以肺炎链球菌抗链霉素菌株为例，大致可分为六阶段： 吸附：双链DNA片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。在吸附过程的前阶段，如外界加入DNA酶，就会减少转化子的产生。稍后，DNA酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细胞；,切割：在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为45106的DNA片段； 入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5105的DNA片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率；,重组：来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA交换、整合和取代，于是形成了一个杂合DNA区段（heterozygous region）。在这一过程中，有核酸酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与；,复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因； 转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。,转化的过程,三、转导 以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，称转导子。,转导的种类：,完全普遍转导 普遍转导 流产普遍转导 转导 低频转导 局限转导 高频转导,1、普遍性转导 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。 1）完全(普遍性)转导 P22在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数（10 6 10 8）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体DNA片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身DNA的缺陷噬菌体。,供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，使其感染复数1，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源DNA片段导入受体细胞内。 在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。,完全普遍转导,2）流产普遍性转导 受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导。 现象：发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释，,所以，能在选择性培养基平板上形成微小菌落就是流产转导的特点。,2、局限性转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。 特点：噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体；只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）；该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带；缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率（约10 5）“误切”，或由于双重溶源菌的裂解而形成（约形成50%缺陷噬菌体）。,1）低频转导（LFT） 一般的转导现象中，从宿主染色体上切离时发生不正常切离的频率极低，故这种裂解物中的部分缺陷噬菌体的比例是极低的（104106）。把这种裂解物称为LFT（低频转导）用LFT裂解物以低 m.o.i（感染复数）感染宿主，就可获得极少量的局限转导子，即低频转导。,2）高频转导（HFT） 当用LFT裂解物以高m.o.i （感染复数）感染E. coli gal（不发酵半乳糖的营养缺陷型）菌株时，凡是感染有dgal噬菌体任一细胞，几乎都同时感染有正常的噬菌体。这时与dgal同时整合在一个受体菌的核染色体组上，从而使它成为一个双重溶源菌。当双重溶源菌被紫外线等诱导时，其中的正常噬菌体的基因可补偿dgal缺失的部分基因功能，因而两种噬菌体就同时获得复制的机会。所以在双重溶源菌中的正常 噬菌体被称为助体（或辅助）噬菌体。,双重溶源菌的裂解物中含有等量的 和dgal粒子，称为HFT（高频转导）裂解物。 用HFT裂解物以低 m.o.i （感染复数）感染另一个E. coli gal（不发酵半乳糖的营养缺陷型）受体菌，就可以高频率地把它转化为能发酵半乳糖的E. coli gal+ 转导子。是为高频转导。,基因工程 基因工程：用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质-DNA大分子提取出来，在离体的条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中使供体DNA进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。 基因工程在食品工业中的应用： 工程菌的构建（外源基因的表达、工业发酵用菌种的改造） 工业用酶蛋白的改性（第二代基因工程）,一、基因工程技术 基因工程操作一般分为以下四个步骤： 目的基因的取得 载体的选择 目的基因与载体DNA的体外重组 重组载体引入受体细胞,获得目的基因的主要方法： （1）从供体细胞的DNA中分离（酶切法、PCR扩增）。 （2）通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA（拷贝数少的目的基因的获得）。 （3）由化学方法合成特定功能的基因（磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法，合成的长度150200bp，作用：合成基因的元件、合成引物、合成探针、用于基因的定点诱变、作为重组DNA连接的构件）。,载体的选择 载体必须具备的几个条件：（1）必须是一个复制子；（2）在受体细胞中有较高的复制率；（3）最好只有一个内切酶切口；（4）必须具有选择性遗传标记。 目前常用载体：（1）质粒载体；（2）噬菌体载体；（3）柯斯质粒载体（噬菌体DNA的COS序列和质粒复制子构成的特殊类型的质粒载体）。,目的基因与载体DNA的体外连接 核酸内切酶与DNA分子的体外切割： 在基因工程中，必须使用特定的内切酶（一般为型内切酶）消化目的基因与载体DNA，使它们产生互补的粘性末端或平末端，如E.coli消化DNA 产生的粘性末端为： G3 5AATTC CTTAA5 3G,目的基因与载体DNA用同一种内切酶消化，即产生相同的粘性末端，在低温（5-6）下进行退火时，互补的粘性末端配对重新形成带缺口的双链。 DNA连接酶进行目的基因与载体DNA的体外连接： 粘性末端连接（来源于E.coli的DNA连接酶）；平末端连接（ T4 DNA连接酶）。,重组载体引入受体细胞受体细胞的种类： 微生物细胞（E.coli B.subtilis S.cerevisiae） 植物细胞 动物细胞 重组载体引入受体细胞的方法： 转化 转染,二、基因工程的应用及发展前景 基因工程在工业、农业、医疗、环保方面的应用。 基因工程与基本理论研究的关系。 基因工程的展望,
