微生物遗传变异课件.ppt

第 四 章 微生物遗传和变异,目的要求：通过本章的学习，使学生掌握细菌基因重组，真菌基因重组和微生物诱变育种的基本原理和方法。要求掌握：1、细菌基因重组的原理和方法。2、真菌基因重组的原理和方法。3、微生物诱变育种的原理和方法。4、基因工程的基本原理5、基因表达的调控重 点：基因突变及修复、细菌的基因重组难 点：低频转导，高频转导，准性生殖，基因表达的调控,遗传：,亲代与子代相似,变异：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一,遗传型：(genotype),表型：(phenotype),生物的全部遗传因子所携带的遗传信息,具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。,遗传型环境条件,表型,表型饰变：,表型的差异只与环境有关，不涉及遗传物质结构改变，只发生在转录、转译水平上的表型变化特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,遗传型变异（基因突变）：,遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9）,Production of a red pigment (prodigiosin) by Serratia marcescens（粘质沙雷氏菌）. From left to right: slant culture grown at 25C, slant culture grown at 37C, broth culture grown at 25C, broth culture grown at 37C.,微生物是遗传学研究中的明星：,微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体， 方便建立纯系。 很多常见微生物都易于人工培养，快速、大 量生长繁殖。 物种和代谢类型多样 对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株， 操作性强。,第一节 遗传的物质基础,1、经典转化实验肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有 致病能力） R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无 致病能力）,一、三个证明核酸是遗传物质的经典实验,1928年，F.Griffth的转化实验,1944年，Avery的转化实验，确定了转化因子,实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA！,2、噬菌体感染实验,实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。,32P标记DNA,35S标记蛋白质,3、植物病毒TMV重建实验,实验证明，TMV的遗传物质是RNA。,朊病毒的发现和思考:,朊病毒,蛋白质是遗传物质,？,1、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和形式（一）遗传物质在7个水平上的形式,1、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的,2、细胞核水平真核生物 细胞核 核染色体原核生物 核区 DNA链,核基因组,在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质,3、染色体水平真核生物染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构真核生物通常为多倍体原核生物的染色体只有闭合环状的DNA链原核生物为单倍体染色体的数目在不同的生物中是不同的,4、核酸水平核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链； 环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异,微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。,5、基因水平,它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的DNA片段。,1909年 丹麦生物学家WJohansen,结构基因：是为细胞结构、组成(如细胞生化反应所需的酶)及 完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。调节基因：用于编码调节蛋白的基因。操纵基因：是位于启动子和结构基因之间的一段碱基顺序， 能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转 录是否能进行。 重复基因：DNA片段重复跳跃基因：可在DNA上转移位置的基因（IS因子、Tn因子）,6、密码子水平,7、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位,（二）微生物基因组结构的特点,1、原核生物（细菌）的基因组,1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续性； 基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数 一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。 3）功能相关的结构基因组成操纵子结构； 4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝； 5）基因组的重复序列少而短；,2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组,1）典型的真核染色体结构；啤酒酵母基因组大小为13.5106bp，分布在16条染色体中。 2）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）或内含子序列； 4）重复序列多；,第一个完成基因组测序的真核生物基因组,2、古生菌（詹氏甲烷球菌）的基因组,第一个完成基因组测序的古生菌,只有40的基因与其他两界的生物有同源性古生菌的基因组在结构上类似于细菌 1.66x106bp的环状染色体DNA 1682个ORF(Open Reading Frame)3) 负责信息传递功能的基因（复制 、转录和翻译）则类似于真核生物,（三）转座因子,转座因子：细胞中能改变自身位置（例如从染色体或质粒转移到另一个位点，或者在两个复制子之间转移）的一段DNA序列。,插入序列（insertion sequence, IS),转座子（transposon, Tn),某些病毒（Mu噬菌体）,原核生物的转座因子：,转座的遗传学效应：,1）插入突变,2）产生染色体畸变,3）基因的移动和重排,质粒通常不含有细胞初级代谢的遗传信息，而含有关于次级代谢的遗传信息,质粒是独立存在于细菌染色体外或附加在染色体上的遗传物质。它由一共价闭合环DNA分子组成。,（四）染色体外的遗传因子质粒（Plasmid）,1、致育因子(fertility factor, F因子)又称F质粒，一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性）， 无F质粒的菌株称为F-菌株(相当于雌性)。F质粒整合到宿主细胞染色体上的菌株称为高频重组菌株（high frequence recombination, 简称Hfr)由于F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。,质粒的类型:,2、抗性因子(resistancefactor，R因子) 另一类普遍而重要的质粒，主要包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。带有抗药性因子的细菌有时对于几种抗生素或其它药物呈现抗性。例如R1质粒(94kb)可使宿主对下列五种药物具有抗性： 氯霉素(Cm)、链霉素(Sm)、磺胺(Su)、 氨苄青霉素(Ap)、卡那霉素(Km)。 并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于R1抗性质粒上。许多R质粒能使宿主细胞对许多金属离子呈现抗性，包括碲(Te6+)、砷(As3+)、汞(Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉(Cd2+)等。在肠道细菌中发现的R质粒，约有25是抗汞离子的，而铜绿假单胞菌中约占75。,3、细菌素质粒 Col质粒含有编码大肠菌素的基因 4、毒性质粒 具有编码毒素的基因5、降解质粒 携带有能降解某些物质的酶的基因 6、共生质粒 携带有与固氮有关的基因7、代谢型质粒 控制某一特殊代谢过程8、隐蔽质粒此类质粒不显示任何表型效应，只有通过物理的方法检测其存在,松弛型质粒（relaxed plasmid)：质粒在宿主中可以有10100个拷贝，也称为高拷贝数质粒。,严谨型质粒(stringent plasmid)：质粒在每个宿主细胞中只有14个拷贝，也叫低拷贝数质粒。,窄宿主范围质粒：质粒的复制起点较特异，只能在一种特定的宿主细胞中复制。,广宿主范围质粒：质粒的复制起点不太特异，可以在许多种细菌中复制。,质粒的特点：,1、不亲和性 可以共存于同一细胞中的不同质粒彼此是亲和的，而不能共存于同一细胞的质粒彼此不亲和，质粒的这种特性称为不亲和性。2、可消除性 3、能自我复制，稳定的遗传； 4、没有质粒的细菌不能自发的产生质粒,但可以通过转化、转导或接合作用的转移获得质粒； 5、质粒可以携带供体细胞的DNA转移。,质粒的功能：,2、可作为基因转移的载体。,1、质粒控制细菌的某一遗传性状；,第二节 基因突变和诱变育种,基因突变：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何可 遗传的改变。,基因突变,狭义：点突变（一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换）,野生型（原始性状）,基因突变,突变型（新性状）,广义：基因突变和染色体畸变（大片段染色体的缺失、重 复、倒位）,一、基因突变的定义,自发突变：在自然条件下发生的基因突变。,诱发突变：利用物理化学因子处理微生物使其产生的突变。,回复突变：突变菌株发生突变，回复到出发菌株的状态。,基因突变分为,二、基因突变的类型,同义突变：碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的变化。,错义突变：碱基序列的变化引起产物氨基酸的变化。,无义突变：碱基的改变使得密码子变为终止密码子。,移码突变：碱基的缺失或插入使翻译的阅读框发生改变， 从而使氨基酸序列完全变化。,不同的碱基变化对遗传信息的改变不同：,U,常见的微生物突变体类型：,1、营养缺陷型（auxotroph）,特点：,在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长,负选择标记,（突变株不能通过选择平板直接获得）,缺乏合成其生存所必需的营养物的突变型。,影印平板（Replica plating）法是Lederberg夫妇在1952年建立,2、抗药性突变型（resistant mutant),由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性的突变型。,3、条件致死突变型(conditional lethal mutant),在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。,4、形态突变型(morphological mutant),指造成形态改变的突变型。,5、其他突变型,1）自发性 2）不对应性 3）稀有性 4）规律性,三、基因突变的机制,5）独立性 6）可诱变性 7）遗传性 8）可逆性,1、基因突变的特点：,基因突变自发性和不对应性的实验证明：,三个经典实验变量实验涂布实验影印实验,证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。,野生型（原始性状）,特定环境,突变型（适应环境的新性状）,驯化,定向诱变,筛选,？,？,？,突变的原因,？,变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria and Max Delbruck（1943）,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,变量实验（fluctuation analysis）,Newcombe的涂布实验（1949）,影印实验（replica plating ）Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,Joshua Lederberg,J. Lederberg is awarded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 1958,影印培养,无药物培养基,含药物培养基,影印培养试验,原始敏感菌种,2、自发突变的机制,主要的原因是：碱基互变异构体的存在导致形成不同 的碱基配对。,腺嘌呤氨基式 AT配对,腺嘌呤亚氨基式 AC配对,碱基置换：碱基与碱基之间的交换导致突变的发生 转换：嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的碱基置换。 颠换：嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的碱基置换。,3、诱发突变的机制 （1）碱基的置换（转换、颠换）,（2）移码突变：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误,（3）染色体畸变：缺失、重复、插入、易位、倒位,A、碱基类似物,5溴尿嘧啶（胸腺嘧啶结构类似物）,4、诱变剂,B、嵌入诱变剂,C、与DNA碱基直接其化学反应的诱变剂,D、辐射和热,嘧啶,嘧啶二聚体,UV,四、DNA损伤的修复,1、光复活作用 (photoreactivation),嘧啶二聚体,嘧 啶,光解酶,2、切除修复(excision repair),3、重组修复（复制后修复 post replication repair）,4、SOS修复,DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应。,错误倾向的SOS修复,五、微生物诱变育种,诱变育种：指利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。,（1）使用简便有效的诱变剂,（2）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液,诱变剂,物理因素：紫外线、激光、离子束、X射线、射线等,化学因素：烷化剂、碱基类似物、吖啶化合物,（4）使用最佳的处理剂量,致死剂量：将微生物全部杀死的剂量亚致死剂量：将M大部分杀死，只留下很少的活菌体，如杀死99%以上，存活不到1%，或者杀死90%以上，存活在10%以下。弱致死剂量：杀死一大半，存活一小半，如杀死50-70%，存活30%-50%，诱变处理一般选用亚致死剂量。,处理剂量：是指处理因素对微生物的生物学效应 剂量 = 强度（浓度） 作用时间 相对剂量 = 杀菌率,（5）设计高效率筛选方案,诱变,检出营养缺陷型,淘汰野生型,鉴定营养缺陷型,富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）,影印平板法,生长谱法,突变株的筛选：产量突变株的筛选 抗药性突变株的筛选 营养缺陷型突变株的筛选(P152),第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组,基因重组：指两种不同来源的遗传物质通过交换和重新组合、形成新的基因型的的过程。通过基因重组所获得的后代具有特异的不同于亲本的新基因组合。,供体菌,受体菌,DNA片段,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力。,转化：指同源或异源的游离DNA分子（质粒和染色体DNA）被自然或人工感受态细胞提取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。这些被转化的游离的DNA片段称为转化因子 。转化后的受体菌，称为转化子（transformant）。,（一）转化（transformation),感受态细胞：受体菌最容易接受外源DNA片段并实现转化的 生理状态称为感受态。,进行转化，需要二方面必要的条件：,1、建立了感受态的受体细胞,2、外源游离DNA分子（转化因子）,自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌 自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA 的能力，或人为地将DNA导入细胞内,转化因子通常是双链DNA。,转化过程:,感受态的出现 转化因子的吸附与掺入 转化因子的整合,感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程,转染(transfection)：,转染的特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,人工转化：,用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,电穿孔法（electroporation):用高压脉冲电流击破细胞膜形成小孔，使各种大分子（包括DNA)能通过这些小孔进入细胞，所以又称电转化。,（二）转导（transduction）,转导：由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式 一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。,细菌转导的类型：,普遍转导,局限转导,完全转导流产转导,低频转导高频转导,转导噬菌体：能将细菌宿主的部分染色体和质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体。获得了由噬菌体携带来的供体菌DNA片段的受体细胞称为转导子。在转导中被转移的染色体片段称为转导因子。,普遍转导（generalized transduction）,噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分到受体细胞中,普遍性转导的三种后果：,外源DNA被降解，转导失败。,进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子,流产转导,完全转导：,转导DNA不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物。,流产转导：,局限转导：,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上,缺陷噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,缺陷噬菌体DNA分子在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的局限转导子。,低频转导：,低频转导裂解物,极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）,转导颗粒,局限转导子（极少量）,低感染复数,高频转导：,低频转导裂解物,正常噬菌体,极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）,转导颗粒,高感染复数,双重溶源菌,缺陷噬菌体和正常噬菌体同步复制,高频转导裂解物,部分缺陷噬菌（局限转导噬菌体）,正常噬菌体,等量,转导颗粒,局限转导子（大量）,局限转导与普遍转导的主要区别：,a）局限转导中被转导的基因与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。,（三）接合(conjugation),接合：通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。结合后的受体菌称为接合子（conjugant）。,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。,证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（ Bernard Davis，1950 ）,接合机制(大肠杆菌的接合机制),接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的40多个基因。,F因子为附加体质粒既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上,F因子的四种细胞形式：,a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因 子。 细胞表面同样有性菌毛。,“接合” “转化” 及“转导”这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：,外源DNA的来源及进入途径有差异,（四）原生质体融合,原生质体融合：将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内、及属间）融合成为一个新的重组子的技术。,原生质体融合步骤：,1、原生质体制备2、原生质体融合和再生3、融合子的选择,+,+,二、真核微生物的基因重组,能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交,杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。,（一）有性杂交,（二）准性杂交,准性生殖是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。它可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。在半知菌类中最为常见。,2、核配和杂合体细胞二倍体的形成,1、菌丝联合形成异核体,准性生殖的过程：,杂合二倍体只有相对的稳定性，在其繁殖过程中虽不进行减数分裂，但在有丝分裂中可以发生染色体交换和染色体单倍化，从而形成各种分离子。,3、体细胞交换和单倍体化,体细胞交换：有丝分裂过程中局部染色体片段交换的现象。单倍体化：指整条染色体在有丝分裂过程中由于染色体不分离而丢 失的现象。,第四节 微生物基因表达的调控,一、操纵子（operon)的转录调控,操纵子：一个或多个结构基因联接在一起，形成一个在结构和功 能上协同作用的整体，受同一个调节基因、操纵基因 (operator)和启动区（promoter)的调控。,1、负转录调控（negative transcription control),调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），阻遏蛋白可以与操纵区结合，起着阻止结构基因转录的作用。,2、正转录调控（positive transcription control),调节基因的产物是激活蛋白（activator ），激活蛋白与相应的激活结合位点结合，激活结构基因的转录。,1）负控诱导系统,a、没有诱导物存在时，阻遏蛋白与操纵区结合，阻止转录b、有诱导物存在时，阻遏蛋白与诱导物结合而不再和操纵区结 合，转录正常进行。,典型：大肠杆菌的乳糖操纵子,2）负控阻遏系统,a、没有辅阻遏物存在时，阻遏蛋白不与操纵区结合，转录进行b、有辅阻遏物存在时，与辅阻遏物结合的阻遏蛋白可以与操纵 区结合，转录被阻止。,典型：大肠杆菌的色氨酸操纵子,3）正控诱导系统,激活蛋白与诱导物结合后被活化，与激活结合位点结合，从而促进RNA聚合酶与启动子结合。,(b),典型：麦芽糖正控诱导系统,二、信号传导和双组分调节系统,细胞通过传感器检测到信号，然后将信号以变化的形式传到调节部位，这一过程称为信号传导（signal transduction）。,原核生物的信号传导机制: 双组分系统（two-component systems)。,传感蛋白（sensor protein）or 传感激酶(sensor kinase),应答调节蛋白（response regulator protein),1、传感激酶位于细胞膜中，接收 信号后，本身磷酸化。2、 传感激酶将磷酰基传递给反应 调控蛋白，从而使之活化。3、 被活化的反应调控蛋白调节相 应的基因的表达。4、 磷酯酶将磷酰基从反应调控蛋 白上移去，使之失活。,1,2,3,4,第五节 微生物与基因工程,一、基因工程,基因工程：在基因水平上，改造遗传物质，即将分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。,克隆载体（cloning vector）负责将外源DNA片段运送到细胞中进行复制与扩增。,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类核酸内切酶。,获得目的基因选择基因载体（质粒、病毒或噬菌体）体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物）筛选和鉴定应用,二、基因工程的基本操作,三、DNA的体外扩增,聚合酶链式反应（polymeiase chain reaction，PCR）： 这是一种在体外快速扩增特定DNA序列的技术。,引物（primer）：与目的DNA片段末端互补的寡核苷酸片段。TaqDNA聚合酶：从水生栖热菌（Thermus aquaticus)中分离得 到的耐热的DNA聚合酶。,基本反应：,1）变性（denaturation）加热，模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链 2）退火（annealing）温度降低，寡核苷酸引物与模板DNA配对 3）延伸（extension）在适宜条件下，引物3端向前延伸，合成与模板互补的DNA链,第六节 菌种的衰退、复壮和保藏,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异；b）污染； c）死亡。,一、菌种的衰退与复壮,纯菌种,自发突变,不纯菌种,突变个体,传代增殖,原始个体,衰退菌种,衰退：菌种出现或表现出负变性状,1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。,2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。,菌种的复壮：,二、防止衰退的措施1）减少传代次数；2）创造良好的培养条件；3）利用孢子或者芽胞传代4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；5）采用有效的菌种保藏方法；,三、菌种保藏,目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱， 以供研究、生产、交换之用,（1）斜面传代保藏：有些菌要定期传代，否则，容易死亡（2）干燥法 A沙土管法 保鲜细菌芽胞可用此法 B麸夫管法 保藏霉菌、放线菌孢子可用此方法,（3）冷冻法 A 冷冻干燥法 适于保鲜多种微生物，特别是细菌适用于此 法保藏 B 液N保鲜法（-196） 适于不生孢子的丝状真菌的保藏。 C -70低温保藏，需超低温冰箱。 （4） 悬液法 将微生物细胞悬浮在水、甘油、蔗糖液、葡萄糖液、盐 水、磷酸缓冲液中，某些细菌、酵母用此法可保藏几年至近十年。,